引用本文： 宋帅, 田地, 崔永, 高志, 王天佑, 胡健, 常栋. Stomatin 样蛋白2（SLP-2）抑制裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤生长的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2018, 25(10): 885-889. doi: 10.7507/1007-4848.201709036 复制
Stomatin 样蛋白 2（stomatin-like protein 2，SLP-2）是 stomatin 超家族成员，作为外周膜蛋白稳定存在于红细胞中，在 2000 年由 Wang 等[1]首次报道。Da Cruz 等[2]认为 SLP-2 也是一种线粒体蛋白，同时存在于质膜及线粒体内膜，与线粒体呼吸链功能有关，能够增加细胞抗凋亡能力。最近研究表明，SLP-2 在多种人类恶性肿瘤组织如食管鳞状细胞癌（鳞癌）[3]、子宫内膜癌[4]、喉鳞癌[5]、肺鳞癌[6]等高表达，提示其可能是一个新的癌症相关基因，参与肿瘤的发生、发展和转归。
我们前期对 SLP-2 在食管鳞癌中的作用进行了系列研究，发现 SLP-2 在食管鳞癌中差异性高表达[7]。利用 siRNA 抑制 SLP-2 表达能降低食管鳞癌细胞侵袭能力[8]。上述研究表明，SLP-2 表达上调可能参与食管鳞癌细胞的恶性行为。但目前这些研究均停留在体外细胞水平，SLP-2 对活体动物食管鳞癌的作用究竟如何尚不得而知。我们最近建立了一种新的食管鳞癌原位移植动物模型，可以半定量评估活体动物的肿瘤生长能力[9]。本研究采用 RNA 干扰技术，建立特异性抑制目的基因 SLP-2 表达的食管鳞癌细胞株，利用裸鼠食管鳞癌原位移植动物模型和活体成像技术，观察 SLP-2 表达降低后裸鼠体内原位移植肿瘤的生长变化，在活体动物模型中进一步研究 SLP-2 蛋白在食管鳞癌发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞培养
人食管鳞癌细胞系 KYSE30 细胞株由日本 Kyoto University 的 Shamida 博士惠赠。采用 LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司）试剂盒将 pLVX-Luciferase 质粒转染 KYSE30 细胞，形成稳定表达荧光素酶的 KYSE30-Luc 细胞株[9]，用于活体成像检查，并用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液于 37℃、5% CO2 恒温培养箱中培养。
1.1.2 实验动物
健康雌性裸鼠 40 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，8 周大小，体重 19～22 g，在无特定病原体（SPF）级环境饲养。我们的实验所有操作均符合国家及中国医学科学院肿瘤医院关于实验动物应用及管理的相关规定，并获得中国医学科学院肿瘤医院动物实验中心的批准。
1.1.3 引物的设计与合成
SLP-2 基因敲降序列由 Invitrogen 公司合成，选取 5 个 shRNA Target 序列；见表 1。对应引物序列见表 2。
表1
shRNATarget 序列
表2
合成的 SLP-2 基因敲降序列
1.2 实验方法
1.2.1 shRNA 表达载体的构建和鉴定
将合成的 SLP-2 基因敲降序列按照退火、连接、转化的步骤制作重组质粒，应用 Plus Minipreps DMA Purification System 试剂盒的操作说明提取和纯化质粒。将纯化后的质粒测序，选择序列正确的质粒用 HEK293T 细胞进行慢病毒包装，形成病毒质粒后转染稳定表达荧光素酶的 KYSE30-Luc 细胞株，应用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞株。Western blotting 实验检测转染细胞的 SLP-2 蛋白表达水平，选择稳定降低 SLP-2 表达的细胞株用于进一步动物实验。
1.2.2 裸鼠原位移植瘤模型的建立
