引用本文： 王灵杰, 赵懂华, 黄章锋, 李蒙君, 国鹏飞, 王勇杰. 替米沙坦通过Wnt/β-catenin信号通路影响非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和凋亡的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2022, 29(1): 100-105. doi: 10.7507/1007-4848.202010077 复制
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，并且呈逐年递增的趋势，全球每年约有 180 万的新发肺癌患者，约占全部类型肿瘤发生率的 12.9%。在 2012 年全球约有 160 万人因肺癌死亡，占全部类型肿瘤死亡的 19.4%[1]。临床上主要将肺癌分为小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌，其中非小细胞肺癌约占 80%。目前对非小细胞性肺癌的治疗为综合治疗，主要包括手术、放化疗和靶向治疗，但非小细胞性肺癌的 5 年生存率仅为 4%～17% [2-3]。所以急需寻找治疗非小细胞肺癌新的治疗方式。
替米沙坦是一种血管紧张素受体抑制剂，通过作用于血管紧张素受体 1 起到降血压的作用。近年来，不断有研究报道替米沙坦具有抗肿瘤的作用，可以在体内和体外起到抑制卵巢癌[4]、胃癌[5]、前列腺癌[6]细胞的作用，有少量研究报道替米沙坦单独应用或者与其它抗肿瘤药物共同应用在动物实验中具有抗肺癌的作用[7-8]，但其具体分子机制仍未完全明确，有进一步研究的价值。
Wnt 信号通路是一个高度保守的控制许多细胞功能的蛋白家族，可以影响器官的形成，干细胞的更新以及细胞的存活等。Wnt 信号通路在许多疾病中都起到重要作用，如中枢神经系统损伤、骨折以及各种类型的肿瘤等。Wnt 信号通路在肺癌中呈高表达状态，在动物实验中使用 Wnt 信号通路抑制剂可以抑制肿瘤的增大[9]。因此 Wnt 信号通路是非小细胞肺癌的一个潜在治疗靶点。
为了研究替米沙坦是否可以作为肺癌的治疗药物及其作用机制，我们进行了本次研究，结果发现替米沙坦在体外可以有效抑制肺癌细胞的增殖活性、迁徙和侵袭能力，并且能促进凋亡的发生。并且这一效应可能是部分通过 Wnt/β-catenin 信号通路产生的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
非小细胞肺癌细胞株 A549 购买自中国科学院细胞生物科学研究所。替米沙坦购自上海邦葳生物科技有限公司（Rhawn，R029372-1G），胎牛血清购自杭州昊鑫生物科技公司，DMEM 完全培养基、CCK-8 试剂盒、Hoechst 试剂盒购自上海邦葳生物科技有限公司。β-肌动蛋白（β-actin）（# 4970S）、增殖细胞核抗原（PCNA）（# 13110S）、Bax（# 89477S）、Bcl-2（# 15071S）、β-连环蛋白（β-catenin）（# 8480S）、丝氨酸蛋白激酶3β（p-GSK-3β）（# 5558S）、糖原合成酶及酶-3β（GSK-3β）（# 12456S）、Wnt-3a（# 2721S）、c-myc（# 18583S）等抗体购买自 Cell Signaling Technology。
1.2 细胞培养
非小细胞肺癌细胞株 A549 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养，培养环境为 37℃，5% 二氧化碳培养箱。隔天换液，取对数生长期的细胞用于实验。替米沙坦溶于二甲基亚砜，二甲基亚砜的最终浓度小于 0.1%。
1.3 CCK-8 法细胞增殖实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 96 孔板中，每孔 5×103个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。加入不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，每个浓度设置 4 个复孔，分别培养 24 h、48 h 后，吸掉 96 孔板内原有培养液，加入 CCK-8 溶液 10 μL，37℃ 下孵育 1 h，酶标仪 452 nm 波长下检测各孔吸光度，利用公式计算细胞生长抑制率。
