由于高分辨率胸部 CT 和肺癌早期筛查的普及，同期多原发肺癌（或称同时性多原发肺癌，synchronous multiple primary lung cancer，sMPLC）的检出率逐步提高。sMPLC 与肺癌肺内转移的鉴别诊断成为尤其重要的临床问题。借助高通量测序技术刻画 sMPLC 的分子遗传学特征是目前研究的热点，既能阐释 sMPLC 的发生发展规律，也可作为临床病理诊断标准的补充和完善。本文对 sMPLC 诊断标准的更新进行总结，并以克隆性分析领域为例，综述 sMPLC 分子遗传学特征的研究进展。
引用本文： 宋洋, 杨笑盈, 贾梓淇, 邴钟兴, 曹磊, 曹智理, 郭超, 梁乃新, 李单青. 同期多原发肺癌诊断标准更新与分子遗传学特征研究进展. 中国胸心血管外科临床杂志, 2021, 28(3): 358-362. doi: 10.7507/1007-4848.202004014 复制
GLOBOCAN 2018 统计显示，在全球范围内肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，同时也是癌症相关死亡最主要的原因[1]。2018 年中国新增肺癌病例 774 323 例，新增肺癌死亡病例 690 567 例[1]。目前，中国肺癌患者的 5 年生存率为 19.7%[2-3]。
1924 年，Beyreuther 首次报道了同时有两个彼此独立的原发肿瘤灶的肺癌病例，对于肺部多发恶性肿瘤的研究就此拉开序幕。而根据研究[4]，约有 15% 的肺癌患者经手术明确同时存在≥ 2 个肺内恶性病灶。而一项通过回顾分析 SEER 数据库的研究[5]报道，对于首诊原发性肺癌的患者，即便在接受根治性治疗后，仍有每人每年 1%～2% 的风险发生第二原发性肺癌（second primary lung cancer，SPLC）。由此，同一患者肺内发生2个或2个以上的原发性恶性肿瘤，即多原发肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）的研究价值，再次得到了强调。
MPLC 据诊断时间间隔 4 年[6-7]，可进一步区分为同期多原发肺癌（或称同时性多原发肺癌，sMPLC）与异时性多原发肺癌（metachronous MPLC，mMPLC）。据多个临床序列提供的数据显示，sMPLC 的估算发病率在 0.2%～8%[8]。近年来，随着早诊检查手段的普及（如 CT、PET），以及对肺癌综合治疗的深入探索，sMPLC 患者有了更高的检出率、更长的生存期[9]。然而，sMPLC 与肺癌肺内转移（intrapulmonary metastases）的鉴别诊断是一个长久存在的临床难题。由于二者预后、相应治疗方案的显著区别，建立临床工作中可遵循的诊断标准，并进一步探索二者预后差别背后的病理学、分子生物学机制，无疑是一个极具重要性的研究课题。
本文对 sMPLC 的诊断标准更新及相关理论的研究进展，包括临床病理诊断证据、分子遗传学特征及二者的比较、匹配，进行综述，以期为完善 sMPLC 的诊治策略带来启发。
1 sMPLC 诊断标准的更新及局限
1.1 sMPLC 概念及诊断标准的发展史
1975 年，Martini 和 Melamed [10]提出了MPLC的首个临床病理诊断标准。据 Martini-Melamed 诊断标准，对于解剖上分隔开的多个肿瘤病灶，若符合下列标准之一，则可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但符合下列条件：① 病灶起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）；② 病灶发生于不同肺段、不同肺叶或不同侧肺；③ 无共同引流的淋巴系统或肺外转移。如诊断为 MPLC 的病灶间的诊断间隔≤2 年，则划分为 sMPLC。
