引用本文： 张文, 谷天祥. 不同年龄 A 型主动脉夹层患者 Sirtuin1表达差异的研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(4): 622-626. doi: 10.7507/1007-4848.202103016 复制
A 型主动脉夹层指主动脉腔内的高压血流从主动脉内膜撕裂口进入主动脉中膜，使中膜分离，并沿主动脉长轴方向扩展，从而导致主动脉真假两腔的一种病理学改变，是心脏外科急诊中十分凶险的疾病[1]。目前，主动脉夹层的病因仍不明确。流行病学调查[2]指出，65 岁以上的人群主动脉夹层发生率较高，这说明衰老是主动脉夹层的危险因素之一。然而，临床上 A 型主动脉夹层患者年轻化也成为一种趋势。所以年龄和主动脉夹层之间各机制的作用关系还有待研究。
作为一种公认的长寿因子，Sirtuin1（SIRT1）在心血管疾病中起着重要作用。研究[3-4]指出，SIRT1 在血管中的表达随着年龄的增长而降低，但 SIRT1 在主动脉夹层血管中是否也具有年龄依赖性还有待研究。为此，我们研究了不同年龄主动脉夹层患者主动脉壁中 SIRT1 表达是否有差异，为将来是否可将 SIRT1 作为主动脉夹层预测因子提供证据。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
纳入 2019—2020 年在中国医科大学附属第一医院接受手术治疗的 A 型主动脉夹层患者为夹层组，行冠状动脉（冠脉）旁路移植术的冠脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者为对照组。经胸腹主动脉 CT 血管造影（CT angiography，CTA）、冠脉 CTA 等影像学检查，明确主动脉夹层的诊断。排除马方综合征患者或者其他遗传性血管疾病患者。<45 岁的患者纳入低年龄组，45～60 岁的患者纳入中年龄组，>60 岁的患者纳入高年龄组。患者临床资料见表 1。
表1
各组患者临床资料比较［例（%）/
］
1.2 组织样本的收集与存储
所有样本均为术中收集的新鲜主动脉壁组织，其中对照组取冠脉旁路移植术时主动脉打孔处的主动脉壁组织，于无酶标本袋中编号后，通过液氮罐转移至−80℃ 超低温冰箱保存。
1.3 实验主要试剂
主要试剂包括：SIRT1 mRNA 引物及内参基因 GAPDH （上海生工）、反转录试剂（TAKARA 公司）、SIRT1 抗体（CST 公司）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）抗体（万类生物）、BCA 蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、一抗稀释液等（上海碧云天）。
1.4 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）
取黄豆大小的组织，液氮研磨后采用 TRIZOL 法提取组织总 RNA，去 DNA 反应后通过反转录得到 cDNA 溶液，实验设置 3 个复孔，采用 Thermal Cycler DiceTM Real Time 进行 qRT-PCR 反应，得到 CT 值，并计算 2−ΔΔCT 值。
1.5 Western blotting 检测
取黄豆大小组织，组织匀浆后采用 RIPA Lysis Buffer 提取组织总蛋白，通过 BCA 蛋白质测定试剂盒定量总蛋白质浓度。根据目标蛋白的相对分子质量选择对应浓度的分离胶（8%分离胶：SIRT1；10%分离胶：MCP-1、GAPDH），浓缩胶均为 5%浓度。电泳后，将蛋白质转移到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭后，将膜与一抗在 4℃ 条件下孵育 24 h（SIRT1，1∶1000；MCP-1，1∶500）。洗膜后，孵育二抗，最后采用化学发光试剂显色。通过 Micro.Chemi 化学发光型凝胶成像系统进行图像采集。运用 Image J 软件计算上述蛋白的平均光密度值，将各组平均光密度值除以内参蛋白 GAPDH 的平均光密度值获取各目标蛋白的相对表达量。
