引用本文： 田琨, 穆军升, 伯平. 低氧三维培养微环境通过 HIF-1α 信号通路促进骨髓间充质干细胞增殖机制的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2019, 26(4): 385-389. doi: 10.7507/1007-4848.201809010 复制
心肌梗死后，心肌细胞无法再生，心肌细胞的数量绝对减少，患者的心脏功能将会不可逆性受损，心力衰竭成为其近远期无法避免的结局。长期以来，临床上对此类患者的治疗手段极其有限。令人欣慰的是，随着对干细胞及其临床应用研究的不断深入似乎让人们看到了曙光。干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞，具有自我复制及在特定微环境下向多种类型细胞分化的能力，可在体外培养、扩增和维持在未分化状态[1]。干细胞的这些特性是人们试图通过干细胞移植来改善病变心脏功能的基础。早在十几年前，就有学者[2-3]试图通过向心脏的梗死区移植干细胞的方法来修复受损的心肌，以期改善患者的心脏功能。
以往的众多研究证实了该方法的有效性，但是依然存在很多问题。梗死区干细胞注射的传统移植方式，虽然操作相对简单，成本较低，但是移植后往往细胞流失严重且增殖缓慢，大大地影响了后期治疗效果。我们的前期研究中将聚-3 羟基丁酸酯-co-4 羟基丁酸酯［poly 3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，P（3HB-co-4HB）］作为三维细胞载体，为细胞提供三维的黏附、生长的微环境，发现其能促进细胞的黏附和增殖分化[4-7]。心肌梗死发生后，梗死区域细胞将处于低氧微环境中。本实验研究低氧三维培养条件对骨髓间充质干细胞黏附、存活和增殖产生的影响及影响机制。
1 材料及方法
1.1 主要材料
3 周龄昆明鼠来自安贞医院动物房。该实验经首都医科大学附属北京安贞医院医学伦理委员会审批（伦理审批编号：2018060X）。实验材料包括胎牛血清（Gibco，美国），青链霉素双抗（上海翊圣，中国），胰酶-EDTA（上海翊圣，中国），低糖 DMEM 培养基（Hyclone，美国），PBS 缓冲液（Gibco，美国），P（3HB-co-4HB）材料（清华大学化工系高分子研究所实验室提供），HIF-1α 抗体（Immunoway，美国），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（天德悦，中国），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP（天德悦，中国），β-actin 鼠单抗（Immunoway，美国），离心管（Corning，美国），细胞培养瓶（Corning，美国），缺氧袋（三菱，日本），CCK-8 试剂（上海翊圣，中国），Trizol 试剂（天根生化，中国），PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，中国），SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus（TaKaRa，日本），DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本），引物合成（Invitrogen，美国）。
1.2 主要仪器
主要使用的仪器包括高速控温离心机（Thermo Fisher，美国），二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher，美国），离心机（Thermo Fisher，美国），倒置相差显微镜（Leica，德国），缺氧箱（三菱，日本），恒温水浴锅，全光谱酶标仪（Thermo Fisher，美国），低温冰箱（Thermo，美国），Mini P-4 电泳槽（Cavoy，中国），湿转电泳槽（Cavoy，中国），电泳仪（Bio-Rad，美国），涡旋振荡仪（其林贝尔，中国），凝胶成像系统（上海天能科技，中国），荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠骨髓间充质干细胞的提取
