引用本文： 俞松良, 刘超男, 凌莉琴, 陈思, 李勤, 米健, 周静. 氨甲环酸抑制体外循环诱导的大鼠肺部炎性反应. 中国胸心血管外科临床杂志, 2020, 27(8): 933-939. doi: 10.7507/1007-4848.201912089 复制
体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）经过 60 余年的飞速发展已成为心脏直视手术、生命支持领域不可或缺的临床技术。尽管大多数患者可顺利恢复，仍有部分患者出现术后并发症，其中 CPB 引起的呼吸功能障碍最常见[1-2]。术后并发症的发生与 CPB 过程中血液成分与人工管道接触、肝素-鱼精蛋白复合物形成、缺血-再灌注损伤以及手术创伤应激等引发的全身性炎性反应相关[3]。患者临床表现不一，严重者可出现多器官功能衰竭，甚至死亡[4]，急性肺损伤或呼吸窘迫综合征是目前 CPB 后患者死亡的主要原因之一[5]。已有研究[6]发现 CPB 后 6 h 内全身炎症相关因子［如白细胞介素（IL）-1、IL-8、C-反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子（TNF）-α 等］浓度呈持续升高状态，但目前仍然缺乏针对 CPB 术后肺部炎性反应更深入的研究。
氨甲环酸是一种人工合成的低分子量赖氨酸类似物，半衰期为 80～120 min。氨甲环酸可以竞争性地与纤溶酶原/纤溶酶的赖氨酸结合位点结合，从而阻碍活化的纤溶酶与纤维蛋白的结合，抑制纤溶酶对纤维蛋白的降解[7]。氨甲环酸能有效抑制术中出血并降低术后血制品的输注[8-9]，且较抑肽酶等其它抗纤溶药物安全性更高[10]。此外，氨甲环酸还具有一定抗炎作用[11-14]。氨甲环酸在临床获得了广泛的应用，目前关于氨甲环酸的使用时机与剂量使用方式的探索大多以减少患者术中出血量、降低术后风险为目的，但氨甲环酸使用方式的不同对患者机体炎性反应是否存在不同影响却鲜有报道。
本研究通过在 CPB 不同时期给予大鼠不同剂量的氨甲环酸，检测大鼠术后血液和肺泡灌洗液中炎性因子的浓度差异并观测肺部炎性细胞渗出浸润情况的区别，以讨论 CPB 术中不同的氨甲环酸给药方式与剂量是否对 CPB 诱导的小鼠肺部炎性反应产生影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
64 只雄性 SD 大鼠（体重 350～400 g）购于四川达硕有限公司。所有实验动物饲养于四川大学华西医学院动物饲养中心。大鼠被饲养于光线和温度均受控的房间中，并允许自由饮食。所有动物的饲养和实验程序都严格按照首都医科大学动物医学部动物护理与使用委员会（IACUC）的政策进行。
1.1.2 试剂
试剂包括 IL-6、IL-1β、TNF-α 酶联免疫吸附法（ELISA 法）试剂盒（R&D Systems，美国）。
1.2 方法
1.2.1 分组
将 64 只 SD 大鼠随机分配至 8 组中，每组 8 只，分别为空白组（N，大鼠仅接受了麻醉后气管插管、动静脉分离插管等操作）、CPB 组（C，对大鼠进行全套 CPB 手术操作并开机循环 1 h，并给予相同剂量肝素、鱼精蛋白和胶体溶液以保证手术过程中输液总量一致）、循环前给药低剂量组（B25，25 mg/kg）、循环前给药中剂量组（B50，50 mg/kg）、循环前给药高剂量组（B100，100 mg/kg）、循环后给药低剂量组（P25，25 mg/kg）、循环后给药中剂量组（P50，50 mg/kg）、循环后给药高剂量组（P100，100 mg/kg）。之后所有手术操作均在戊巴比妥麻醉下进行，以尽可能减少实验动物在实验过程中所受痛苦。
1.2.2 CPB 模型建立