1.6 免疫组织化学染色
通过免疫组织化学染色检测主动脉壁组织中 SIRT1 蛋白的表达。4% 多聚甲醛固定组织后，OCT 包埋，制作冰冻切片。用 3% 的过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性，10% 正常山羊血清封闭，一抗孵育过夜（SIRT1，1∶500），PBS 洗片后滴加二抗工作液，然后显色剂显色，苏木素复染，流水冲洗 1 min 后盐酸酒精分化数秒，酒精梯度脱水后中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
1.7 统计学分析
采用 SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
±s）描述，组间比较采用one-way ANOVA 分析。计数资料以频数（%）描述，组间比较采用χ2检验。 P≤0.05 为差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准，批准号：[2018]2018-149-2。
2 结果
2.1 SIRT1 mRNA 的表达
夹层组患者的 SIRT1 mRNA 表达量比对照组低，差异有统计学意义（P<0.001）。同时，SIRT1 mRNA 表达量在主动脉夹层患者中随年龄的增长呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.01）；见表2。
表2
各组患者 SIRT1 和 MCP-1 表达量比较（
）
2.2 SIRT1 及 MCP-1 蛋白的表达
通过 Western blotting 检测各组 SIRT1 和 MCP-1 的蛋白表达。与对照组相比，SIRT1 蛋白在主动脉夹层样本中低表达（P<0.01）；与低年龄夹层患者相比，SIRT1 蛋白在中年龄和高年龄夹层患者样本中表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）。在低年龄和中年龄患者样本中，夹层组 MCP-1 蛋白表达量较对照组多，差异有统计学意义（P<0.001）。与低年龄组相比，MCP-1 蛋白表达量在主动脉夹层患者中随着年龄的增长呈上升趋势，差异有统计学意义（P<0.001）；见图1、表 2。通过免疫组织化学染色检验主动脉壁组织样本中的 SIRT1 蛋白，结果显示：与对照组相比，夹层组 SIRT1 表达量降低（P<0.05）；与低年龄夹层样本相比，SIRT1 蛋白在中年龄和高年龄夹层样本中表达量降低，差异有统计学意义（P<0.01）；见图2、表 2。
图1
Sirtuin1和 MCP-1 蛋白的表达情况
MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1
图2
SIRT1 蛋白在组织的表达情况
3 讨论
主动脉夹层是一种十分凶险的心血管疾病，发病率呈逐年上升趋势。夹层破裂前一般无明显的症状和体征，夹层破裂后其主要表现通常是胸部剧烈撕裂样疼痛，目前仍缺少有效的预防筛查措施[5]。
根据研究[3, 6-7]，SIRT1 在心血管组织中起着重要的作用，包括抑制氧化应激，减少炎症、泡沫细胞形成，抵抗细胞衰老等。SIRT1 还能够提高平滑肌细胞的功能，在主动脉夹层的进展过程中起作用。有研究[4]指出，随着年龄的增长，SIRT1 的表达水平受到显著影响。SIRT1 在年轻和年老患者中所表现出的内源性差异作用包括对细胞周期和细胞增殖的调节，这一点对主动脉夹层的进展尤为重要。但对于年轻夹层患者，SIRT1 在其主动脉壁中的表达是否降低尚无相关研究。
