引用本文： 温晓晓, 潘文志, 张坤, 潘孔荣, 周达新, 葛均波. 基于戊二醛和非戊二醛处理体系制备的生物瓣膜材料的血液相容性评估. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(9): 1323-1328. doi: 10.7507/1007-4848.202202007 复制
瓣膜性心脏病是最常见的心血管疾病之一，可能会导致多种严重的并发症[1]。随着世界老龄人口数量的增加，预计每年需要心脏瓣膜置换的患者人数将从2003年的约29万增加到2050年的超过85万[2]。用于置换手术的人工瓣膜假体分为机械瓣膜和生物瓣膜，生物瓣膜由于无需终生抗凝治疗，近年来使用率明显上升，尤其是在50～70岁的患者中[3]。目前市场上商品化的生物瓣膜大多是采用戊二醛交联的牛心包或猪主动脉瓣，经戊二醛处理后的生物瓣膜材料表现出显著增强的韧性、机械强度和抗降解能力[4-6]。然而，戊二醛又是引起瓣膜钙化的主要因素之一，会诱导细胞死亡，促使细胞碎片的形成，继而成为钙化的结合位点；另一方面，戊二醛与组织蛋白的不完全反应也会产生具有细胞毒性的醛基残留，同样会诱导钙化[7-9]。
为了解决戊二醛的钙化问题，我们开发了一种非戊二醛处理体系以制备生物瓣膜材料，采用经过优化的碳二亚胺（EDC）复合交联处理以替代戊二醛交联，采用超临界流体病毒灭活技术和环氧乙烷灭菌以替代戊二醛的病毒灭活和灭菌作用，同时采用了除原体细胞、抗氧化、表面修饰及超低温真空干燥等一系列技术以进一步降低材料免疫原性，提高抗钙化性能及使用的便捷性。
作为与血液长期接触的植入器械，要求生物瓣膜具有良好的血液相容性。本研究以戊二醛交联牛心包作为参考材料，通过溶血、体外纤维蛋白原吸附、血小板黏附、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）检测、补体激活及半体内血液循环实验，系统表征了采用非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，以评估其在瓣膜置换应用中的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验试剂和仪器
实验试剂：0.9%氯化钠注射液、人血纤维蛋白原（Calbiochem，美国）、Na125I（Pierce Biotechnology，美国）、TAT ELISA试剂盒（Abcam，美国）、C3a ELISA试剂盒（Invitrogen，美国）。
实验仪器：自动伽玛计数器（Perkin Elmer，美国）、酶标仪（Thermo Fisher，美国）、扫描电镜（Phenom，荷兰）。
1.2 实验动物
健康新西兰兔，雄性，体重2～3 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2015-0005。新鲜牛心包由沛嘉医疗科技（苏州）有限公司提供。
1.3 实验样品
新鲜牛心包剥离脂肪组织后，清洗数次，固定于定制模具中。非戊二醛处理样品（Non-GA）经EDC/（N-羟基琥珀酰亚胺）NHS复合交联、除原体细胞、超临界流体病毒灭活、抗氧化、减薄及超低温真空干燥、环氧乙烷灭菌处理后备用。戊二醛处理样品（GA）经0.625%的戊二醛交联，保存在戊二醛保存液中。样品测试前，Non-GA组在生理盐水中复水5 min，GA组用生理盐水清洗3次，每次15 min。
1.4 实验方法
1.4.1 溶血实验
由健康新西兰兔心脏采血10 mL，加质量浓度20 g/L草酸钾溶液0.5 mL，制备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝兔血8 mL，加质量浓度9 g/L的氯化钠注射液10 mL稀释。实验样品组每管加入表面积60 cm2的样品，按6 cm2/mL的比例加入氯化钠注射液10 mL；阴性对照组每管加入氯化钠注射液10 mL；阳性对照组每管加入蒸馏水10 mL。每组平行操作3管。全部试管放入37℃水浴中保温30 min后，每支试管加入0.2 mL稀释兔血，轻轻混匀，37℃继续保温60 min。倒出管内液体以800 g离心5 min。吸取上清液，用酶标仪在545 nm波长处测定吸光度，并计算样品溶血率：