3 周龄昆明鼠，断颈处死后，酒精浸泡 15 min，然后用无菌解剖剪和解剖镊取出小鼠股骨，LG-DMEM 培养基冲洗骨髓腔，并用无菌尼龙网过滤，1 000 r/min 离心 5 min，弃掉上清液后用完全 LG-DMEM 培养基重悬细胞，然后接种于 25T 培养瓶中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中，72 h 后更换培养基，以后每 2 d 换液，以除去非贴壁的造血系细胞和其他细胞，直到细胞形态趋于一致后进行鉴定。
1.3.2 CCK-8 法测定低氧对干细胞增殖的影响
在培养的第 24 h，各组分别随机选取 12 个孔，吸去培养基，每孔加入含 10% CCK-8 试剂的 DMEM 完全培养基，在培养箱中孵育 2 h，然后用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度值。
1.3.3 实时定量 PCR 检测 HIF-1α 基因表达情况
培养 12 h 后，用 Trizol 试剂提取样品总 RNA（实验操作按产品说明书进行）。紫外吸收测定法检测浓度和纯度，RNA 溶液的 A260/A280 的比值范围应在 1.8～2.1 之间。变性琼脂糖凝胶电泳并在紫外透射光下观察并拍照。采用 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser 进行 cDNA 反转录（实验操作按产品说明书进行），内参选用 GADPH，将 cDNA 样品加入实时定量 PCR 反应体系中进行反应，扩增程序如下：95℃，30 s；40 个 PCR 循环［95℃，5 s；60℃，40 s（收集荧光）］。为了建立 PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s 进行产物分析，并收集荧光信号；并从 60℃ 缓慢加热到 99℃（仪器自动进行-Ramp Rate 为 0.05℃/s）。检测结果按照 2−△△ct 方法进行相对定量计算。引物序列如下：HIF-1α forward 5’-AAGGACAAGTCACCACAGGACA-3’reverse 5’-AGGGAGAAAATCAAGTCGTGCT-3’GAPDH forward 5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAG-3’GAPDH reverse 5’ACATACTCAGCACCGGCCTC-3’。
1.4 统计学分析
实验数据采用 SPSS20.0 软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用独立样本 t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓间充质干细胞光镜照片
P5 代骨髓间充质干细胞散在分布，呈三角形、星形、梭形或多角形，不规则形，绝大部分贴壁细胞，生长较快；见图 1。
图1
骨髓间充质干细胞（×100）
2.2 CCK-8 法测定干细胞的增殖情况
在开始培养时，两组的 OD 值是相等的，均为为 0.23。经过 24 h 的培养，低氧组的 OD 值已经明显大于常氧组（0.455±0.027 vs. 0.352±0.090，n=12，P=0.01）；见图 2。
图2
两组的 OD 值变化
2.3 实时定量 PCR 检测 HIF-1α 基因表达
检测结果使用 2-△△ct方法进行相对定量计算，并且进行统计学检验，低氧培养 12 h 后，低氧组的 HIF-1α mRNA 表达水平显著高于常氧组（P<0.05）；见图 3。
图3
低氧培养 12 h 后，两组 HIF-1α mRNA 表达水平
2.4 Western blotting 检测 HIF-1α 的表达
将胶片进行灰度分析并进行统计学分析得出结果：同常氧组比较，低氧组 HIF-1α 蛋白相对表达水平显著增高（0.47±0.05 vs. 0.63±0.06，n=3，P<0.05）；见图 4。
图4
两组 HIF-1α 表达
3 讨论