1.4 克隆形成实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 6 孔板中，每孔 800 个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。加入不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，每 3 d 换液一次，2 周后吸去原有培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 2 次，使用多聚甲醛固定 1 h，结晶紫染色 2 h，拍照后，显微镜下进行克隆集落计数细胞数>50 个的集落。
1.5 划痕实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 6 孔板中，每孔 2×105个，置于 37℃ 培养箱中培养 48 h。当细胞密度达到 100% 时，用 200 μL 的枪头在培养皿上垂直划过。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，在不同的时间点（0 h、24 h、48 h）显微镜下观察划痕的愈合情况。
1.6 Hoechst 染色分析
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 24 孔板中，每孔 5×104个，置于 37℃ 培养箱中培养 48 h。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，根据试剂盒说明书进行 Hoechst 染色，在荧光显微镜下观察细胞的形态改变。
1.7 蛋白免疫印迹实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 24 孔板中，每孔 1×105个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理 24 h，弃去原有培养液，PBS 冲洗 2 次，加入 RIPA 裂解液 200 μL 使细胞充分裂解，冰上裂解 30 min，使用细胞刮板，将细胞及溶液刮到一侧，收集溶液后，4℃ 离心收集上清液，100℃ 金属浴煮沸 5 min，每个上样孔取 20 μg 蛋白量，进行蛋白凝胶电泳，根据电泳、转膜、封闭、一抗孵育（工作浓度：β-actin 1∶1000、PCNA 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-catenin 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、GSK-3β 1∶1000、Wnt-3a 1∶1000、c-myc 1∶1000）、二抗孵育、ECL 显色的顺序进行蛋白免疫印迹实验。利用凝胶成像仪发光成像，Image J 软件进行灰度分析。
1.8 统计学分析
实验数据使用 SPSS 18.0 统计软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 替米沙坦抑制 A549 细胞增殖
CCK-8 实验说明，替米沙坦可以明显抑制 A549 细胞的增殖能力，并存在浓度依赖性和时间依赖性，低浓度组相对于对照组有明显的抑制效果，高浓度组的抑制效果优于低浓度组，差异有统计学意义；见图 1。克隆形成实验显示替米沙坦明显降低 A549 细胞的克隆形成，差异有统计学意义；见图 2。Western blotting 结果显示替米沙坦降低 PCNA 的表达水平，具有一定的浓度依赖性；见图 3。以上结果表明替米沙坦可以抑制 A549 细胞的增殖能力。
图1
CCK-8 法检测替米沙坦对 A549 细胞的增殖活性抑制情况
**表示与 0 μM 组相比，
图2
克隆形成实验检测替米沙坦对 A549 细胞集落形成能力的抑制情况
**表示与 0 μM 组相比，
图3
Western blotting法检测替米沙坦对增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响
2.2 替米沙坦抑制 A549 细胞迁移
细胞划痕实验显示，替米沙坦可以抑制 A549 细胞的迁移能力，并存在剂量依赖性，高浓度的替米沙坦对细胞迁移能力的抑制效果更强，差异有统计学意义；见图 4。
图4
划痕实验检测替米沙坦对 A549 细胞迁移能力的影响
**表示与 0 μM 组相比，
2.3 替米沙坦促进 A549 细胞凋亡
Hoechst 染色显示替米沙坦处理 48 h后，细胞的形态较正常组之间有差异性，替米沙坦处理组出现了更多的细胞和细胞核的皱缩；见图 5。Western blotting 结果显示，替米沙坦可以促进 Bax 的表达，抑制 Bcl-2 的表达，存在剂量依赖性，以上结果说明替米沙坦可以促进 A549 细胞的凋亡，且浓度与促凋亡效果正相关；见图 6。
图5
Hoechst 染色检测替米沙坦对 A549 凋亡的影响
图6