行冠脉旁路移植术时，主动脉壁打孔处多选在主动脉壁柔软有弹性处，尽量避免选取钙化等粥样硬化改变的部位，所以本研究选取这部分组织作为对照组。尤其对于年轻的冠心病患者，其主动脉壁可以看作是正常的主动脉壁组织。测定这部分组织的 SIRT1 表达可以一定程度代表此年龄段正常人的 SIRT1 表达情况。
本研究还测定了组织中 MCP-1 蛋白的表达。MCP-1 属于 CC 趋化因子家族的一个小细胞因子，在机体炎症时，血管平滑肌细胞可分泌 MCP-1 因子[8]。研究[9]发现，MCP-1 在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用，且 SIRT1 和 MCP-1 之间存在负性调控关系。SIRT1 可通过多个信号通路抑制 MCP-1 的表达，包括 NF-κB/SIRT1/AMPK 和 TNF-α/SIRT1/MCP-1 等信号通路[10-11]。本研究中，与对照组比较，夹层组中所有年龄段患者SIRT1均呈低表达，MCP-1在低年龄组及中年龄组夹层患者呈高表达趋势，而在高年龄夹层患者中无表达增高。我们推测其可能的原因是：随着年龄的增长，主动脉出现脂质斑块、钙化等粥样硬化改变的几率增加，MCP-1在粥样硬化组织中表达增高[9]，所以高年龄组中，即使不存在主动脉夹层改变，其MCP-1的表达也可能升高，因此两组差异无统计学意义。在低年龄组及中年龄组中，主动脉壁组织脂质沉积、粥样硬化的几率较低，其MCP-1的表达主要受SIRT1调控，提示主动脉夹层发生发展中炎性反应可能发挥重要作用。
相关研究[8]指出，主动脉夹层患者主动脉壁组织的 SIRT1 较周围相对正常的血管呈低表达趋势。但在 A 型主动脉夹层中，SIRT1 在高龄患者和年轻患者中是否有表达差异尚无相关研究。本研究首次从 mRNA 和蛋白质学层面分析了在 A 型主动脉夹层中，人体主动脉壁组织 SIRT1 在不同年龄的表达情况。实验结果表明，在主动脉夹层组织中，SIRT1 的表达具有年龄相关性，即高龄夹层患者的 SIRT1 表达水平较低年龄夹层患者低。但是无论低龄还是高龄夹层患者，SIRT1 的表达水平较相对正常的对照组均呈低表达，而 SIRT1 在年轻夹层患者中的作用机制需要进一步验证。
SIRT1 对主动脉夹层的发生发展起着重要作用，研究 SIRT1 在主动脉夹层疾病中的作用机制有望为 A 型主动脉夹层的治疗与筛查提供新思路。
利益冲突：无。
作者贡献：张文负责实验操作，文章初稿撰写，数据整理与分析；谷天祥负责审阅、修改论文，经费支持。
A 型主动脉夹层指主动脉腔内的高压血流从主动脉内膜撕裂口进入主动脉中膜，使中膜分离，并沿主动脉长轴方向扩展，从而导致主动脉真假两腔的一种病理学改变，是心脏外科急诊中十分凶险的疾病[1]。目前，主动脉夹层的病因仍不明确。流行病学调查[2]指出，65 岁以上的人群主动脉夹层发生率较高，这说明衰老是主动脉夹层的危险因素之一。然而，临床上 A 型主动脉夹层患者年轻化也成为一种趋势。所以年龄和主动脉夹层之间各机制的作用关系还有待研究。
作为一种公认的长寿因子，Sirtuin1（SIRT1）在心血管疾病中起着重要作用。研究[3-4]指出，SIRT1 在血管中的表达随着年龄的增长而降低，但 SIRT1 在主动脉夹层血管中是否也具有年龄依赖性还有待研究。为此，我们研究了不同年龄主动脉夹层患者主动脉壁中 SIRT1 表达是否有差异，为将来是否可将 SIRT1 作为主动脉夹层预测因子提供证据。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
纳入 2019—2020 年在中国医科大学附属第一医院接受手术治疗的 A 型主动脉夹层患者为夹层组，行冠状动脉（冠脉）旁路移植术的冠脉粥样硬化性心脏病（冠心病）患者为对照组。经胸腹主动脉 CT 血管造影（CT angiography，CTA）、冠脉 CTA 等影像学检查，明确主动脉夹层的诊断。排除马方综合征患者或者其他遗传性血管疾病患者。<45 岁的患者纳入低年龄组，45～60 岁的患者纳入中年龄组，>60 岁的患者纳入高年龄组。患者临床资料见表 1。