1995 年及 2003 年，Antakli等[11]及 Colice等[12] 对 Martini-Melamed 诊断标准进行了修订，符合下列标准之一的病灶可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但下列条件符合至少两个：① 解剖上独立；② 属癌前病变；③ 无全身转移；④ 无纵隔受累；⑤ DNA 倍体分析结果不同。区分 sMPLC 与 mMPLC 的诊断间隔标准变更为 4 年，癌灶的分子遗传学特征首次加入了诊断标准。
2007 年，美国胸科医师学会（ACCP）提出了 sMPLC 的诊断标准[6]，并在 2013 年作出了修订[7]，符合下列标准之一的病灶可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但符合下列条件之一：① 分属不同肺叶，且无 N2、N3 受累、无全身转移；② 由解剖上分离的癌前病变发展而来；③ 有不同的分子遗传学特征。至此，sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值得到了再一次提高，但 ACCP 的指南中仍未明确“分子遗传学特征”的具体内容及标准（图1）。
图1
sMPLC 临床诊断标准更新及理念进化
1995～2003 年，Antakli-Colice 首次将癌灶的分子遗传学特征加入诊断标准；2007～2013 年，ACCP 不断提高分子遗传学特征的诊断价值，但具体内容及标准尚待明确；未来，对 sMPLC 分子遗传学特征的探究将有更加广阔的前景
2016 年，国际肺癌研究协会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）提出现行 TNM 分期对于评价 sMPLC 有其局限性，建议在第 8 版 TNM 分期中对其进行特殊分期：T 分期为各单个病灶中最高的 T 分期，在其后标注病灶个数，N 分期和 M 分期则根据所有结节的总体淋巴结及全身转移情况制定，如“T2（3）N0M0”[13]。此后，尚无被广泛接受的 sMPLC 诊断标准在指南中被提出。
1.2 临床病理诊断的局限性
经过长时间的临床实践检验，单独的临床病理诊断呈现出了其局限性。即便是根据最为广泛应用的 Martini-Melamed 诊断标准，不同课题组据该标准区分出的 sMPLC 患者群体的生存率数据呈现出显著偏倚[14]。2010 年 Girard等[15]报道，同一组患者分别通过 Martini-Melamed 及 ACCP 标准进行 sMPLC 与肺癌肺内转移的鉴别诊断，结果也有较大偏差。ACCP 指南（2013 年版）中评论，临床病理诊断中观察到的这些偏倚，不仅由于部分诊断标准有赖于临床医生无法完全量化的主观判断，没有将 sMPLC 具体的分子遗传学特征纳入诊断标准也是因素之一[7]。第 8 版 TNM 分期的补充意见中也同样强调了分子遗传学特征对于 sMPLC 的诊断价值[13]。sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值逐渐成为研究热点。
2 sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值
2011 年 Hanahan等[16]报道了恶性肿瘤的十大特征，并认为其中最根本的特征是“基因组的不稳定性和突变”，此特征赋予了恶性肿瘤细胞克隆性增殖的能力。因而，克隆性分析是对 sMPLC 分子遗传学特征分析的一个重要切入点。
经典的克隆性分析包括原癌基因或抑癌基因的体细胞突变（somatic mutations in oncogenes or tumor suppressor genes）分析、X-染色体的失活（X-chromosome inactivation）分析及杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析等分析手段[14, 17]。下文将从上述三方面对 sMPLC 的分子遗传学特征及其诊断价值进行综述。