伴随着我国经济、社会的高速发展，全国疾病谱也悄然发生了翻天覆地的变化。几十年间，心血管系统疾病早已替代感染性疾病，成为威胁我国人民健康的头号杀手。其中缺血性心脏病，由于其发病快，病情重，预后差，死亡率极高，严重威胁人们的生命健康，心肌细胞无法再生的特点使得心肌梗死患者心脏功能的破坏具有不可逆性。干细胞移植技术的发展似乎带给人们新的希望。Strauer 等[8]在患者发生心肌梗死 6 d 后，将患者的自体干细胞输注到与梗死相关的动脉（“罪犯”血管）中。通过单光子发射计算机断层成像术（SPECT），在休息和运动时测量左心室功能，梗死面积，心室几何形状和心肌灌注，同时进行多靶点分析，多巴酚丁胺负荷超声心动图，右心导管检查和放射性核素心室检查。结果显示干细胞移植 10 周后，左心室周围的透壁梗死面积从 24.6%降至 15.7%，射血分数、心脏指数和每搏输出量增加了 20%～30%。Stamm 在冠状动脉旁路移植术（CABG）期间将其自体骨髓干细胞注射到梗死边界区。12 例接受注射的患者都没有发生心律失常或成瘤的严重并发症，随后的闪烁照相显示注射干细胞的梗死区比没有注射干细胞的梗死区的灌注情况得到了显著改善[8-11]。这些结果证明，干细胞移植治疗心脏疾病是可行的，可使得心肌梗死后的瘢痕面积缩小，改善心室功能。
虽然干细胞移植术治疗心肌梗死取得了一些成就，但是由于以往的研究多以直接梗死区注射的方式进行，远期来看，细胞往往流失严重，治疗效果不尽人意。所以就需要用载体材料来为干细胞提供物理支撑使细胞可以黏附其上，以期达到降低流失率的效果。补片材料是能够模仿细胞外基质的特异性三维排列结构，为种子细胞提供生存和增殖的环境，补片材料要有良好的生物相容性、可降解性以及生物安全性，从而减少细胞移植过程中细胞的流失，因此支架材料的选择是心肌补片的重要环节之一。前期有运用聚氨酯（polyurethane，PU）、聚碳酸亚丙酯（poly propylene carbonate）等材料的报道，但由于毒性、可塑性、难以降解等种种问题而不能进一步应用于研究，且目前的载体材料大多无法给细胞提供近似体内的三维生长微环境，往往移植细胞流失严重，因此一种既能为细胞提供生长的三维空间又能有效防止细胞流失的载体材料对于移植成功来说是十分重要的。近年来 P（3HB-co-4HB）引起了人们的注意，其全称为聚-3 羟基丁酸酯-co-4 羟基丁酸酯，是一种新型生物相容材料，具有良好的可塑性及延展性，在体内外条件下降解终产物为无毒的二氧化碳和水，利用现在工业技术可加工成三维支撑材料，为细胞提供三维物理性支撑，且具有良好的生物相容性，在医学领域具有巨大潜力[12-14]。我们的前期实验工作表明：P（3HB-co-4HB）具有很好的生物相容性、韧性和加工性；在作为种植干细胞的载体，制作心肌补片的相关实验研究中，干细胞种植于补片能促进干细胞的黏附存留和增殖分化，形成心肌补片，改善梗死心肌。
心肌梗死发生后，梗死区域细胞将处于低氧微环境中。有研究显示低氧环境下心肌细分化相关基因和蛋白质的表达显著增加。Correia 等[15]研究了不同溶解氧对鼠 iPSC 向心肌分化的影响。发现与常氧（20% O2 张力）相比，缺氧培养（4% O2 张力）导致心肌细胞的分化数量提高约 1 000 倍。表现出典型的心肌肌节结构，钙瞬变，电生理学特征和药物反应性。缺氧在发育过程中心血管系统的增殖，分化和维持中起着重要的作用。缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在分子水平上对低氧信号的处理起着重要的作用。Ng 等[16]在研究中证明了外源性 HIF-1α cDNA 在小鼠胚胎干细胞中的表达显著促进了心肌细胞的形成，表现为较高比例的跳动胚状体和肌钙蛋白-T 阳性细胞计数以及早期和晚期心脏标志物的表达增加，如 GATA 结合蛋白 4 和 6，NK2 转录因子相关基因座 5，α-肌球蛋白重链，β-肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链都明显增加。另外，转导的细胞显示心肌营养素-1 和血管内皮生长因子的 mRNA 水平增加以及 eNOS 的磷酸化［p-eNOS（ser1171）］。应用 NOS 抑制剂二苯基碘鎓氯化物（DPI），Nω-硝基-1-精氨酸甲酯盐酸盐（l-NAME）或 Nω-硝基-1-精氨酸（l-NNA）消除了 HIF-1α 诱导的心肌分化。说明了 HIF-1 途径的激活促进了胚胎干细胞向心肌细胞的分化与成熟[15-17]。