Western blotting 法检测 Bax 和 Bcl-2 的表达情况
2.4 替米沙坦抑制 Wnt 信号通路
Western blotting结果显示替米沙坦处理可以明显抑制 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 的表达，增加 GSK-3β 的表达，说明替米沙坦可以抑制 A549 细胞中的 Wnt/β-catenin 信号通路；见图 7。
图7
Western blotting 法检测 β-catenin、c-myc、Wnt-3a、p-GSK-3β、GSK-3β 的表达情况
3 讨论
近年来，传统老药，如阿司匹林和二甲双胍，在传统应用领域外的研究已成为新的热点，研究人员不断发现老药有新的治疗潜力。替米沙坦是一种血管紧张素受体抑制剂，广泛应用于心血管疾病的治疗[10]，但替米沙坦在人体内的应用是否会导致肿瘤发生率的增高仍存在争议，有临床研究[11]表明替米沙坦控制血压的短期应用十分安全，不会引起肿瘤发生率的增高。另外，一项 Meta 分析[12]报道称包括替米沙坦在内的血管紧张素受体抑制剂的应用可能会导致新发癌症的风险轻度增加，肺癌的新发风险明显增加。尽管如此，近些年仍不断有研究[5, 13-17]报道，替米沙坦单独应用或与抗肿瘤药物合用在动物实验和细胞实验中可以抑制黑色素瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、胃肠道间质瘤的生长。基础研究[18]显示，替米沙坦可以在动物模型上改善肿瘤的灌注，减少短暂性缺氧的发生，改善肿瘤对放疗的敏感性。如在肺癌的基础研究中，替米沙坦单独应用可以通过 PPARgamma、P13K/AKT、TRAIL 抑制肺癌细胞的生长[8, 19-20]，替米沙坦与多西他赛合用可以明显抑制裸鼠肿瘤的生长，改善肿瘤细胞的耐药性[21]。替米沙坦促进荧光聚苯乙烯纳米颗粒在肿瘤内的分布情况，说明替米沙坦有肿瘤治疗药物的潜力，可以促进纳米颗粒包裹的化疗药物达到肿瘤区域[22]。Martínez 等[23]对利用锌元素与替米沙坦进行复合，制成新的复合物，可以显著促进其诱导肺肿瘤细胞凋亡的效果，并对非肿瘤细胞无毒性作用。
在本研究中，我们将替米沙坦应用于非小细胞肺癌 A549 细胞，CCK-8 细胞增殖实验结果说明替米沙坦可以抑制 A549 细胞的增殖，并且 PCNA 的表达水平受到抑制，具有时间和浓度依赖性。PCNA 是一种与细胞活性相关的蛋白，其表达水平越高，细胞的活性程度越高，因此替米沙坦可以有效抑制 A549 细胞的增殖活性。在细胞迁移实验中，替米沙坦可以明显抑制 A549 细胞的迁移能力。Hoechst 和 Western blotting 的实验结果证明，替米沙坦可以明显促进 A549 细胞的凋亡。Western blotting 的结果显示，经替米沙坦处理后，Wnt 信号通路的关键蛋白 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 表达下降，GSK-3β 表达增多，p-GSK-3β/GSK-3β 的比例下降，说明 Wnt 信号通路受到抑制。Wnt 信号通路是一个与胚胎、器官发育密切相关的信号家族，在肿瘤的增殖与转移中起到重要作用，与肿瘤干细胞关系密切。此前有相关学者研究发现替米沙坦具有抗肺癌的作用，但均无直接证据显示替米沙坦在肺癌中对 Wnt 信号通路的影响。Green 等[7]研究发现放线菌素与替米沙坦合用直接注射到裸鼠肿瘤模型肿瘤区域，可以明显抑制裸鼠肿瘤的生长，并且可以降低 β-catenin 的表达水平。但并没有证明替米沙坦可以直接抑制肺癌中 Wnt 信号通路的表达。我们的研究直接证明了替米沙坦可以通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路有效抑制肺癌细胞的增殖、迁移和促进凋亡。
本次研究有以下几点不足：（1）我们没有研究替米沙坦对肺癌细胞化疗耐药的影响。肺癌治疗的失败与肺癌化疗后期产生的耐药性关联密切，耐药性产生的一个重要原因是肿瘤干细胞的存在，在化疗的过程中，肿瘤干细胞不断向耐化疗药物的表型分化，以至化疗药物在后期无法产生好的疗效。（2）没有分析替米沙坦对肺癌干细胞的影响，Wnt 信号通路对维持肿瘤干细胞的特性具有十分重要的作用[24]，在本研究中，我们证明替米沙坦可以通过 Wnt 信号通路抑制肺癌，但我们没有进一步探究替米沙坦是否通过 Wnt 信号通路起到抑制肺癌干细胞的作用。（3）我们没有进行体内实验以及关注替米沙坦治疗肿瘤的安全性。有研究[25]发现替米沙坦在小鼠肿瘤模型中会加剧顺铂诱导的肾毒性，因此有必要关注在肿瘤治疗过程中，替米沙坦是否会产生或者影响化疗药物带来的毒性反应。