表1
各组患者临床资料比较［例（%）/］
1.2 组织样本的收集与存储
所有样本均为术中收集的新鲜主动脉壁组织，其中对照组取冠脉旁路移植术时主动脉打孔处的主动脉壁组织，于无酶标本袋中编号后，通过液氮罐转移至−80℃ 超低温冰箱保存。
1.3 实验主要试剂
主要试剂包括：SIRT1 mRNA 引物及内参基因 GAPDH （上海生工）、反转录试剂（TAKARA 公司）、SIRT1 抗体（CST 公司）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）抗体（万类生物）、BCA 蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒、一抗稀释液等（上海碧云天）。
1.4 实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）
取黄豆大小的组织，液氮研磨后采用 TRIZOL 法提取组织总 RNA，去 DNA 反应后通过反转录得到 cDNA 溶液，实验设置 3 个复孔，采用 Thermal Cycler DiceTM Real Time 进行 qRT-PCR 反应，得到 CT 值，并计算 2−ΔΔCT 值。
1.5 Western blotting 检测
取黄豆大小组织，组织匀浆后采用 RIPA Lysis Buffer 提取组织总蛋白，通过 BCA 蛋白质测定试剂盒定量总蛋白质浓度。根据目标蛋白的相对分子质量选择对应浓度的分离胶（8%分离胶：SIRT1；10%分离胶：MCP-1、GAPDH），浓缩胶均为 5%浓度。电泳后，将蛋白质转移到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭后，将膜与一抗在 4℃ 条件下孵育 24 h（SIRT1，1∶1000；MCP-1，1∶500）。洗膜后，孵育二抗，最后采用化学发光试剂显色。通过 Micro.Chemi 化学发光型凝胶成像系统进行图像采集。运用 Image J 软件计算上述蛋白的平均光密度值，将各组平均光密度值除以内参蛋白 GAPDH 的平均光密度值获取各目标蛋白的相对表达量。
1.6 免疫组织化学染色
通过免疫组织化学染色检测主动脉壁组织中 SIRT1 蛋白的表达。4% 多聚甲醛固定组织后，OCT 包埋，制作冰冻切片。用 3% 的过氧化氢消除内源性过氧化物酶的活性，10% 正常山羊血清封闭，一抗孵育过夜（SIRT1，1∶500），PBS 洗片后滴加二抗工作液，然后显色剂显色，苏木素复染，流水冲洗 1 min 后盐酸酒精分化数秒，酒精梯度脱水后中性树胶封片，显微镜下观察拍照。
1.7 统计学分析
采用 SPSS 25.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用one-way ANOVA 分析。计数资料以频数（%）描述，组间比较采用χ2检验。 P≤0.05 为差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究经中国医科大学附属第一医院伦理委员会审核批准，批准号：[2018]2018-149-2。
2 结果
2.1 SIRT1 mRNA 的表达
夹层组患者的 SIRT1 mRNA 表达量比对照组低，差异有统计学意义（P<0.001）。同时，SIRT1 mRNA 表达量在主动脉夹层患者中随年龄的增长呈下降趋势，差异有统计学意义（P<0.01）；见表2。
表2
各组患者 SIRT1 和 MCP-1 表达量比较（）
2.2 SIRT1 及 MCP-1 蛋白的表达