将经鉴定低表达 SLP-2 的细胞进行培养，取对数生长期细胞，用胰酶消化后计数，用磷酸缓冲盐溶液（PBS 液）稀释成 1×107/L 浓度，用 1 ml 注射器在裸鼠右侧下腹部皮下建立皮下移植瘤模型，每只裸鼠注射 100 μl。待皮下移植的肿瘤生长到 0.5～0.8 cm 大小后，将皮下移植瘤裸鼠用 3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切除皮下肿瘤。用我们前期研究的方法建立裸鼠原位移植瘤模型[9]，隔日观察裸鼠的体重和生存情况。当某一只裸鼠开始出现体重减轻，一般情况差后，处死所有裸鼠。
1.2.3 活体成像检查
在处死原位移植瘤裸鼠前用活体成像仪（IVIS Lumina，Caliper Life Science，Hopkinton，MA，USA）检测肿瘤的荧光素酶值（ROI），其高低能反映肿瘤生长情况，从而比较 SLP-2 表达降低对原位移植肿瘤生长的影响。
1.2.4 病理学检查
处死动物后，将原发肿瘤切除送病理学检查。标本组织经 4% 多聚甲醛固定，常规脱水透明、浸蜡、石蜡包埋，切成厚度为 4 μm 的切片，烤片器 60℃ 烘烤 4 h，用于标准 HE 染色。病理标本由两位资深病理医师单独在显微镜下进行观察，判断肿瘤的浸润情况。
1.3 统计学分析
所有计量资料以均数±标准差（
）表示，是否符合正态分布采用 Kolmogorov-Smirnov 检验，符合正态分布者比较用 t 检验，非正态分布者比较用非参数检验。所有数据均采用 SPSS13.0 统计软件进行统计处理。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blotting 检测敲浆 SLP-2 表达的结果
双酶切鉴定电泳位置正确的质粒测序结果提示 SLP-2-1、SLP-2-2、SLP-2-3 和 SLP-2-5 四条构建质粒序列正常。将上述四种质粒用慢病毒包装成病毒颗粒后感染 KYSE30-Luc 细胞。将经过嘌呤霉素选择得到的克隆扩增培养后，提取总蛋白行 Western blotting 检测。结果显示，与未做处理的亲本 KYSE30-Luc 细胞比较，SLP-2-1 质粒和 SLP-2-2 质粒感染的细胞 SLP-2 表达水平明显降低，而空载质粒（SHGFP）感染的细胞 SLP-2 表达水平无明显变化（图 1），表明低表达 SLP-2 的 KYSE30-Luc 细胞系构建成功。分别选取 SLP-2-1 质粒、SLP-2-2 质粒和 SHGFP 感染的细胞建立裸鼠原位移植瘤模型。
图1
Western blotting 检测 SLP-2 蛋白表达
2.2 活体成像检测原位移植肿瘤的结果
将裸鼠原位移植瘤模型分为 3 组，组 1 为 SLP-2-1 质粒感染的细胞，组 2 为 SLP-2-2 质粒感染的细胞，组 3 为 SHGFP 感染的细胞。每组 12 只裸鼠，6 只用于建立皮下移植瘤，另 6 只用于建立原位移植瘤模型。实验动物中 1 只裸鼠在术后第 6 周出现体重减轻、活动能力差，因此实验的时间终点为第 6 周。处死动物前行活体成像检测原位移植肿瘤 ROI（表 3）。结果显示，组 1 与组 2 的 ROI 差异无统计学意义（P=0.943），表明两组肿瘤的生长无明显差异。但组 1 和组 2 的 ROI 均明显低于组 3（P=0.002、0.000），提示 SLP-2 表达水平降低后，原位移植肿瘤的生长明显下降。
表3
活体成像检测结果（
）
2.3 病理学检查
处死动物后将原位移植肿瘤送病理学检查。结果显示，组 1（图 2a）、组 2（图 2b）和组 3（图 2c）移植肿瘤均有侵袭浸润至食管肌层的表现。
图2
病理切片显示移植肿瘤均有侵袭浸润至食管肌层的表现（×400）
a：组 1；b：组 2；c：组 3
3 讨论
恶性肿瘤的发生、发展是多阶段的渐进过程，众多基因参与其中。SLP-2 基因属于 stomatin 基因超家族中的一员，研究发现 SLP-2 在子宫内膜癌[4]、喉鳞癌[5]、肺鳞癌[6]、上皮性卵巢癌[10]、宫颈癌[11]、甲状腺乳头状癌[12]、胃腺癌[13]等人类多种恶性肿瘤中表达升高，参与肿瘤的分期，SLP-2 高表达者肿瘤无进展生存期及总生存期均明显缩短。正常食管黏膜中 SLP-2 呈阴性表达，在肿瘤从轻度不典型增生发展到鳞癌的过程中，其表达水平逐渐升高[14]，提示 SLP-2 过表达是食管鳞癌发生、发展过程中的早期事件。SLP-2 表达水平还与食管鳞癌的浸润深度相关[15]，降低 SLP-2 表达后食管鳞癌细胞出现了生长速度受抑制、克隆形成率降低和粘附能力下降的表现[3, 14]。此外，降低 SLP-2 表达还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的反应[16]。