2.1 原癌基因或抑癌基因的体细胞突变分析
“标记基因（genetic markers，或称 clonal markers）”是在恶性肿瘤的癌变过程中，早期发生、高频发生突变的基因，且该突变随恶性肿瘤细胞的复制能够稳定传递给子代细胞。位于 17 号染色体上的 p53 是一个抑癌基因，兼具作为标记基因的上述特征，且 p53 在小细胞肺癌及非小细胞肺癌中的突变发生率分别高达 70% 与 50%[18-19]。据报道，在 MPLC 中，p53 的突变可发生在该基因 DNA 结合区（5～8 外显子）的多个位点，且均为点突变[20]。因此，在多种多样的 p53 突变中，两个独立的癌灶有相同的 p53 突变的概率极低，这是通过原癌基因或抑癌基因的体细胞突变模式鉴别肿瘤来源的理论基础。早在 1993 年，此理论就已在鉴别诊断多原发头颈部肿瘤中得到了验证[21]。在诊断 MPLC 的研究中，p53 体细胞突变的诊断可靠性大概为 35%～66%[22]。不只是 p53，EGFR 与 KRAS 突变在非典型性腺瘤样增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的病例中多有报道，倾向于被认为是肺癌发生过程中的早期事件[23]。同样，EGFR 及 KRAS 突变是随机发生的，且有极高的突变不一致性：如将 EGFR 与 KRAS 的突变状态组合分析，71%～83% 的 MPLC 患者表现出克隆性（clonality status）的不一致[23-24]，因此 EGFR/KRAS 也是被用于克隆性分析的标记基因[23-26]。有研究人员发现，27.9% 的多原发肺癌患者不同肿瘤灶中程序性死亡配体-1（PD-L1）表达水平存在差异，该比例远高于肺内转移患者（6.3%）[27]。
“分子标签”也可以是一组肺癌的相关热点突变。已有一项研究提出可通过结合病理诊断及 22 个肺癌热点基因的突变形式对肺癌肺内转移及 sMPLC 作出鉴别诊断。文中认为有不同驱动基因突变（包括 BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、ERBB2、MET）的同期多灶肺癌可诊断为 sMPLC；在有相同突变的情况下，（1）如相同突变是肺癌的高频突变（包括 EGFR del 19、EGFR L858R、KRAS G12X），则根据病理划分肺内转移或 sMPLC；（2）如相同突变是罕见突变（包括 p53），则认为是肺内转移。本研究提出的诊断标准尚需大规模的前瞻性临床试验进行进一步验证[28]。
在临床应用中，对于根据病理组织类型证据就可诊断为 sMPLC 的病例，体细胞突变分析可验证其病理组织诊断，一致性高达 78%[29-30]；当癌灶病理组织类型相同、临床诊断存在难度时，分子遗传学特征可作为独立于临床证据的补充证据[31]。
需要特别指出的是，对于影像学表现为纯磨玻璃影的多个早期癌变，研究者常常排除淋巴或血性转移的可能，诊断为 sMPLC[13]，但近期有研究通过体细胞突变分析的手段，从分子遗传学特征的角度证明了气腔播散转移（spread through air spaces，STAS[32]）在此类多发磨玻璃影的“早期癌变”中存在的可能[33]。此发现也从另一角度提示，分子遗传学特征可用于研究肺癌发生发展的规律。
2.2 X-染色体的失活分析
在女性胚胎发育过程中，每个体细胞的两条 X 染色体中都有一条会随机失活，正常的女性组织中父本 X 染色体失活的细胞与母本 X 染色体失活的细胞随机分布，相互镶嵌，呈“马赛克”样。而在细胞克隆性增殖过程中，失活的 X 染色体会稳定传递到子代细胞中，因此同样可以作为一个克隆性标志。2009 年，Wang等[34]首次将 X-染色体失活分析法运用于一个 MPLC 临床序列，临床诊断为 sMPLC 或 mMPLC 的入组患者中，78% 的患者呈现出了一致的 X 染色体失活模式，因此该组患者中很大可能有误诊为 MPLC 的肺内转移患者，X 染色体的失活分析揭示了临床病理学诊断的局限性。