替米沙坦可能在非小细胞肺癌 A549 的增殖、迁移和凋亡中起到作用，抑制 Wnt/β-catenin 信号通路可能是其中的一个机制。但仍需更深入的研究，比如动物实验、耐药性实验、肿瘤干细胞实验。
利益冲突：无。
作者贡献：王灵杰负责实验设计及参与全部实验；赵懂华及黄章锋负责细胞实验；李蒙君及国鹏飞负责分子生物学实验；王勇杰负责实验设计及文章审校。
肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤，并且呈逐年递增的趋势，全球每年约有 180 万的新发肺癌患者，约占全部类型肿瘤发生率的 12.9%。在 2012 年全球约有 160 万人因肺癌死亡，占全部类型肿瘤死亡的 19.4%[1]。临床上主要将肺癌分为小细胞性肺癌和非小细胞性肺癌，其中非小细胞肺癌约占 80%。目前对非小细胞性肺癌的治疗为综合治疗，主要包括手术、放化疗和靶向治疗，但非小细胞性肺癌的 5 年生存率仅为 4%～17% [2-3]。所以急需寻找治疗非小细胞肺癌新的治疗方式。
替米沙坦是一种血管紧张素受体抑制剂，通过作用于血管紧张素受体 1 起到降血压的作用。近年来，不断有研究报道替米沙坦具有抗肿瘤的作用，可以在体内和体外起到抑制卵巢癌[4]、胃癌[5]、前列腺癌[6]细胞的作用，有少量研究报道替米沙坦单独应用或者与其它抗肿瘤药物共同应用在动物实验中具有抗肺癌的作用[7-8]，但其具体分子机制仍未完全明确，有进一步研究的价值。
Wnt 信号通路是一个高度保守的控制许多细胞功能的蛋白家族，可以影响器官的形成，干细胞的更新以及细胞的存活等。Wnt 信号通路在许多疾病中都起到重要作用，如中枢神经系统损伤、骨折以及各种类型的肿瘤等。Wnt 信号通路在肺癌中呈高表达状态，在动物实验中使用 Wnt 信号通路抑制剂可以抑制肿瘤的增大[9]。因此 Wnt 信号通路是非小细胞肺癌的一个潜在治疗靶点。
为了研究替米沙坦是否可以作为肺癌的治疗药物及其作用机制，我们进行了本次研究，结果发现替米沙坦在体外可以有效抑制肺癌细胞的增殖活性、迁徙和侵袭能力，并且能促进凋亡的发生。并且这一效应可能是部分通过 Wnt/β-catenin 信号通路产生的。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
非小细胞肺癌细胞株 A549 购买自中国科学院细胞生物科学研究所。替米沙坦购自上海邦葳生物科技有限公司（Rhawn，R029372-1G），胎牛血清购自杭州昊鑫生物科技公司，DMEM 完全培养基、CCK-8 试剂盒、Hoechst 试剂盒购自上海邦葳生物科技有限公司。β-肌动蛋白（β-actin）（# 4970S）、增殖细胞核抗原（PCNA）（# 13110S）、Bax（# 89477S）、Bcl-2（# 15071S）、β-连环蛋白（β-catenin）（# 8480S）、丝氨酸蛋白激酶3β（p-GSK-3β）（# 5558S）、糖原合成酶及酶-3β（GSK-3β）（# 12456S）、Wnt-3a（# 2721S）、c-myc（# 18583S）等抗体购买自 Cell Signaling Technology。
1.2 细胞培养
非小细胞肺癌细胞株 A549 使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养，培养环境为 37℃，5% 二氧化碳培养箱。隔天换液，取对数生长期的细胞用于实验。替米沙坦溶于二甲基亚砜，二甲基亚砜的最终浓度小于 0.1%。
1.3 CCK-8 法细胞增殖实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 96 孔板中，每孔 5×103个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。加入不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，每个浓度设置 4 个复孔，分别培养 24 h、48 h 后，吸掉 96 孔板内原有培养液，加入 CCK-8 溶液 10 μL，37℃ 下孵育 1 h，酶标仪 452 nm 波长下检测各孔吸光度，利用公式计算细胞生长抑制率。
1.4 克隆形成实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 6 孔板中，每孔 800 个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。加入不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，每 3 d 换液一次，2 周后吸去原有培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 2 次，使用多聚甲醛固定 1 h，结晶紫染色 2 h，拍照后，显微镜下进行克隆集落计数细胞数>50 个的集落。