本实验在前期研究的基础上，选用 SLP-2 高表达的食管鳞癌细胞株 KYSE30，转染 pLVX-Luciferase 质粒使其稳定表达荧光素酶，并采用 RNA 干扰技术对 SLP-2 mRNA 进行降解降低其表达水平，观察 SLP-2 表达降低对裸鼠原位移植瘤生长的影响，在体内环境中进一步验证 SLP-2 蛋白在食管鳞癌发生发展中的作用。与常用的皮下移植瘤模型比较，原位移植瘤模型的肿瘤与人食管鳞癌的生长环境更为接近，且不容易形成坏死后液化，结果更有说服力。既往观察肿瘤生长多通过比较不同处理组间肿瘤的大小作为量化方法，但随着肿瘤的快速生长，肿瘤容易因血供不足导致坏死。本研究采用活体成像技术，通过检测肿瘤细胞的 ROI 值反映细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置，在测量肿瘤大小方面更为精确。我们的结果显示，SLP-2 表达降低的两种 KYSE30 细胞株形成的原位肿瘤 ROI 值明显下降，表明 SLP-2 蛋白表达下降后肿瘤细胞生长明显减慢，提示降低 SLP-2 表达可以抑制食管鳞癌的生长，证实 SLP-2 参与食管鳞癌的发生、发展过程。
我们对 SLP-2 低表达组和对照组的原位生长肿瘤均作了病理学检查，尽管既往研究显示 SLP-2 的高表达与食管鳞癌的浸润深度相关，且体外研究显示降低 SLP-2 表达后食管鳞癌细胞的侵袭能力下降[15]，但在我们的研究中，SLP-2 正常表达组及表达下降组均发生了肿瘤的浸润性生长，其浸润深度亦无明显差别，提示除了 SLP-2 基因外，可能还有其他基因（包括 SLP-2 下游信号通路基因）参与调控癌细胞的生长，恶性肿瘤的侵袭除了细胞增殖（生长）外，尚有更为复杂的调控因素。此外我们的研究在其中 1 只原位移植瘤裸鼠出现体重减轻、活动能力差时作为实验的时间终点，与上述研究中的观察对象为临床食管癌患者仍有一定的区别。总之，SLP-2 的表达水平与食管鳞癌的生长密切相关，除 SLP-2 外还有哪些分子机制参与食管鳞癌侵袭转移还有待进一步研究。
Stomatin 样蛋白 2（stomatin-like protein 2，SLP-2）是 stomatin 超家族成员，作为外周膜蛋白稳定存在于红细胞中，在 2000 年由 Wang 等[1]首次报道。Da Cruz 等[2]认为 SLP-2 也是一种线粒体蛋白，同时存在于质膜及线粒体内膜，与线粒体呼吸链功能有关，能够增加细胞抗凋亡能力。最近研究表明，SLP-2 在多种人类恶性肿瘤组织如食管鳞状细胞癌（鳞癌）[3]、子宫内膜癌[4]、喉鳞癌[5]、肺鳞癌[6]等高表达，提示其可能是一个新的癌症相关基因，参与肿瘤的发生、发展和转归。
我们前期对 SLP-2 在食管鳞癌中的作用进行了系列研究，发现 SLP-2 在食管鳞癌中差异性高表达[7]。利用 siRNA 抑制 SLP-2 表达能降低食管鳞癌细胞侵袭能力[8]。上述研究表明，SLP-2 表达上调可能参与食管鳞癌细胞的恶性行为。但目前这些研究均停留在体外细胞水平，SLP-2 对活体动物食管鳞癌的作用究竟如何尚不得而知。我们最近建立了一种新的食管鳞癌原位移植动物模型，可以半定量评估活体动物的肿瘤生长能力[9]。本研究采用 RNA 干扰技术，建立特异性抑制目的基因 SLP-2 表达的食管鳞癌细胞株，利用裸鼠食管鳞癌原位移植动物模型和活体成像技术，观察 SLP-2 表达降低后裸鼠体内原位移植肿瘤的生长变化，在活体动物模型中进一步研究 SLP-2 蛋白在食管鳞癌发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 细胞培养