但 X-染色体失活分析的主要局限性在于：（1）仅可运用于女性患者中；（2）即便是克隆性不一致的两个癌灶，也有 50% 的可能，因为 X 染色体失活的随机性，呈现出同样的 X 染色体失活模式[35]。
2.3 杂合性缺失分析
据二次打击假说（Knudson's two hit hypothesis），细胞中携带一个等位基因上的生殖细胞系突变（germ-line heterozygosity）是发生癌变的基础，若第二个等位基因上发生二次突变，细胞成为体细胞突变纯合子（somatic homozygosity），导致抑癌基因彻底失活，细胞则发生癌变[36]，上述过程称为杂合性缺失。LOH 分析中，正常组织因为父本与母本来源的基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）或微卫星（microsatellite）位点多态性的不一致呈现出杂合性，而同一克隆来源的癌灶则会表现出相同的 LOH 模式[37]。已有报道通过 LOH 分析可成功区别病理组织类型相同的 sMPLC 与肺内转移灶[38-39]，通过与 p53 突变模式结合，此种分子遗传学诊断方法的特异性及敏感性可得到进一步提高[17]。
3 分子遗传性特征分析的潜在问题
无论是通过何种分子生物学技术对癌灶进行分子遗传学特征的探究，一个始终需要回答的问题是肿瘤的异质性（intratumoral heterogeneity）。2012 年，《新英格兰医学杂志》刊发了肾癌相关研究中肿瘤内部的异质性，及随肿瘤发展进化出现的异质性[40]。通过 DNA 测序分析，多个肺癌相关基因，包括 EGFR、KRAS、ERBB2，均呈现出了肿瘤异质性，并主要见于肺腺癌标本[41-43]。这种异质性或许能够部分解释部分肺癌患者对于治疗反应的差异，但同时也提示，sMPLC 分子遗传学特征的临床应用仍需要更多深入的研究[44-45]。
4 小结与展望
经过 30 余年的探索，sMPLC 的诊断标准多次更新，仅依照肿瘤的组织病理学特征无法明确区分 sMPLC 与肺内转移瘤，分子遗传学特征的诊断价值逐渐得到重视和强调。以克隆性分析领域取得的进展为例，对 sMPLC 的分子遗传学特征进行描述和机制探索，不仅可以补充完善临床病理诊断标准，在揭示 sMPLC 的发生发展规律方面也有广阔的前景，有望辅助定义 sMPLC 的疾病性质。
利益冲突：无。
作者贡献：宋洋设计论文、检索文献、撰写初稿；梁乃新、李单青设计论文、修改论文终稿；杨笑盈、贾梓淇检索及分析文献； 邴钟兴、曹磊、曹智理和郭超对论文进行了审阅与修改。
GLOBOCAN 2018 统计显示，在全球范围内肺癌是发病率最高的恶性肿瘤，同时也是癌症相关死亡最主要的原因[1]。2018 年中国新增肺癌病例 774 323 例，新增肺癌死亡病例 690 567 例[1]。目前，中国肺癌患者的 5 年生存率为 19.7%[2-3]。
1924 年，Beyreuther 首次报道了同时有两个彼此独立的原发肿瘤灶的肺癌病例，对于肺部多发恶性肿瘤的研究就此拉开序幕。而根据研究[4]，约有 15% 的肺癌患者经手术明确同时存在≥ 2 个肺内恶性病灶。而一项通过回顾分析 SEER 数据库的研究[5]报道，对于首诊原发性肺癌的患者，即便在接受根治性治疗后，仍有每人每年 1%～2% 的风险发生第二原发性肺癌（second primary lung cancer，SPLC）。由此，同一患者肺内发生2个或2个以上的原发性恶性肿瘤，即多原发肺癌（multiple primary lung cancer，MPLC）的研究价值，再次得到了强调。