采用 2% 戊巴比妥（50 mg/kg）行腹膜腔注射麻醉，待大鼠眼角反射消失后将大鼠躯干与头部固定在专用大鼠固定板上，连接监护仪行心电监护。经口置入婴儿喉镜以暴露声门，使用 14G 留置针针套穿过大鼠声门后连接外部呼吸机并固定导管。麻醉及气管插管过程中全程注意大鼠呼吸活动、心率（HR），若出现缺氧症状则及时停止操作，待大鼠生命体征平稳后继续。呼吸机连接完毕且大鼠生命体征稳定后，于左侧腹股沟行纵向切口，暴露、分离左股动脉和股静脉，经股动脉置入 22G 套管针，使用 1 mg 肝素（500 IU/kg）封管，连接动脉监测仪持续监测大鼠动脉血压（BP）。于颈正中线旁开行纵向切口，分离颈静脉置入 16G 套管针作为静脉通路、静脉引流通路。循环前给药组在颈静脉插管成功后经过插管缓慢连续泵入预定浓度氨甲环酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）1 h，期间持续记录大鼠生命体征数据（HR、BP 等）以确定 CPB 各个通路连接通畅、大鼠生命体征正常。缓慢启动 CPB 泵（1～2 R/min），观察静脉血液在储血槽中引流状态，根据大鼠生命体征与 CPB 情况缓慢提升转速至最终循环流量为 50 mL/（kg·min），氧合器氧气流量为 0.5～0.8 L/min。采用加温器在输液管处加温循环体液以维持大鼠体温于 35.5℃～36.0℃。CPB 持续 1 h 后回输 1/3 的泵管内血至大鼠体内，CPB 泵停机，将鱼精蛋白（5 mg/mL）按肝素的 1.2 倍体积注入以中和肝素，另注入胶体溶液以保证各实验鼠在手术过程中输液总量一致。给药组大鼠在鱼精蛋白中和肝素后接受预定浓度的氨甲环酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的缓慢连续泵入 1 h，继续观察大鼠生命体征 1 h 后进行取材。
1.2.3 全血样本收集
CPB 手术结束后，弃去股动脉插管处导管前端 2～3 mL 血液，分别收集全血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管 2 管（2 mL/管）、枸橼酸钠抗凝管 1 管（2 mL/管）。将 EDTA 抗凝血与枸橼酸钠抗凝血各 1 管送至四川大学华西医学院实验医学科进行血细胞及凝血功能检验，剩余 EDTA 抗凝全血离心（1 700 g，4℃，15 min）后收集血浆于–80℃ 冰箱保存以待后续 ELISA 检测。
1.2.4 肺泡灌洗液收集
血液样本收集完成后，经大鼠气管插管缓慢灌注生理盐水 4 mL 于气管内，轻拍胸部保证生理盐水灌注充分，静置 5 min 后反复抽吸、推注生理盐水，最终尽可能多地收集肺泡灌洗液于离心管中（约 3 mL），–80℃ 冰箱保存以待后续检测。
1.2.5 肺组织样本收集与苏木精-伊红（HE）染色
肺泡灌洗液收集完成后分离大鼠左肺进行石蜡包埋，以 5 μm 厚度进行切片。二甲苯浸泡切片 10 min 脱蜡，无水乙醇 5 min 水化，然后分别在苏木精溶液中浸泡 2 min、PBS 弱碱液中浸泡 20 s 反蓝，自来水冲洗干净晾干后伊红溶液中浸泡 20 s，冲洗、脱水封片后用显微镜观察切片。
1.2.6 血细胞分类计数及凝血功能检测
使用全血细胞分析仪（XN-20 AIXM9000，希森美康，日本）检测血常规［红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、红细胞比容（HCT）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞比例（NEUT%）等］，使用全自动凝血分析仪（CS5100，希森美康，日本）检测凝血酶原时间（PT，凝固法）、活化部分凝血活酶时间（APTT，凝固法）、凝血酶时间（TT，凝固法）、纤维蛋白原（Thrombin，凝固法，547576，希森美康，日本）、纤维蛋白降解产物（FDP，免疫比浊法）和 D-D 二聚体（D-D，免疫比浊法）。