人食管鳞癌细胞系 KYSE30 细胞株由日本 Kyoto University 的 Shamida 博士惠赠。采用 LipofectamineTM 2000（Invitrogen 公司）试剂盒将 pLVX-Luciferase 质粒转染 KYSE30 细胞，形成稳定表达荧光素酶的 KYSE30-Luc 细胞株[9]，用于活体成像检查，并用含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液于 37℃、5% CO2 恒温培养箱中培养。
1.1.2 实验动物
健康雌性裸鼠 40 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，8 周大小，体重 19～22 g，在无特定病原体（SPF）级环境饲养。我们的实验所有操作均符合国家及中国医学科学院肿瘤医院关于实验动物应用及管理的相关规定，并获得中国医学科学院肿瘤医院动物实验中心的批准。
1.1.3 引物的设计与合成
SLP-2 基因敲降序列由 Invitrogen 公司合成，选取 5 个 shRNA Target 序列；见表 1。对应引物序列见表 2。
表1
shRNATarget 序列
表2
合成的 SLP-2 基因敲降序列
1.2 实验方法
1.2.1 shRNA 表达载体的构建和鉴定
将合成的 SLP-2 基因敲降序列按照退火、连接、转化的步骤制作重组质粒，应用 Plus Minipreps DMA Purification System 试剂盒的操作说明提取和纯化质粒。将纯化后的质粒测序，选择序列正确的质粒用 HEK293T 细胞进行慢病毒包装，形成病毒质粒后转染稳定表达荧光素酶的 KYSE30-Luc 细胞株，应用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞株。Western blotting 实验检测转染细胞的 SLP-2 蛋白表达水平，选择稳定降低 SLP-2 表达的细胞株用于进一步动物实验。
1.2.2 裸鼠原位移植瘤模型的建立
将经鉴定低表达 SLP-2 的细胞进行培养，取对数生长期细胞，用胰酶消化后计数，用磷酸缓冲盐溶液（PBS 液）稀释成 1×107/L 浓度，用 1 ml 注射器在裸鼠右侧下腹部皮下建立皮下移植瘤模型，每只裸鼠注射 100 μl。待皮下移植的肿瘤生长到 0.5～0.8 cm 大小后，将皮下移植瘤裸鼠用 3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，切除皮下肿瘤。用我们前期研究的方法建立裸鼠原位移植瘤模型[9]，隔日观察裸鼠的体重和生存情况。当某一只裸鼠开始出现体重减轻，一般情况差后，处死所有裸鼠。
1.2.3 活体成像检查
在处死原位移植瘤裸鼠前用活体成像仪（IVIS Lumina，Caliper Life Science，Hopkinton，MA，USA）检测肿瘤的荧光素酶值（ROI），其高低能反映肿瘤生长情况，从而比较 SLP-2 表达降低对原位移植肿瘤生长的影响。
1.2.4 病理学检查
处死动物后，将原发肿瘤切除送病理学检查。标本组织经 4% 多聚甲醛固定，常规脱水透明、浸蜡、石蜡包埋，切成厚度为 4 μm 的切片，烤片器 60℃ 烘烤 4 h，用于标准 HE 染色。病理标本由两位资深病理医师单独在显微镜下进行观察，判断肿瘤的浸润情况。
1.3 统计学分析
所有计量资料以均数±标准差（
）表示，是否符合正态分布采用 Kolmogorov-Smirnov 检验，符合正态分布者比较用 t 检验，非正态分布者比较用非参数检验。所有数据均采用 SPSS13.0 统计软件进行统计处理。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Western blotting 检测敲浆 SLP-2 表达的结果
双酶切鉴定电泳位置正确的质粒测序结果提示 SLP-2-1、SLP-2-2、SLP-2-3 和 SLP-2-5 四条构建质粒序列正常。将上述四种质粒用慢病毒包装成病毒颗粒后感染 KYSE30-Luc 细胞。将经过嘌呤霉素选择得到的克隆扩增培养后，提取总蛋白行 Western blotting 检测。结果显示，与未做处理的亲本 KYSE30-Luc 细胞比较，SLP-2-1 质粒和 SLP-2-2 质粒感染的细胞 SLP-2 表达水平明显降低，而空载质粒（SHGFP）感染的细胞 SLP-2 表达水平无明显变化（图 1），表明低表达 SLP-2 的 KYSE30-Luc 细胞系构建成功。分别选取 SLP-2-1 质粒、SLP-2-2 质粒和 SHGFP 感染的细胞建立裸鼠原位移植瘤模型。