 |
公式中：A：实验样品吸光度；B：阴性对照吸光度；C：阳性对照吸光度。
1.4.2 纤维蛋白原吸附
125I 标记于蛋白质酪氨酸残基上（未标记上的游离 125I 需低于 1%）。将标记的蛋白质与未标记的蛋白质按照一定比例混合，配制成 1 mg/mL 溶液作为吸附液。将样品尺寸裁剪成5 mm×5 mm，置于蛋白质吸附液中，37℃下静置浸泡 3 h 后用 pH 7.4 的缓冲液浸泡清洗。最后将样品转移至干净的测试管中，采用 Wizard 3001480 自动伽玛计数器检测γ-射线的放射量，并换算为样品表面吸附的蛋白质质量。
1.4.3 血小板黏附
由健康志愿者静脉采血约25 mL，迅速与109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂按1∶9的比例混合，置于离心管中，200 g离心15 min，收集上层富血小板血浆（PRP）。将PRP加入到放置有样品（5 mm×5 mm，n=3）的48孔板中，每孔200 μL，37℃孵育1 h后，弃去PRP，PBS清洗3次。每孔加入2.5%的戊二醛4℃固定过夜后，PBS清洗3次，乙醇梯度脱水，冷冻干燥并喷金后使用扫描电镜观察血小板黏附情况。
1.4.4 TAT检测
参考Denzinger的方法并略作修改[6]。健康志愿者静脉采血后采用肝素抗凝，使肝素浓度为5 U/mL。样品置于试管中（2 cm×3 cm，n=3），每管加入肝素抗凝血2 mL；同时设置不加样品的空白对照组，同样加入2 mL肝素抗凝血。所有试管于37℃、60 rpm转速下振荡1 h后，收集试管内血液，迅速与109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂按1∶9的比例混合，3 000 g离心10 min分离血浆，然后通过ELISA方法按照TAT试剂盒中说明检测血浆中TAT浓度。
1.4.5 补体激活
由健康志愿者静脉采血，1 500 g离心10 min分离血清。分别将实验样品、阴性对照（高密度聚乙烯）、阳性对照（醋酸纤维素）置于试管中（n=3），按表面积比例6 cm2/mL加入血清，每管加入肝素抗凝血2 mL，空白对照为未接触材料的血清。所有试管在37℃、60 rpm转速下振荡1 h。孵育完成后，转移各试管中血清，通过ELISA方法根据试剂盒说明书进行补体激活产物的C3a检测。
1.4.6 半体内血液循环
样品卷曲至闭合，置于PVC循环导管的回路中。选取健康的新西兰大白兔，耳缘静脉注射麻醉，并采用300 U/kg的肝素抗凝。分离出兔颈部的动静脉，分别插入留置针并固定，将含有样品的PVC循环导管通过留置针连接构成一个完整的通路（从动脉出发至静脉）。循环1 h后，剪下装有样品的导管段，生理盐水清洗后取出样品，拍照记录样品表面的血栓形成情况。最后将样品浸泡在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，PBS清洗后乙醇梯度脱水，冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜观察样品表面的血栓情况。
1.5 统计学分析
数据统计采用Minitab 21软件进行，计量资料以均数±标准差（
±s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
动物实验经中检华通威国际检验（苏州）有限公司实验动物福利伦理委员会批准，批准号：2021102801，所有实验操作均符合实验动物伦理原则。
2 结果
2.1 溶血实验
GA组样品溶血率为0%，Non-GA组样品溶血率为1.0%，均符合标准GB/T 16886.4-2003要求的样品溶血率＜5%。
2.2 纤维蛋白原吸附