1.2.7 炎性因子检测
采用 ELISA 法测定血浆及肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6 与 TNF-α 含量，实验操作遵循试剂盒（R&D Systems，美国）说明书建议。同时测量所有收集的血浆与肺泡灌洗液样本，以最大限度减少操作间的差异性。
1.3 统计学分析
使用 SPSS 19.0 进行数据分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（
±s）表示，并使用单因素方差分析检测各组间差异；非正态分布的计量资料采用中位数与上下四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用非参数秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
该研究已通过四川大学华西医院动物伦理委员会审批，审批号：2015061A。
2 结果
2.1 CPB 导致炎性反应增强
CPB 术后由于大量液体输入导致大鼠血液被稀释，但 CPB 组和各实验组样本 WBC 与空白组差异无统计学意义（P>0.05）；见图 1、表 1。中性粒细胞、IL-6 和 TNF-α 以及肺泡灌洗液中 IL-1β 和 TNF-α 在 CPB 后有明显升高（P<0.05）；见图 2、表 2。肺泡灌洗液中炎性因子水平较血液中升高更明显（P<0.05）；见图 2、表 2。肺组织切片样本中，CPB 后终末细支气管与血管周围可见大量炎性细胞渗出浸润；见图 3。这提示 CPB 可增强炎性反应。
图1
CPB 导致炎性反应
RBC（a）、HGB（b）、（c）、PLT（d）、WBC（e）和 NEUT%（f）（黑色圆点表示均值，黑色短线代表±标准差）；由于血液稀释，CPB 组（C）、循环前给药低剂量组（B25，25 mg/kg）、循环前给药中剂量组（B50，50 mg/kg）、循环前给药高剂量组（B100，100 mg/kg）、循环后给药低剂量组（P25，25 mg/kg）、循环后给药中剂量组（P50，50 mg/kg）、循环后给药高剂量组（P100，100 mg/kg）RBC、HGB、HCT 和 PLT 较空白组低（
表1
各组全血细胞计数及凝血指标（
）
图2
炎性因子浓度比较
a～c：分别为血浆中 IL-1β 、IL-6 与 TNF-α 浓度；d～f：分别为肺泡灌洗液中 IL-1β 、IL-6 与 TNF-α 的浓度（黑色圆点表示中位数，黑色短线代表四分位数间距）；a～c：血中 IL-1β 浓度均低于试剂盒检测下限；CPB 组（C）血中 IL-6 浓度较空白组（N）升高（
表2
各组血液和肺泡灌洗液中炎性因子［M（P25，P75）］
图3
大鼠肺部炎性细胞渗出
a～b：为空白组（N），可见支气管为单层纤毛柱状上皮结构，肺泡腔呈空泡状薄壁结构，支气管纤毛柱状上皮结构清晰可见，肺泡腔结构完整；c～d：为 CPB 组（C），支气管上皮杯状细胞化生，支气管腔狭窄，周围可见大量炎性细胞浸润；e～f：为循环前给药组（B）；g～h：为循环后给药组（P），支气管周围仍然可见炎性细胞浸润但较 CPB 组明显减少，可见正常支气管结构
2.2 氨甲环酸可抑制炎性反应
不同给药方式对炎性强度无明显影响，氨甲环酸的使用能减少炎性因子的释放，其中以 TNF-α 的下降最为明显（P<0.05），但各用药组组间无明显差异（P>0.05）；见图 2、表 2。通过 HE 染色观察大鼠肺组织切片发现：大鼠肺终末细支气管与血管周围炎性细胞渗出情况较未使用氨甲环酸的 CPB 组减少；见图 3。
3 讨论