我们的实验结果表明：在低氧三维培养条件下，低氧组的细胞增殖程度（OD=0.455±0.027）明显大于常氧组（OD=0.352±0.090，n=12，P=0.01）。低氧组的 HIF-1α mRNA 表达水平在 12 h 后显著高于常氧组（P<0.05）。24 h 后 Western blotting 检测到 HIF-1α 蛋白表达增加。所以我们认为，低氧三维培养微环境促进骨髓间充质干细胞增殖，这一效应可能与 HIF-1α 信号通路的激活有关。
心肌梗死后，心肌细胞无法再生，心肌细胞的数量绝对减少，患者的心脏功能将会不可逆性受损，心力衰竭成为其近远期无法避免的结局。长期以来，临床上对此类患者的治疗手段极其有限。令人欣慰的是，随着对干细胞及其临床应用研究的不断深入似乎让人们看到了曙光。干细胞是一类未分化的细胞或原始细胞，具有自我复制及在特定微环境下向多种类型细胞分化的能力，可在体外培养、扩增和维持在未分化状态[1]。干细胞的这些特性是人们试图通过干细胞移植来改善病变心脏功能的基础。早在十几年前，就有学者[2-3]试图通过向心脏的梗死区移植干细胞的方法来修复受损的心肌，以期改善患者的心脏功能。
以往的众多研究证实了该方法的有效性，但是依然存在很多问题。梗死区干细胞注射的传统移植方式，虽然操作相对简单，成本较低，但是移植后往往细胞流失严重且增殖缓慢，大大地影响了后期治疗效果。我们的前期研究中将聚-3 羟基丁酸酯-co-4 羟基丁酸酯［poly 3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate，P（3HB-co-4HB）］作为三维细胞载体，为细胞提供三维的黏附、生长的微环境，发现其能促进细胞的黏附和增殖分化[4-7]。心肌梗死发生后，梗死区域细胞将处于低氧微环境中。本实验研究低氧三维培养条件对骨髓间充质干细胞黏附、存活和增殖产生的影响及影响机制。
1 材料及方法
1.1 主要材料
3 周龄昆明鼠来自安贞医院动物房。该实验经首都医科大学附属北京安贞医院医学伦理委员会审批（伦理审批编号：2018060X）。实验材料包括胎牛血清（Gibco，美国），青链霉素双抗（上海翊圣，中国），胰酶-EDTA（上海翊圣，中国），低糖 DMEM 培养基（Hyclone，美国），PBS 缓冲液（Gibco，美国），P（3HB-co-4HB）材料（清华大学化工系高分子研究所实验室提供），HIF-1α 抗体（Immunoway，美国），山羊抗兔 IgG（H+L）HRP（天德悦，中国），山羊抗小鼠 IgG（H+L）HRP（天德悦，中国），β-actin 鼠单抗（Immunoway，美国），离心管（Corning，美国），细胞培养瓶（Corning，美国），缺氧袋（三菱，日本），CCK-8 试剂（上海翊圣，中国），Trizol 试剂（天根生化，中国），PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，中国），SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus（TaKaRa，日本），DL2，000 DNA Marker（TaKaRa，日本），引物合成（Invitrogen，美国）。
1.2 主要仪器
主要使用的仪器包括高速控温离心机（Thermo Fisher，美国），二氧化碳细胞培养箱（Thermo Fisher，美国），离心机（Thermo Fisher，美国），倒置相差显微镜（Leica，德国），缺氧箱（三菱，日本），恒温水浴锅，全光谱酶标仪（Thermo Fisher，美国），低温冰箱（Thermo，美国），Mini P-4 电泳槽（Cavoy，中国），湿转电泳槽（Cavoy，中国），电泳仪（Bio-Rad，美国），涡旋振荡仪（其林贝尔，中国），凝胶成像系统（上海天能科技，中国），荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠骨髓间充质干细胞的提取
3 周龄昆明鼠，断颈处死后，酒精浸泡 15 min，然后用无菌解剖剪和解剖镊取出小鼠股骨，LG-DMEM 培养基冲洗骨髓腔，并用无菌尼龙网过滤，1 000 r/min 离心 5 min，弃掉上清液后用完全 LG-DMEM 培养基重悬细胞，然后接种于 25T 培养瓶中，置于 37℃、5% CO2 培养箱中，72 h 后更换培养基，以后每 2 d 换液，以除去非贴壁的造血系细胞和其他细胞，直到细胞形态趋于一致后进行鉴定。