MPLC 据诊断时间间隔 4 年[6-7]，可进一步区分为同期多原发肺癌（或称同时性多原发肺癌，sMPLC）与异时性多原发肺癌（metachronous MPLC，mMPLC）。据多个临床序列提供的数据显示，sMPLC 的估算发病率在 0.2%～8%[8]。近年来，随着早诊检查手段的普及（如 CT、PET），以及对肺癌综合治疗的深入探索，sMPLC 患者有了更高的检出率、更长的生存期[9]。然而，sMPLC 与肺癌肺内转移（intrapulmonary metastases）的鉴别诊断是一个长久存在的临床难题。由于二者预后、相应治疗方案的显著区别，建立临床工作中可遵循的诊断标准，并进一步探索二者预后差别背后的病理学、分子生物学机制，无疑是一个极具重要性的研究课题。
本文对 sMPLC 的诊断标准更新及相关理论的研究进展，包括临床病理诊断证据、分子遗传学特征及二者的比较、匹配，进行综述，以期为完善 sMPLC 的诊治策略带来启发。
1 sMPLC 诊断标准的更新及局限
1.1 sMPLC 概念及诊断标准的发展史
1975 年，Martini 和 Melamed [10]提出了MPLC的首个临床病理诊断标准。据 Martini-Melamed 诊断标准，对于解剖上分隔开的多个肿瘤病灶，若符合下列标准之一，则可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但符合下列条件：① 病灶起源于原位癌（carcinoma in situ，CIS）；② 病灶发生于不同肺段、不同肺叶或不同侧肺；③ 无共同引流的淋巴系统或肺外转移。如诊断为 MPLC 的病灶间的诊断间隔≤2 年，则划分为 sMPLC。
1995 年及 2003 年，Antakli等[11]及 Colice等[12] 对 Martini-Melamed 诊断标准进行了修订，符合下列标准之一的病灶可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但下列条件符合至少两个：① 解剖上独立；② 属癌前病变；③ 无全身转移；④ 无纵隔受累；⑤ DNA 倍体分析结果不同。区分 sMPLC 与 mMPLC 的诊断间隔标准变更为 4 年，癌灶的分子遗传学特征首次加入了诊断标准。
2007 年，美国胸科医师学会（ACCP）提出了 sMPLC 的诊断标准[6]，并在 2013 年作出了修订[7]，符合下列标准之一的病灶可被诊断为 MPLC：（1）病理组织类型不同；（2）多个病灶病理组织类型相同，但符合下列条件之一：① 分属不同肺叶，且无 N2、N3 受累、无全身转移；② 由解剖上分离的癌前病变发展而来；③ 有不同的分子遗传学特征。至此，sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值得到了再一次提高，但 ACCP 的指南中仍未明确“分子遗传学特征”的具体内容及标准（图1）。
图1
sMPLC 临床诊断标准更新及理念进化
1995～2003 年，Antakli-Colice 首次将癌灶的分子遗传学特征加入诊断标准；2007～2013 年，ACCP 不断提高分子遗传学特征的诊断价值，但具体内容及标准尚待明确；未来，对 sMPLC 分子遗传学特征的探究将有更加广阔的前景
2016 年，国际肺癌研究协会（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）提出现行 TNM 分期对于评价 sMPLC 有其局限性，建议在第 8 版 TNM 分期中对其进行特殊分期：T 分期为各单个病灶中最高的 T 分期，在其后标注病灶个数，N 分期和 M 分期则根据所有结节的总体淋巴结及全身转移情况制定，如“T2（3）N0M0”[13]。此后，尚无被广泛接受的 sMPLC 诊断标准在指南中被提出。
1.2 临床病理诊断的局限性