CPB 后机体全身炎性反应增强，肺脏也是受累脏器之一。肺脏是全身静脉血回流的主要滤器，同时也是重要的代谢器官，血中的各类有毒物质易滞留在肺中造成损伤，另外在 CPB 中被激活的巨噬细胞、中性粒细胞及补体系统等可以通过在肺血管内聚集、粘附于内皮细胞等对肺造成直接伤害，它们释放出的多种血管活性物质和炎性介质也会损伤、削弱肺功能。正因为肺组织具有易发生炎性损伤的特征，我们选取肺脏为主要样本，并设计了循环开始前与循环结束后两个氨甲环酸使用时间点，伴以 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 三种不同剂量进行实验以进一步探索氨甲环酸对 CPB 后炎性反应的影响。
研究证实 CPB 可导致机体纤溶系统发生亢进：纤溶酶激活后纤维蛋白降解产物 D-D 二聚体生成增多，激活的纤溶酶与 D-D 二聚体可通过结合巨噬细胞表面膜连蛋白 A2 异四聚体使巨噬细胞 TNF-α 和 IL-6 分泌增加，进而激活全身炎性反应[15-17]。氨甲环酸能与纤溶酶原及纤溶酶表面赖氨酸位点竞争性结合，一方面可阻止纤维蛋白被纤溶酶降解，抑制纤溶亢进的发生；另一方面也抑制了纤溶酶和纤维蛋白裂解产物 D-D 二聚体对巨噬细胞系统的激活，从而起到抑制炎症的作用。临床数据证实，氨甲环酸的应用能有效降低患者术中出血风险以及减少术后血制品输注量，且安全性较高，但使用小剂量和大剂量氨甲环酸在减少出血和输血量方面的效果相似[8, 18-19]。目前氨甲环酸的给药方式尚无统一的共识，各文献报道差异较大，给药方式包括：单次给药、分次给药、持续泵入、负荷量+维持量、负荷量+CPB 预充量+维持量，以及心包局部用药等[15-16]。同时存在多种用药剂量方案，包括：小剂量使用氨甲环酸（负荷量 10 mg/kg，维持量 2 mg/kg）[17]和大剂量使用氨甲环酸（负荷量 30 mg/kg，维持量 16 mg/kg，选择性加入 2 mg/kg 的 CPB 预充量）[8]，巨大的差异性给临床应用带来了不便，且关于氨甲环酸使用方法对 CPB 术后患者机体炎性反应是否存在影响的研究较少。
药代动力学显示氨甲环酸抑制纤溶的有效血浆浓度为 10 μg/mL[20]，目前推荐的小剂量给药方案（负荷量 10 mg/kg，维持量 2 mg/kg）可使血药浓度达到 20 μg/mL，同时大剂量给药方案（负荷量 30 mg/kg，维持量 16 mg/kg，选择性加入 2 mg/kg 的 CPB 预充量）可使血药浓度达到 90～180 μg/mL。结合药代动力学结果，本次实验中氨甲环酸低剂量组（循环前、后给药 25 mg/kg）可使氨甲环酸血药浓度超过 10 μg/mL，所以本实验中设计使用的低、中、高剂量氨甲环酸均可保证氨甲环酸的抗纤溶作用，凝血功能相关检测的结果也证实了所有使用了氨甲环酸的大鼠均未发生纤溶亢进。但是动物实验显示，给药时机的改变或药物用量的提升对于炎性反应严重程度无明显影响。
在实验中我们发现使用氨甲环酸可抑制巨噬细胞介导的 TNF-α 分泌，但并不能改变白细胞和中性粒细胞浓度在全血中的升高，这可能是由于氨甲环酸虽然阻断了纤溶产物对炎性细胞的激活作用，但机体纤溶系统的激活并不是 CPB 介导的肺部炎症发生的唯一因素，也与中性粒细胞在肺内的聚集、补体系统的激活、肺组织的缺血-再灌注损伤等相关。仅阻断纤溶-单核巨噬细胞的促炎途径，不足以抑制机体炎性反应的进一步发展，而氨甲环酸本身也未发现具备抑制补体激活或是降低内皮细胞通透性的作用，因此氨甲环酸无法抑制中性粒细胞绝对浓度的提升。
综上所述，在大鼠 CPB 模型中，氨甲环酸的使用可有效减少巨噬细胞介导的炎性因子的释放、减轻大鼠的肺炎性反应，但是单纯增加给药剂量或改变给药时间点，并不能有效地降低炎性反应强度。鉴于目前关于在氨甲环酸高剂量用药安全、药物不良反应以及抗炎作用的发挥等方面仍有待进一步研究，本研究可为临床应用提供参考。此外本研究通过动物实验也提示，当存在出血风险或预估手术时间较长的情况下，建议在 CPB 开始前使用氨甲环酸。