图1
Western blotting 检测 SLP-2 蛋白表达
2.2 活体成像检测原位移植肿瘤的结果
将裸鼠原位移植瘤模型分为 3 组，组 1 为 SLP-2-1 质粒感染的细胞，组 2 为 SLP-2-2 质粒感染的细胞，组 3 为 SHGFP 感染的细胞。每组 12 只裸鼠，6 只用于建立皮下移植瘤，另 6 只用于建立原位移植瘤模型。实验动物中 1 只裸鼠在术后第 6 周出现体重减轻、活动能力差，因此实验的时间终点为第 6 周。处死动物前行活体成像检测原位移植肿瘤 ROI（表 3）。结果显示，组 1 与组 2 的 ROI 差异无统计学意义（P=0.943），表明两组肿瘤的生长无明显差异。但组 1 和组 2 的 ROI 均明显低于组 3（P=0.002、0.000），提示 SLP-2 表达水平降低后，原位移植肿瘤的生长明显下降。
表3
活体成像检测结果（
）
2.3 病理学检查
处死动物后将原位移植肿瘤送病理学检查。结果显示，组 1（图 2a）、组 2（图 2b）和组 3（图 2c）移植肿瘤均有侵袭浸润至食管肌层的表现。
图2
病理切片显示移植肿瘤均有侵袭浸润至食管肌层的表现（×400）
a：组 1；b：组 2；c：组 3
3 讨论
恶性肿瘤的发生、发展是多阶段的渐进过程，众多基因参与其中。SLP-2 基因属于 stomatin 基因超家族中的一员，研究发现 SLP-2 在子宫内膜癌[4]、喉鳞癌[5]、肺鳞癌[6]、上皮性卵巢癌[10]、宫颈癌[11]、甲状腺乳头状癌[12]、胃腺癌[13]等人类多种恶性肿瘤中表达升高，参与肿瘤的分期，SLP-2 高表达者肿瘤无进展生存期及总生存期均明显缩短。正常食管黏膜中 SLP-2 呈阴性表达，在肿瘤从轻度不典型增生发展到鳞癌的过程中，其表达水平逐渐升高[14]，提示 SLP-2 过表达是食管鳞癌发生、发展过程中的早期事件。SLP-2 表达水平还与食管鳞癌的浸润深度相关[15]，降低 SLP-2 表达后食管鳞癌细胞出现了生长速度受抑制、克隆形成率降低和粘附能力下降的表现[3, 14]。此外，降低 SLP-2 表达还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的反应[16]。
本实验在前期研究的基础上，选用 SLP-2 高表达的食管鳞癌细胞株 KYSE30，转染 pLVX-Luciferase 质粒使其稳定表达荧光素酶，并采用 RNA 干扰技术对 SLP-2 mRNA 进行降解降低其表达水平，观察 SLP-2 表达降低对裸鼠原位移植瘤生长的影响，在体内环境中进一步验证 SLP-2 蛋白在食管鳞癌发生发展中的作用。与常用的皮下移植瘤模型比较，原位移植瘤模型的肿瘤与人食管鳞癌的生长环境更为接近，且不容易形成坏死后液化，结果更有说服力。既往观察肿瘤生长多通过比较不同处理组间肿瘤的大小作为量化方法，但随着肿瘤的快速生长，肿瘤容易因血供不足导致坏死。本研究采用活体成像技术，通过检测肿瘤细胞的 ROI 值反映细胞的数量、肿瘤的大小和肿瘤转移位置，在测量肿瘤大小方面更为精确。我们的结果显示，SLP-2 表达降低的两种 KYSE30 细胞株形成的原位肿瘤 ROI 值明显下降，表明 SLP-2 蛋白表达下降后肿瘤细胞生长明显减慢，提示降低 SLP-2 表达可以抑制食管鳞癌的生长，证实 SLP-2 参与食管鳞癌的发生、发展过程。
我们对 SLP-2 低表达组和对照组的原位生长肿瘤均作了病理学检查，尽管既往研究显示 SLP-2 的高表达与食管鳞癌的浸润深度相关，且体外研究显示降低 SLP-2 表达后食管鳞癌细胞的侵袭能力下降[15]，但在我们的研究中，SLP-2 正常表达组及表达下降组均发生了肿瘤的浸润性生长，其浸润深度亦无明显差别，提示除了 SLP-2 基因外，可能还有其他基因（包括 SLP-2 下游信号通路基因）参与调控癌细胞的生长，恶性肿瘤的侵袭除了细胞增殖（生长）外，尚有更为复杂的调控因素。此外我们的研究在其中 1 只原位移植瘤裸鼠出现体重减轻、活动能力差时作为实验的时间终点，与上述研究中的观察对象为临床食管癌患者仍有一定的区别。总之，SLP-2 的表达水平与食管鳞癌的生长密切相关，除 SLP-2 外还有哪些分子机制参与食管鳞癌侵袭转移还有待进一步研究。