经过长时间的临床实践检验，单独的临床病理诊断呈现出了其局限性。即便是根据最为广泛应用的 Martini-Melamed 诊断标准，不同课题组据该标准区分出的 sMPLC 患者群体的生存率数据呈现出显著偏倚[14]。2010 年 Girard等[15]报道，同一组患者分别通过 Martini-Melamed 及 ACCP 标准进行 sMPLC 与肺癌肺内转移的鉴别诊断，结果也有较大偏差。ACCP 指南（2013 年版）中评论，临床病理诊断中观察到的这些偏倚，不仅由于部分诊断标准有赖于临床医生无法完全量化的主观判断，没有将 sMPLC 具体的分子遗传学特征纳入诊断标准也是因素之一[7]。第 8 版 TNM 分期的补充意见中也同样强调了分子遗传学特征对于 sMPLC 的诊断价值[13]。sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值逐渐成为研究热点。
2 sMPLC 分子遗传学特征的诊断价值
2011 年 Hanahan等[16]报道了恶性肿瘤的十大特征，并认为其中最根本的特征是“基因组的不稳定性和突变”，此特征赋予了恶性肿瘤细胞克隆性增殖的能力。因而，克隆性分析是对 sMPLC 分子遗传学特征分析的一个重要切入点。
经典的克隆性分析包括原癌基因或抑癌基因的体细胞突变（somatic mutations in oncogenes or tumor suppressor genes）分析、X-染色体的失活（X-chromosome inactivation）分析及杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析等分析手段[14, 17]。下文将从上述三方面对 sMPLC 的分子遗传学特征及其诊断价值进行综述。
2.1 原癌基因或抑癌基因的体细胞突变分析
“标记基因（genetic markers，或称 clonal markers）”是在恶性肿瘤的癌变过程中，早期发生、高频发生突变的基因，且该突变随恶性肿瘤细胞的复制能够稳定传递给子代细胞。位于 17 号染色体上的 p53 是一个抑癌基因，兼具作为标记基因的上述特征，且 p53 在小细胞肺癌及非小细胞肺癌中的突变发生率分别高达 70% 与 50%[18-19]。据报道，在 MPLC 中，p53 的突变可发生在该基因 DNA 结合区（5～8 外显子）的多个位点，且均为点突变[20]。因此，在多种多样的 p53 突变中，两个独立的癌灶有相同的 p53 突变的概率极低，这是通过原癌基因或抑癌基因的体细胞突变模式鉴别肿瘤来源的理论基础。早在 1993 年，此理论就已在鉴别诊断多原发头颈部肿瘤中得到了验证[21]。在诊断 MPLC 的研究中，p53 体细胞突变的诊断可靠性大概为 35%～66%[22]。不只是 p53，EGFR 与 KRAS 突变在非典型性腺瘤样增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）的病例中多有报道，倾向于被认为是肺癌发生过程中的早期事件[23]。同样，EGFR 及 KRAS 突变是随机发生的，且有极高的突变不一致性：如将 EGFR 与 KRAS 的突变状态组合分析，71%～83% 的 MPLC 患者表现出克隆性（clonality status）的不一致[23-24]，因此 EGFR/KRAS 也是被用于克隆性分析的标记基因[23-26]。有研究人员发现，27.9% 的多原发肺癌患者不同肿瘤灶中程序性死亡配体-1（PD-L1）表达水平存在差异，该比例远高于肺内转移患者（6.3%）[27]。
“分子标签”也可以是一组肺癌的相关热点突变。已有一项研究提出可通过结合病理诊断及 22 个肺癌热点基因的突变形式对肺癌肺内转移及 sMPLC 作出鉴别诊断。文中认为有不同驱动基因突变（包括 BRAF、EGFR、KRAS、NRAS、ERBB2、MET）的同期多灶肺癌可诊断为 sMPLC；在有相同突变的情况下，（1）如相同突变是肺癌的高频突变（包括 EGFR del 19、EGFR L858R、KRAS G12X），则根据病理划分肺内转移或 sMPLC；（2）如相同突变是罕见突变（包括 p53），则认为是肺内转移。本研究提出的诊断标准尚需大规模的前瞻性临床试验进行进一步验证[28]。