利益冲突：无。
作者贡献：俞松良负责论文设计、论文初稿撰写；俞松良、刘超男、凌莉琴、陈思、李勤负责实施研究；俞松良、刘超男、陈思负责数据整理与分析；刘超男、米健、周静负责论文审阅与修改。
体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）经过 60 余年的飞速发展已成为心脏直视手术、生命支持领域不可或缺的临床技术。尽管大多数患者可顺利恢复，仍有部分患者出现术后并发症，其中 CPB 引起的呼吸功能障碍最常见[1-2]。术后并发症的发生与 CPB 过程中血液成分与人工管道接触、肝素-鱼精蛋白复合物形成、缺血-再灌注损伤以及手术创伤应激等引发的全身性炎性反应相关[3]。患者临床表现不一，严重者可出现多器官功能衰竭，甚至死亡[4]，急性肺损伤或呼吸窘迫综合征是目前 CPB 后患者死亡的主要原因之一[5]。已有研究[6]发现 CPB 后 6 h 内全身炎症相关因子［如白细胞介素（IL）-1、IL-8、C-反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子（TNF）-α 等］浓度呈持续升高状态，但目前仍然缺乏针对 CPB 术后肺部炎性反应更深入的研究。
氨甲环酸是一种人工合成的低分子量赖氨酸类似物，半衰期为 80～120 min。氨甲环酸可以竞争性地与纤溶酶原/纤溶酶的赖氨酸结合位点结合，从而阻碍活化的纤溶酶与纤维蛋白的结合，抑制纤溶酶对纤维蛋白的降解[7]。氨甲环酸能有效抑制术中出血并降低术后血制品的输注[8-9]，且较抑肽酶等其它抗纤溶药物安全性更高[10]。此外，氨甲环酸还具有一定抗炎作用[11-14]。氨甲环酸在临床获得了广泛的应用，目前关于氨甲环酸的使用时机与剂量使用方式的探索大多以减少患者术中出血量、降低术后风险为目的，但氨甲环酸使用方式的不同对患者机体炎性反应是否存在不同影响却鲜有报道。
本研究通过在 CPB 不同时期给予大鼠不同剂量的氨甲环酸，检测大鼠术后血液和肺泡灌洗液中炎性因子的浓度差异并观测肺部炎性细胞渗出浸润情况的区别，以讨论 CPB 术中不同的氨甲环酸给药方式与剂量是否对 CPB 诱导的小鼠肺部炎性反应产生影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
64 只雄性 SD 大鼠（体重 350～400 g）购于四川达硕有限公司。所有实验动物饲养于四川大学华西医学院动物饲养中心。大鼠被饲养于光线和温度均受控的房间中，并允许自由饮食。所有动物的饲养和实验程序都严格按照首都医科大学动物医学部动物护理与使用委员会（IACUC）的政策进行。
1.1.2 试剂
试剂包括 IL-6、IL-1β、TNF-α 酶联免疫吸附法（ELISA 法）试剂盒（R&D Systems，美国）。
1.2 方法
1.2.1 分组
将 64 只 SD 大鼠随机分配至 8 组中，每组 8 只，分别为空白组（N，大鼠仅接受了麻醉后气管插管、动静脉分离插管等操作）、CPB 组（C，对大鼠进行全套 CPB 手术操作并开机循环 1 h，并给予相同剂量肝素、鱼精蛋白和胶体溶液以保证手术过程中输液总量一致）、循环前给药低剂量组（B25，25 mg/kg）、循环前给药中剂量组（B50，50 mg/kg）、循环前给药高剂量组（B100，100 mg/kg）、循环后给药低剂量组（P25，25 mg/kg）、循环后给药中剂量组（P50，50 mg/kg）、循环后给药高剂量组（P100，100 mg/kg）。之后所有手术操作均在戊巴比妥麻醉下进行，以尽可能减少实验动物在实验过程中所受痛苦。
1.2.2 CPB 模型建立