1.5 划痕实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 6 孔板中，每孔 2×105个，置于 37℃ 培养箱中培养 48 h。当细胞密度达到 100% 时，用 200 μL 的枪头在培养皿上垂直划过。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，在不同的时间点（0 h、24 h、48 h）显微镜下观察划痕的愈合情况。
1.6 Hoechst 染色分析
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 24 孔板中，每孔 5×104个，置于 37℃ 培养箱中培养 48 h。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理，根据试剂盒说明书进行 Hoechst 染色，在荧光显微镜下观察细胞的形态改变。
1.7 蛋白免疫印迹实验
取对数生长期的 A549 细胞，接种于 24 孔板中，每孔 1×105个，置于 37℃ 培养箱中培养 24 h。用不同浓度（0 μM、10 μM、20 μM、40 μM）的替米沙坦溶液进行处理 24 h，弃去原有培养液，PBS 冲洗 2 次，加入 RIPA 裂解液 200 μL 使细胞充分裂解，冰上裂解 30 min，使用细胞刮板，将细胞及溶液刮到一侧，收集溶液后，4℃ 离心收集上清液，100℃ 金属浴煮沸 5 min，每个上样孔取 20 μg 蛋白量，进行蛋白凝胶电泳，根据电泳、转膜、封闭、一抗孵育（工作浓度：β-actin 1∶1000、PCNA 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-catenin 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、GSK-3β 1∶1000、Wnt-3a 1∶1000、c-myc 1∶1000）、二抗孵育、ECL 显色的顺序进行蛋白免疫印迹实验。利用凝胶成像仪发光成像，Image J 软件进行灰度分析。
1.8 统计学分析
实验数据使用 SPSS 18.0 统计软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P≤0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 替米沙坦抑制 A549 细胞增殖
CCK-8 实验说明，替米沙坦可以明显抑制 A549 细胞的增殖能力，并存在浓度依赖性和时间依赖性，低浓度组相对于对照组有明显的抑制效果，高浓度组的抑制效果优于低浓度组，差异有统计学意义；见图 1。克隆形成实验显示替米沙坦明显降低 A549 细胞的克隆形成，差异有统计学意义；见图 2。Western blotting 结果显示替米沙坦降低 PCNA 的表达水平，具有一定的浓度依赖性；见图 3。以上结果表明替米沙坦可以抑制 A549 细胞的增殖能力。
图1
CCK-8 法检测替米沙坦对 A549 细胞的增殖活性抑制情况
**表示与 0 μM 组相比，
图2
克隆形成实验检测替米沙坦对 A549 细胞集落形成能力的抑制情况
**表示与 0 μM 组相比，
图3
Western blotting法检测替米沙坦对增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响
2.2 替米沙坦抑制 A549 细胞迁移
细胞划痕实验显示，替米沙坦可以抑制 A549 细胞的迁移能力，并存在剂量依赖性，高浓度的替米沙坦对细胞迁移能力的抑制效果更强，差异有统计学意义；见图 4。
图4
划痕实验检测替米沙坦对 A549 细胞迁移能力的影响
**表示与 0 μM 组相比，
2.3 替米沙坦促进 A549 细胞凋亡
Hoechst 染色显示替米沙坦处理 48 h后，细胞的形态较正常组之间有差异性，替米沙坦处理组出现了更多的细胞和细胞核的皱缩；见图 5。Western blotting 结果显示，替米沙坦可以促进 Bax 的表达，抑制 Bcl-2 的表达，存在剂量依赖性，以上结果说明替米沙坦可以促进 A549 细胞的凋亡，且浓度与促凋亡效果正相关；见图 6。
图5
Hoechst 染色检测替米沙坦对 A549 凋亡的影响
图6
Western blotting 法检测 Bax 和 Bcl-2 的表达情况
2.4 替米沙坦抑制 Wnt 信号通路