样品在纤维蛋白原溶液中孵育3 h后，GA组的表面纤维蛋白原吸附量为（32.76±5.36）μg/cm2，Non-GA组的吸附量为（6.80±0.44）μg/cm2，较GA组下降了79.2%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.3 血小板黏附实验
样品与富血小板血浆孵育1 h后，表面黏附的血小板扫描电镜照片见图1。GA组样品上黏附有大量血小板，血小板存在一定程度的激活，有伪足伸出，同时有明显的团聚。相比之下，Non-GA组样品上血小板虽然也有激活和部分聚集，但黏附数量明显减少。
图1
血小板黏附扫描电镜照片
a、c：×2 000；b、d：×10 000
2.4 TAT检测
样品与全血孵育后，空白对照组TAT浓度为（8.17±0.47）ng/mL，GA组TAT浓度为（7.76±0.39）ng/mL，Non-GA组TAT浓度为（8.44±1.22）ng/mL。GA组和Non-GA组的TAT浓度与空白对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.5 补体激活
样品与血清孵育后，血清中的补体激活产物C3a浓度结果见图2。各组样品中，仅阳性对照组的C3a浓度与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。GA组和Non-GA组C3a浓度分别为（13.27±2.25）μg/mL和（19.39±4.24）μg/mL。虽然相比于Non-GA组，GA组C3a浓度略有降低，但两组差异无统计学意义。
图2
补体激活实验结果（n=3）
**：
2.6 半体内血液循环实验
半体内血液循环实验结果见图3。经过 1 h的体外循环后，GA组样品上的血栓覆盖面积和沉积厚度都明显高于Non-GA组（图3 b）。扫描电镜结果表明，GA组样品的纤维表面被大量血栓成分所覆盖，包括沉积了大量红细胞的纤维蛋白网络以及活化的血小板，而Non-GA组样品的纤维表面仅有少量的红细胞和血小板分布，尚未形成密集的纤维蛋白沉积（图3 c）。
图3
半体内血液循环实验结果
a：实验示意图；b：样品表面血栓宏观照片；c：样品表面血栓扫描电镜照片；左图：×2 000；右图：×5 000
3 讨论
多年的临床实践已证明，戊二醛交联的牛心包具有可接受的血液相容性[10-11]。然而由于戊二醛生物相容性相对较差，同时也是引起瓣膜钙化的重要因素之一，仍然需要开发新的工艺以进一步优化[12-13]。研究[14]表明采用碳二亚胺交联体系处理的瓣膜材料表现出与戊二醛处理相当的抗酶解性和机械性能，同时体外生物相容性和抗钙化性能优于戊二醛处理。碳二亚胺能够活化胶原分子内羧基，使之与氨基反应形成酰胺键，其交联属于零长度交联，碳二亚胺不会成为实际交联的一部分。我们前期研究发现，这种零长度交联会导致牛心包硬度升高，对瓣膜的血流动力学性能和长期耐久性造成不利影响。另一方面，碳二亚胺交联体系也不能同时具备戊二醛处理体系所包含的消毒、灭菌及液体保存功能。因此，我们在碳二亚胺交联的基础上进行优化处理以解决相应问题，开发了一整套的非戊二醛处理技术。本研究以戊二醛交联牛心包作为参考，系统评估了采用非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，为临床应用提供研究数据。
材料与血液接触时，有可能对血液中的红细胞造成破坏，因而溶血率是材料血液相容性评价中的一个必要检测指标[15]。本次实验结果表明，GA组样品不会引起溶血，而Non-GA组样品1.0%的溶血率也远低于国家标准的5%，溶血风险可接受。
凝血过程取决于材料表面与血液之间的相互作用。当材料与血液接触时，血浆蛋白将快速吸附并沉积在材料表面，而蛋白吸附层的变性和活化会激活凝血因子、血小板、白细胞及补体系统，导致凝血过程的发生以及最终的血栓形成[16-17]。纤维蛋白原是最早沉积在材料表面的蛋白质之一，是人体内与凝血有关的重要因子，在凝血酶作用下，纤维蛋白原可转化为纤维蛋白单体，然后相互聚合，在活化因子Ⅷ的作用下交联形成稳定的纤维蛋白，即血栓的基质骨架[18]。因此，材料表面的纤维蛋白原吸附可以从一定程度上评估材料的促凝血性，是评价材料血液相容性的指标之一[19]。本次实验中，Non-GA组上的纤维蛋白原吸附量明显低于GA组，这可能是由于我们在基础的EDC/NHS交联上进行了优化处理，增加了牛心包胶原纤维上的亲水基团羧基和羟基，提高了材料表面的亲水性，已有研究[20-21]表明亲水性提高会促进材料表面的抗蛋白吸附能力。