1.3.2 CCK-8 法测定低氧对干细胞增殖的影响
在培养的第 24 h，各组分别随机选取 12 个孔，吸去培养基，每孔加入含 10% CCK-8 试剂的 DMEM 完全培养基，在培养箱中孵育 2 h，然后用酶标仪测定 450 nm 处的吸光度值。
1.3.3 实时定量 PCR 检测 HIF-1α 基因表达情况
培养 12 h 后，用 Trizol 试剂提取样品总 RNA（实验操作按产品说明书进行）。紫外吸收测定法检测浓度和纯度，RNA 溶液的 A260/A280 的比值范围应在 1.8～2.1 之间。变性琼脂糖凝胶电泳并在紫外透射光下观察并拍照。采用 PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser 进行 cDNA 反转录（实验操作按产品说明书进行），内参选用 GADPH，将 cDNA 样品加入实时定量 PCR 反应体系中进行反应，扩增程序如下：95℃，30 s；40 个 PCR 循环［95℃，5 s；60℃，40 s（收集荧光）］。为了建立 PCR 产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按 95℃，10 s；60℃，60 s；95℃，15 s 进行产物分析，并收集荧光信号；并从 60℃ 缓慢加热到 99℃（仪器自动进行-Ramp Rate 为 0.05℃/s）。检测结果按照 2−△△ct 方法进行相对定量计算。引物序列如下：HIF-1α forward 5’-AAGGACAAGTCACCACAGGACA-3’reverse 5’-AGGGAGAAAATCAAGTCGTGCT-3’GAPDH forward 5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAG-3’GAPDH reverse 5’ACATACTCAGCACCGGCCTC-3’。
1.4 统计学分析
实验数据采用 SPSS20.0 软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本 t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 骨髓间充质干细胞光镜照片
P5 代骨髓间充质干细胞散在分布，呈三角形、星形、梭形或多角形，不规则形，绝大部分贴壁细胞，生长较快；见图 1。
图1
骨髓间充质干细胞（×100）
2.2 CCK-8 法测定干细胞的增殖情况
在开始培养时，两组的 OD 值是相等的，均为为 0.23。经过 24 h 的培养，低氧组的 OD 值已经明显大于常氧组（0.455±0.027 vs. 0.352±0.090，n=12，P=0.01）；见图 2。
图2
两组的 OD 值变化
2.3 实时定量 PCR 检测 HIF-1α 基因表达
检测结果使用 2-△△ct方法进行相对定量计算，并且进行统计学检验，低氧培养 12 h 后，低氧组的 HIF-1α mRNA 表达水平显著高于常氧组（P<0.05）；见图 3。
图3
低氧培养 12 h 后，两组 HIF-1α mRNA 表达水平
2.4 Western blotting 检测 HIF-1α 的表达
将胶片进行灰度分析并进行统计学分析得出结果：同常氧组比较，低氧组 HIF-1α 蛋白相对表达水平显著增高（0.47±0.05 vs. 0.63±0.06，n=3，P<0.05）；见图 4。
图4
两组 HIF-1α 表达
3 讨论