在临床应用中，对于根据病理组织类型证据就可诊断为 sMPLC 的病例，体细胞突变分析可验证其病理组织诊断，一致性高达 78%[29-30]；当癌灶病理组织类型相同、临床诊断存在难度时，分子遗传学特征可作为独立于临床证据的补充证据[31]。
需要特别指出的是，对于影像学表现为纯磨玻璃影的多个早期癌变，研究者常常排除淋巴或血性转移的可能，诊断为 sMPLC[13]，但近期有研究通过体细胞突变分析的手段，从分子遗传学特征的角度证明了气腔播散转移（spread through air spaces，STAS[32]）在此类多发磨玻璃影的“早期癌变”中存在的可能[33]。此发现也从另一角度提示，分子遗传学特征可用于研究肺癌发生发展的规律。
2.2 X-染色体的失活分析
在女性胚胎发育过程中，每个体细胞的两条 X 染色体中都有一条会随机失活，正常的女性组织中父本 X 染色体失活的细胞与母本 X 染色体失活的细胞随机分布，相互镶嵌，呈“马赛克”样。而在细胞克隆性增殖过程中，失活的 X 染色体会稳定传递到子代细胞中，因此同样可以作为一个克隆性标志。2009 年，Wang等[34]首次将 X-染色体失活分析法运用于一个 MPLC 临床序列，临床诊断为 sMPLC 或 mMPLC 的入组患者中，78% 的患者呈现出了一致的 X 染色体失活模式，因此该组患者中很大可能有误诊为 MPLC 的肺内转移患者，X 染色体的失活分析揭示了临床病理学诊断的局限性。
但 X-染色体失活分析的主要局限性在于：（1）仅可运用于女性患者中；（2）即便是克隆性不一致的两个癌灶，也有 50% 的可能，因为 X 染色体失活的随机性，呈现出同样的 X 染色体失活模式[35]。
2.3 杂合性缺失分析
据二次打击假说（Knudson's two hit hypothesis），细胞中携带一个等位基因上的生殖细胞系突变（germ-line heterozygosity）是发生癌变的基础，若第二个等位基因上发生二次突变，细胞成为体细胞突变纯合子（somatic homozygosity），导致抑癌基因彻底失活，细胞则发生癌变[36]，上述过程称为杂合性缺失。LOH 分析中，正常组织因为父本与母本来源的基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）或微卫星（microsatellite）位点多态性的不一致呈现出杂合性，而同一克隆来源的癌灶则会表现出相同的 LOH 模式[37]。已有报道通过 LOH 分析可成功区别病理组织类型相同的 sMPLC 与肺内转移灶[38-39]，通过与 p53 突变模式结合，此种分子遗传学诊断方法的特异性及敏感性可得到进一步提高[17]。
3 分子遗传性特征分析的潜在问题
无论是通过何种分子生物学技术对癌灶进行分子遗传学特征的探究，一个始终需要回答的问题是肿瘤的异质性（intratumoral heterogeneity）。2012 年，《新英格兰医学杂志》刊发了肾癌相关研究中肿瘤内部的异质性，及随肿瘤发展进化出现的异质性[40]。通过 DNA 测序分析，多个肺癌相关基因，包括 EGFR、KRAS、ERBB2，均呈现出了肿瘤异质性，并主要见于肺腺癌标本[41-43]。这种异质性或许能够部分解释部分肺癌患者对于治疗反应的差异，但同时也提示，sMPLC 分子遗传学特征的临床应用仍需要更多深入的研究[44-45]。
4 小结与展望
经过 30 余年的探索，sMPLC 的诊断标准多次更新，仅依照肿瘤的组织病理学特征无法明确区分 sMPLC 与肺内转移瘤，分子遗传学特征的诊断价值逐渐得到重视和强调。以克隆性分析领域取得的进展为例，对 sMPLC 的分子遗传学特征进行描述和机制探索，不仅可以补充完善临床病理诊断标准，在揭示 sMPLC 的发生发展规律方面也有广阔的前景，有望辅助定义 sMPLC 的疾病性质。
利益冲突：无。
作者贡献：宋洋设计论文、检索文献、撰写初稿；梁乃新、李单青设计论文、修改论文终稿；杨笑盈、贾梓淇检索及分析文献； 邴钟兴、曹磊、曹智理和郭超对论文进行了审阅与修改。