采用 2% 戊巴比妥（50 mg/kg）行腹膜腔注射麻醉，待大鼠眼角反射消失后将大鼠躯干与头部固定在专用大鼠固定板上，连接监护仪行心电监护。经口置入婴儿喉镜以暴露声门，使用 14G 留置针针套穿过大鼠声门后连接外部呼吸机并固定导管。麻醉及气管插管过程中全程注意大鼠呼吸活动、心率（HR），若出现缺氧症状则及时停止操作，待大鼠生命体征平稳后继续。呼吸机连接完毕且大鼠生命体征稳定后，于左侧腹股沟行纵向切口，暴露、分离左股动脉和股静脉，经股动脉置入 22G 套管针，使用 1 mg 肝素（500 IU/kg）封管，连接动脉监测仪持续监测大鼠动脉血压（BP）。于颈正中线旁开行纵向切口，分离颈静脉置入 16G 套管针作为静脉通路、静脉引流通路。循环前给药组在颈静脉插管成功后经过插管缓慢连续泵入预定浓度氨甲环酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）1 h，期间持续记录大鼠生命体征数据（HR、BP 等）以确定 CPB 各个通路连接通畅、大鼠生命体征正常。缓慢启动 CPB 泵（1～2 R/min），观察静脉血液在储血槽中引流状态，根据大鼠生命体征与 CPB 情况缓慢提升转速至最终循环流量为 50 mL/（kg·min），氧合器氧气流量为 0.5～0.8 L/min。采用加温器在输液管处加温循环体液以维持大鼠体温于 35.5℃～36.0℃。CPB 持续 1 h 后回输 1/3 的泵管内血至大鼠体内，CPB 泵停机，将鱼精蛋白（5 mg/mL）按肝素的 1.2 倍体积注入以中和肝素，另注入胶体溶液以保证各实验鼠在手术过程中输液总量一致。给药组大鼠在鱼精蛋白中和肝素后接受预定浓度的氨甲环酸（25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg）的缓慢连续泵入 1 h，继续观察大鼠生命体征 1 h 后进行取材。
1.2.3 全血样本收集
CPB 手术结束后，弃去股动脉插管处导管前端 2～3 mL 血液，分别收集全血于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管 2 管（2 mL/管）、枸橼酸钠抗凝管 1 管（2 mL/管）。将 EDTA 抗凝血与枸橼酸钠抗凝血各 1 管送至四川大学华西医学院实验医学科进行血细胞及凝血功能检验，剩余 EDTA 抗凝全血离心（1 700 g，4℃，15 min）后收集血浆于–80℃ 冰箱保存以待后续 ELISA 检测。
1.2.4 肺泡灌洗液收集
血液样本收集完成后，经大鼠气管插管缓慢灌注生理盐水 4 mL 于气管内，轻拍胸部保证生理盐水灌注充分，静置 5 min 后反复抽吸、推注生理盐水，最终尽可能多地收集肺泡灌洗液于离心管中（约 3 mL），–80℃ 冰箱保存以待后续检测。
1.2.5 肺组织样本收集与苏木精-伊红（HE）染色
肺泡灌洗液收集完成后分离大鼠左肺进行石蜡包埋，以 5 μm 厚度进行切片。二甲苯浸泡切片 10 min 脱蜡，无水乙醇 5 min 水化，然后分别在苏木精溶液中浸泡 2 min、PBS 弱碱液中浸泡 20 s 反蓝，自来水冲洗干净晾干后伊红溶液中浸泡 20 s，冲洗、脱水封片后用显微镜观察切片。
1.2.6 血细胞分类计数及凝血功能检测
使用全血细胞分析仪（XN-20 AIXM9000，希森美康，日本）检测血常规［红细胞计数（RBC）、血小板计数（PLT）、红细胞比容（HCT）、白细胞计数（WBC）、中性粒细胞比例（NEUT%）等］，使用全自动凝血分析仪（CS5100，希森美康，日本）检测凝血酶原时间（PT，凝固法）、活化部分凝血活酶时间（APTT，凝固法）、凝血酶时间（TT，凝固法）、纤维蛋白原（Thrombin，凝固法，547576，希森美康，日本）、纤维蛋白降解产物（FDP，免疫比浊法）和 D-D 二聚体（D-D，免疫比浊法）。
1.2.7 炎性因子检测