伴随着我国经济、社会的高速发展，全国疾病谱也悄然发生了翻天覆地的变化。几十年间，心血管系统疾病早已替代感染性疾病，成为威胁我国人民健康的头号杀手。其中缺血性心脏病，由于其发病快，病情重，预后差，死亡率极高，严重威胁人们的生命健康，心肌细胞无法再生的特点使得心肌梗死患者心脏功能的破坏具有不可逆性。干细胞移植技术的发展似乎带给人们新的希望。Strauer 等[8]在患者发生心肌梗死 6 d 后，将患者的自体干细胞输注到与梗死相关的动脉（“罪犯”血管）中。通过单光子发射计算机断层成像术（SPECT），在休息和运动时测量左心室功能，梗死面积，心室几何形状和心肌灌注，同时进行多靶点分析，多巴酚丁胺负荷超声心动图，右心导管检查和放射性核素心室检查。结果显示干细胞移植 10 周后，左心室周围的透壁梗死面积从 24.6%降至 15.7%，射血分数、心脏指数和每搏输出量增加了 20%～30%。Stamm 在冠状动脉旁路移植术（CABG）期间将其自体骨髓干细胞注射到梗死边界区。12 例接受注射的患者都没有发生心律失常或成瘤的严重并发症，随后的闪烁照相显示注射干细胞的梗死区比没有注射干细胞的梗死区的灌注情况得到了显著改善[8-11]。这些结果证明，干细胞移植治疗心脏疾病是可行的，可使得心肌梗死后的瘢痕面积缩小，改善心室功能。
虽然干细胞移植术治疗心肌梗死取得了一些成就，但是由于以往的研究多以直接梗死区注射的方式进行，远期来看，细胞往往流失严重，治疗效果不尽人意。所以就需要用载体材料来为干细胞提供物理支撑使细胞可以黏附其上，以期达到降低流失率的效果。补片材料是能够模仿细胞外基质的特异性三维排列结构，为种子细胞提供生存和增殖的环境，补片材料要有良好的生物相容性、可降解性以及生物安全性，从而减少细胞移植过程中细胞的流失，因此支架材料的选择是心肌补片的重要环节之一。前期有运用聚氨酯（polyurethane，PU）、聚碳酸亚丙酯（poly propylene carbonate）等材料的报道，但由于毒性、可塑性、难以降解等种种问题而不能进一步应用于研究，且目前的载体材料大多无法给细胞提供近似体内的三维生长微环境，往往移植细胞流失严重，因此一种既能为细胞提供生长的三维空间又能有效防止细胞流失的载体材料对于移植成功来说是十分重要的。近年来 P（3HB-co-4HB）引起了人们的注意，其全称为聚-3 羟基丁酸酯-co-4 羟基丁酸酯，是一种新型生物相容材料，具有良好的可塑性及延展性，在体内外条件下降解终产物为无毒的二氧化碳和水，利用现在工业技术可加工成三维支撑材料，为细胞提供三维物理性支撑，且具有良好的生物相容性，在医学领域具有巨大潜力[12-14]。我们的前期实验工作表明：P（3HB-co-4HB）具有很好的生物相容性、韧性和加工性；在作为种植干细胞的载体，制作心肌补片的相关实验研究中，干细胞种植于补片能促进干细胞的黏附存留和增殖分化，形成心肌补片，改善梗死心肌。
心肌梗死发生后，梗死区域细胞将处于低氧微环境中。有研究显示低氧环境下心肌细分化相关基因和蛋白质的表达显著增加。Correia 等[15]研究了不同溶解氧对鼠 iPSC 向心肌分化的影响。发现与常氧（20% O2 张力）相比，缺氧培养（4% O2 张力）导致心肌细胞的分化数量提高约 1 000 倍。表现出典型的心肌肌节结构，钙瞬变，电生理学特征和药物反应性。缺氧在发育过程中心血管系统的增殖，分化和维持中起着重要的作用。缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在分子水平上对低氧信号的处理起着重要的作用。Ng 等[16]在研究中证明了外源性 HIF-1α cDNA 在小鼠胚胎干细胞中的表达显著促进了心肌细胞的形成，表现为较高比例的跳动胚状体和肌钙蛋白-T 阳性细胞计数以及早期和晚期心脏标志物的表达增加，如 GATA 结合蛋白 4 和 6，NK2 转录因子相关基因座 5，α-肌球蛋白重链，β-肌球蛋白重链和肌球蛋白轻链都明显增加。另外，转导的细胞显示心肌营养素-1 和血管内皮生长因子的 mRNA 水平增加以及 eNOS 的磷酸化［p-eNOS（ser1171）］。应用 NOS 抑制剂二苯基碘鎓氯化物（DPI），Nω-硝基-1-精氨酸甲酯盐酸盐（l-NAME）或 Nω-硝基-1-精氨酸（l-NNA）消除了 HIF-1α 诱导的心肌分化。说明了 HIF-1 途径的激活促进了胚胎干细胞向心肌细胞的分化与成熟[15-17]。
我们的实验结果表明：在低氧三维培养条件下，低氧组的细胞增殖程度（OD=0.455±0.027）明显大于常氧组（OD=0.352±0.090，n=12，P=0.01）。低氧组的 HIF-1α mRNA 表达水平在 12 h 后显著高于常氧组（P<0.05）。24 h 后 Western blotting 检测到 HIF-1α 蛋白表达增加。所以我们认为，低氧三维培养微环境促进骨髓间充质干细胞增殖，这一效应可能与 HIF-1α 信号通路的激活有关。