通过 Western blotting 检测各组 SIRT1 和 MCP-1 的蛋白表达。与对照组相比，SIRT1 蛋白在主动脉夹层样本中低表达（P<0.01）；与低年龄夹层患者相比，SIRT1 蛋白在中年龄和高年龄夹层患者样本中表达降低，差异有统计学意义（P<0.01）。在低年龄和中年龄患者样本中，夹层组 MCP-1 蛋白表达量较对照组多，差异有统计学意义（P<0.001）。与低年龄组相比，MCP-1 蛋白表达量在主动脉夹层患者中随着年龄的增长呈上升趋势，差异有统计学意义（P<0.001）；见图1、表 2。通过免疫组织化学染色检验主动脉壁组织样本中的 SIRT1 蛋白，结果显示：与对照组相比，夹层组 SIRT1 表达量降低（P<0.05）；与低年龄夹层样本相比，SIRT1 蛋白在中年龄和高年龄夹层样本中表达量降低，差异有统计学意义（P<0.01）；见图2、表 2。
图1
Sirtuin1和 MCP-1 蛋白的表达情况
MCP-1：单核细胞趋化蛋白-1
图2
SIRT1 蛋白在组织的表达情况
3 讨论
主动脉夹层是一种十分凶险的心血管疾病，发病率呈逐年上升趋势。夹层破裂前一般无明显的症状和体征，夹层破裂后其主要表现通常是胸部剧烈撕裂样疼痛，目前仍缺少有效的预防筛查措施[5]。
根据研究[3, 6-7]，SIRT1 在心血管组织中起着重要的作用，包括抑制氧化应激，减少炎症、泡沫细胞形成，抵抗细胞衰老等。SIRT1 还能够提高平滑肌细胞的功能，在主动脉夹层的进展过程中起作用。有研究[4]指出，随着年龄的增长，SIRT1 的表达水平受到显著影响。SIRT1 在年轻和年老患者中所表现出的内源性差异作用包括对细胞周期和细胞增殖的调节，这一点对主动脉夹层的进展尤为重要。但对于年轻夹层患者，SIRT1 在其主动脉壁中的表达是否降低尚无相关研究。
行冠脉旁路移植术时，主动脉壁打孔处多选在主动脉壁柔软有弹性处，尽量避免选取钙化等粥样硬化改变的部位，所以本研究选取这部分组织作为对照组。尤其对于年轻的冠心病患者，其主动脉壁可以看作是正常的主动脉壁组织。测定这部分组织的 SIRT1 表达可以一定程度代表此年龄段正常人的 SIRT1 表达情况。
本研究还测定了组织中 MCP-1 蛋白的表达。MCP-1 属于 CC 趋化因子家族的一个小细胞因子，在机体炎症时，血管平滑肌细胞可分泌 MCP-1 因子[8]。研究[9]发现，MCP-1 在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用，且 SIRT1 和 MCP-1 之间存在负性调控关系。SIRT1 可通过多个信号通路抑制 MCP-1 的表达，包括 NF-κB/SIRT1/AMPK 和 TNF-α/SIRT1/MCP-1 等信号通路[10-11]。本研究中，与对照组比较，夹层组中所有年龄段患者SIRT1均呈低表达，MCP-1在低年龄组及中年龄组夹层患者呈高表达趋势，而在高年龄夹层患者中无表达增高。我们推测其可能的原因是：随着年龄的增长，主动脉出现脂质斑块、钙化等粥样硬化改变的几率增加，MCP-1在粥样硬化组织中表达增高[9]，所以高年龄组中，即使不存在主动脉夹层改变，其MCP-1的表达也可能升高，因此两组差异无统计学意义。在低年龄组及中年龄组中，主动脉壁组织脂质沉积、粥样硬化的几率较低，其MCP-1的表达主要受SIRT1调控，提示主动脉夹层发生发展中炎性反应可能发挥重要作用。
相关研究[8]指出，主动脉夹层患者主动脉壁组织的 SIRT1 较周围相对正常的血管呈低表达趋势。但在 A 型主动脉夹层中，SIRT1 在高龄患者和年轻患者中是否有表达差异尚无相关研究。本研究首次从 mRNA 和蛋白质学层面分析了在 A 型主动脉夹层中，人体主动脉壁组织 SIRT1 在不同年龄的表达情况。实验结果表明，在主动脉夹层组织中，SIRT1 的表达具有年龄相关性，即高龄夹层患者的 SIRT1 表达水平较低年龄夹层患者低。但是无论低龄还是高龄夹层患者，SIRT1 的表达水平较相对正常的对照组均呈低表达，而 SIRT1 在年轻夹层患者中的作用机制需要进一步验证。
SIRT1 对主动脉夹层的发生发展起着重要作用，研究 SIRT1 在主动脉夹层疾病中的作用机制有望为 A 型主动脉夹层的治疗与筛查提供新思路。
利益冲突：无。
作者贡献：张文负责实验操作，文章初稿撰写，数据整理与分析；谷天祥负责审阅、修改论文，经费支持。