Western blotting结果显示替米沙坦处理可以明显抑制 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 的表达，增加 GSK-3β 的表达，说明替米沙坦可以抑制 A549 细胞中的 Wnt/β-catenin 信号通路；见图 7。
图7
Western blotting 法检测 β-catenin、c-myc、Wnt-3a、p-GSK-3β、GSK-3β 的表达情况
3 讨论
近年来，传统老药，如阿司匹林和二甲双胍，在传统应用领域外的研究已成为新的热点，研究人员不断发现老药有新的治疗潜力。替米沙坦是一种血管紧张素受体抑制剂，广泛应用于心血管疾病的治疗[10]，但替米沙坦在人体内的应用是否会导致肿瘤发生率的增高仍存在争议，有临床研究[11]表明替米沙坦控制血压的短期应用十分安全，不会引起肿瘤发生率的增高。另外，一项 Meta 分析[12]报道称包括替米沙坦在内的血管紧张素受体抑制剂的应用可能会导致新发癌症的风险轻度增加，肺癌的新发风险明显增加。尽管如此，近些年仍不断有研究[5, 13-17]报道，替米沙坦单独应用或与抗肿瘤药物合用在动物实验和细胞实验中可以抑制黑色素瘤、食管癌、胃癌、乳腺癌、胃肠道间质瘤的生长。基础研究[18]显示，替米沙坦可以在动物模型上改善肿瘤的灌注，减少短暂性缺氧的发生，改善肿瘤对放疗的敏感性。如在肺癌的基础研究中，替米沙坦单独应用可以通过 PPARgamma、P13K/AKT、TRAIL 抑制肺癌细胞的生长[8, 19-20]，替米沙坦与多西他赛合用可以明显抑制裸鼠肿瘤的生长，改善肿瘤细胞的耐药性[21]。替米沙坦促进荧光聚苯乙烯纳米颗粒在肿瘤内的分布情况，说明替米沙坦有肿瘤治疗药物的潜力，可以促进纳米颗粒包裹的化疗药物达到肿瘤区域[22]。Martínez 等[23]对利用锌元素与替米沙坦进行复合，制成新的复合物，可以显著促进其诱导肺肿瘤细胞凋亡的效果，并对非肿瘤细胞无毒性作用。
在本研究中，我们将替米沙坦应用于非小细胞肺癌 A549 细胞，CCK-8 细胞增殖实验结果说明替米沙坦可以抑制 A549 细胞的增殖，并且 PCNA 的表达水平受到抑制，具有时间和浓度依赖性。PCNA 是一种与细胞活性相关的蛋白，其表达水平越高，细胞的活性程度越高，因此替米沙坦可以有效抑制 A549 细胞的增殖活性。在细胞迁移实验中，替米沙坦可以明显抑制 A549 细胞的迁移能力。Hoechst 和 Western blotting 的实验结果证明，替米沙坦可以明显促进 A549 细胞的凋亡。Western blotting 的结果显示，经替米沙坦处理后，Wnt 信号通路的关键蛋白 Wnt-3a、β-catenin、c-myc、p-GSK-3β 表达下降，GSK-3β 表达增多，p-GSK-3β/GSK-3β 的比例下降，说明 Wnt 信号通路受到抑制。Wnt 信号通路是一个与胚胎、器官发育密切相关的信号家族，在肿瘤的增殖与转移中起到重要作用，与肿瘤干细胞关系密切。此前有相关学者研究发现替米沙坦具有抗肺癌的作用，但均无直接证据显示替米沙坦在肺癌中对 Wnt 信号通路的影响。Green 等[7]研究发现放线菌素与替米沙坦合用直接注射到裸鼠肿瘤模型肿瘤区域，可以明显抑制裸鼠肿瘤的生长，并且可以降低 β-catenin 的表达水平。但并没有证明替米沙坦可以直接抑制肺癌中 Wnt 信号通路的表达。我们的研究直接证明了替米沙坦可以通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路有效抑制肺癌细胞的增殖、迁移和促进凋亡。
本次研究有以下几点不足：（1）我们没有研究替米沙坦对肺癌细胞化疗耐药的影响。肺癌治疗的失败与肺癌化疗后期产生的耐药性关联密切，耐药性产生的一个重要原因是肿瘤干细胞的存在，在化疗的过程中，肿瘤干细胞不断向耐化疗药物的表型分化，以至化疗药物在后期无法产生好的疗效。（2）没有分析替米沙坦对肺癌干细胞的影响，Wnt 信号通路对维持肿瘤干细胞的特性具有十分重要的作用[24]，在本研究中，我们证明替米沙坦可以通过 Wnt 信号通路抑制肺癌，但我们没有进一步探究替米沙坦是否通过 Wnt 信号通路起到抑制肺癌干细胞的作用。（3）我们没有进行体内实验以及关注替米沙坦治疗肿瘤的安全性。有研究[25]发现替米沙坦在小鼠肿瘤模型中会加剧顺铂诱导的肾毒性，因此有必要关注在肿瘤治疗过程中，替米沙坦是否会产生或者影响化疗药物带来的毒性反应。
替米沙坦可能在非小细胞肺癌 A549 的增殖、迁移和凋亡中起到作用，抑制 Wnt/β-catenin 信号通路可能是其中的一个机制。但仍需更深入的研究，比如动物实验、耐药性实验、肿瘤干细胞实验。
利益冲突：无。
作者贡献：王灵杰负责实验设计及参与全部实验；赵懂华及黄章锋负责细胞实验；李蒙君及国鹏飞负责分子生物学实验；王勇杰负责实验设计及文章审校。