采用 ELISA 法测定血浆及肺泡灌洗液中 IL-1β、IL-6 与 TNF-α 含量，实验操作遵循试剂盒（R&D Systems，美国）说明书建议。同时测量所有收集的血浆与肺泡灌洗液样本，以最大限度减少操作间的差异性。
1.3 统计学分析
使用 SPSS 19.0 进行数据分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，并使用单因素方差分析检测各组间差异；非正态分布的计量资料采用中位数与上下四分位数［M（P25，P75）］表示，组间比较采用非参数秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
1.4 伦理审查
该研究已通过四川大学华西医院动物伦理委员会审批，审批号：2015061A。
2 结果
2.1 CPB 导致炎性反应增强
CPB 术后由于大量液体输入导致大鼠血液被稀释，但 CPB 组和各实验组样本 WBC 与空白组差异无统计学意义（P>0.05）；见图 1、表 1。中性粒细胞、IL-6 和 TNF-α 以及肺泡灌洗液中 IL-1β 和 TNF-α 在 CPB 后有明显升高（P<0.05）；见图 2、表 2。肺泡灌洗液中炎性因子水平较血液中升高更明显（P<0.05）；见图 2、表 2。肺组织切片样本中，CPB 后终末细支气管与血管周围可见大量炎性细胞渗出浸润；见图 3。这提示 CPB 可增强炎性反应。
图1
CPB 导致炎性反应
RBC（a）、HGB（b）、（c）、PLT（d）、WBC（e）和 NEUT%（f）（黑色圆点表示均值，黑色短线代表±标准差）；由于血液稀释，CPB 组（C）、循环前给药低剂量组（B25，25 mg/kg）、循环前给药中剂量组（B50，50 mg/kg）、循环前给药高剂量组（B100，100 mg/kg）、循环后给药低剂量组（P25，25 mg/kg）、循环后给药中剂量组（P50，50 mg/kg）、循环后给药高剂量组（P100，100 mg/kg）RBC、HGB、HCT 和 PLT 较空白组低（
表1
各组全血细胞计数及凝血指标（）
图2
炎性因子浓度比较
a～c：分别为血浆中 IL-1β 、IL-6 与 TNF-α 浓度；d～f：分别为肺泡灌洗液中 IL-1β 、IL-6 与 TNF-α 的浓度（黑色圆点表示中位数，黑色短线代表四分位数间距）；a～c：血中 IL-1β 浓度均低于试剂盒检测下限；CPB 组（C）血中 IL-6 浓度较空白组（N）升高（
表2
各组血液和肺泡灌洗液中炎性因子［M（P25，P75）］
图3
大鼠肺部炎性细胞渗出
a～b：为空白组（N），可见支气管为单层纤毛柱状上皮结构，肺泡腔呈空泡状薄壁结构，支气管纤毛柱状上皮结构清晰可见，肺泡腔结构完整；c～d：为 CPB 组（C），支气管上皮杯状细胞化生，支气管腔狭窄，周围可见大量炎性细胞浸润；e～f：为循环前给药组（B）；g～h：为循环后给药组（P），支气管周围仍然可见炎性细胞浸润但较 CPB 组明显减少，可见正常支气管结构
2.2 氨甲环酸可抑制炎性反应
不同给药方式对炎性强度无明显影响，氨甲环酸的使用能减少炎性因子的释放，其中以 TNF-α 的下降最为明显（P<0.05），但各用药组组间无明显差异（P>0.05）；见图 2、表 2。通过 HE 染色观察大鼠肺组织切片发现：大鼠肺终末细支气管与血管周围炎性细胞渗出情况较未使用氨甲环酸的 CPB 组减少；见图 3。
3 讨论
CPB 后机体全身炎性反应增强，肺脏也是受累脏器之一。肺脏是全身静脉血回流的主要滤器，同时也是重要的代谢器官，血中的各类有毒物质易滞留在肺中造成损伤，另外在 CPB 中被激活的巨噬细胞、中性粒细胞及补体系统等可以通过在肺血管内聚集、粘附于内皮细胞等对肺造成直接伤害，它们释放出的多种血管活性物质和炎性介质也会损伤、削弱肺功能。正因为肺组织具有易发生炎性损伤的特征，我们选取肺脏为主要样本，并设计了循环开始前与循环结束后两个氨甲环酸使用时间点，伴以 25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 三种不同剂量进行实验以进一步探索氨甲环酸对 CPB 后炎性反应的影响。
研究证实 CPB 可导致机体纤溶系统发生亢进：纤溶酶激活后纤维蛋白降解产物 D-D 二聚体生成增多，激活的纤溶酶与 D-D 二聚体可通过结合巨噬细胞表面膜连蛋白 A2 异四聚体使巨噬细胞 TNF-α 和 IL-6 分泌增加，进而激活全身炎性反应[15-17]。氨甲环酸能与纤溶酶原及纤溶酶表面赖氨酸位点竞争性结合，一方面可阻止纤维蛋白被纤溶酶降解，抑制纤溶亢进的发生；另一方面也抑制了纤溶酶和纤维蛋白裂解产物 D-D 二聚体对巨噬细胞系统的激活，从而起到抑制炎症的作用。临床数据证实，氨甲环酸的应用能有效降低患者术中出血风险以及减少术后血制品输注量，且安全性较高，但使用小剂量和大剂量氨甲环酸在减少出血和输血量方面的效果相似[8, 18-19]。目前氨甲环酸的给药方式尚无统一的共识，各文献报道差异较大，给药方式包括：单次给药、分次给药、持续泵入、负荷量+维持量、负荷量+CPB 预充量+维持量，以及心包局部用药等[15-16]。同时存在多种用药剂量方案，包括：小剂量使用氨甲环酸（负荷量 10 mg/kg，维持量 2 mg/kg）[17]和大剂量使用氨甲环酸（负荷量 30 mg/kg，维持量 16 mg/kg，选择性加入 2 mg/kg 的 CPB 预充量）[8]，巨大的差异性给临床应用带来了不便，且关于氨甲环酸使用方法对 CPB 术后患者机体炎性反应是否存在影响的研究较少。
药代动力学显示氨甲环酸抑制纤溶的有效血浆浓度为 10 μg/mL[20]，目前推荐的小剂量给药方案（负荷量 10 mg/kg，维持量 2 mg/kg）可使血药浓度达到 20 μg/mL，同时大剂量给药方案（负荷量 30 mg/kg，维持量 16 mg/kg，选择性加入 2 mg/kg 的 CPB 预充量）可使血药浓度达到 90～180 μg/mL。结合药代动力学结果，本次实验中氨甲环酸低剂量组（循环前、后给药 25 mg/kg）可使氨甲环酸血药浓度超过 10 μg/mL，所以本实验中设计使用的低、中、高剂量氨甲环酸均可保证氨甲环酸的抗纤溶作用，凝血功能相关检测的结果也证实了所有使用了氨甲环酸的大鼠均未发生纤溶亢进。但是动物实验显示，给药时机的改变或药物用量的提升对于炎性反应严重程度无明显影响。
在实验中我们发现使用氨甲环酸可抑制巨噬细胞介导的 TNF-α 分泌，但并不能改变白细胞和中性粒细胞浓度在全血中的升高，这可能是由于氨甲环酸虽然阻断了纤溶产物对炎性细胞的激活作用，但机体纤溶系统的激活并不是 CPB 介导的肺部炎症发生的唯一因素，也与中性粒细胞在肺内的聚集、补体系统的激活、肺组织的缺血-再灌注损伤等相关。仅阻断纤溶-单核巨噬细胞的促炎途径，不足以抑制机体炎性反应的进一步发展，而氨甲环酸本身也未发现具备抑制补体激活或是降低内皮细胞通透性的作用，因此氨甲环酸无法抑制中性粒细胞绝对浓度的提升。
综上所述，在大鼠 CPB 模型中，氨甲环酸的使用可有效减少巨噬细胞介导的炎性因子的释放、减轻大鼠的肺炎性反应，但是单纯增加给药剂量或改变给药时间点，并不能有效地降低炎性反应强度。鉴于目前关于在氨甲环酸高剂量用药安全、药物不良反应以及抗炎作用的发挥等方面仍有待进一步研究，本研究可为临床应用提供参考。此外本研究通过动物实验也提示，当存在出血风险或预估手术时间较长的情况下，建议在 CPB 开始前使用氨甲环酸。
利益冲突：无。
作者贡献：俞松良负责论文设计、论文初稿撰写；俞松良、刘超男、凌莉琴、陈思、李勤负责实施研究；俞松良、刘超男、陈思负责数据整理与分析；刘超男、米健、周静负责论文审阅与修改。