血小板黏附是血浆蛋白吸附后的下一步，在随后的凝血过程中起着重要作用。在瓣膜置换中，血小板沉积是术后早期微栓子的来源，也可能是后期钙化的一个病灶[22]。在我们的研究中，通过扫描电镜观察，发现GA组样品上的血小板黏附数量明显高于Non-GA组，这与纤维蛋白原吸附结果趋势一致。一方面，纤维蛋白原是介导血小板黏附的主要蛋白质[23]；另一方面，材料的表面结构也是影响血小板黏附的重要因素。在非戊二醛处理工艺中包含的表面修饰技术会使牛心包瓣膜材料表面粗糙度降低，而光滑表面相对于粗糙表面会有着更少的血小板沉积[22]。
TAT是凝血酶生成的敏感标志物，表明凝血激活[24]。在本次实验中，GA组和Non-GA组的TAT浓度与空白对照差异无统计学意义，表明在该实验条件下，两种处理体系制备的生物瓣膜材料都不会促进凝血酶介导的凝血途径激活。
补体系统由20多种血浆蛋白组成，如C3和C5，在机体的宿主防御机制中发挥重要作用，是先天免疫系统的一部分[25-26]。材料与血液接触后可能导致补体激活并释放补体激活产物，过敏毒素C3a在补体激活的早期阶段产生，其含量的升高意味着补体系统的激活增加，是评价材料血液相容性的重要因素[27]。本次实验中，GA组和Non-GA组的C3a含量与空白对照组相比差异均无统计学意义，表明两种材料均不会引起补体激活。
半体内血液循环实验能够较大程度上模拟材料与循环血液接触时的环境，能够直观反映材料的血栓形成性。实验结果证明GA组样品上的血栓生成量明显大于Non-GA组，包括大量的纤维蛋白凝块及被纤维蛋白网罗交织的红细胞和活化的血小板，这与纤维蛋白原吸附和血小板黏附实验结果趋势相一致。作为血栓形成的前提条件，纤维蛋白原吸附和血小板黏附的增加会增大材料的凝血反应，导致最终更明显的血栓形成。
综上所述，非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料具有可接受的溶血风险，不会促进凝血酶介导的凝血途径激活和补体系统激活。与戊二醛交联牛心包相比，非戊二醛处理体系制备的生物瓣膜材料的纤维蛋白原吸附量和血小板黏附有所降低，血栓沉积也更少，表现出改善的血液相容性。
利益冲突：温晓晓、张坤、潘孔荣为沛嘉医疗科技（苏州）有限公司在职员工，本研究由沛嘉医疗科技（苏州）有限公司资助，研究结果客观公正。
作者贡献：温晓晓、张坤负责实验和数据收集；潘文志、温晓晓负责实验与论文撰写；潘孔荣、周达新负责论文修改；葛均波负责论文总体设计。
瓣膜性心脏病是最常见的心血管疾病之一，可能会导致多种严重的并发症[1]。随着世界老龄人口数量的增加，预计每年需要心脏瓣膜置换的患者人数将从2003年的约29万增加到2050年的超过85万[2]。用于置换手术的人工瓣膜假体分为机械瓣膜和生物瓣膜，生物瓣膜由于无需终生抗凝治疗，近年来使用率明显上升，尤其是在50～70岁的患者中[3]。目前市场上商品化的生物瓣膜大多是采用戊二醛交联的牛心包或猪主动脉瓣，经戊二醛处理后的生物瓣膜材料表现出显著增强的韧性、机械强度和抗降解能力[4-6]。然而，戊二醛又是引起瓣膜钙化的主要因素之一，会诱导细胞死亡，促使细胞碎片的形成，继而成为钙化的结合位点；另一方面，戊二醛与组织蛋白的不完全反应也会产生具有细胞毒性的醛基残留，同样会诱导钙化[7-9]。
为了解决戊二醛的钙化问题，我们开发了一种非戊二醛处理体系以制备生物瓣膜材料，采用经过优化的碳二亚胺（EDC）复合交联处理以替代戊二醛交联，采用超临界流体病毒灭活技术和环氧乙烷灭菌以替代戊二醛的病毒灭活和灭菌作用，同时采用了除原体细胞、抗氧化、表面修饰及超低温真空干燥等一系列技术以进一步降低材料免疫原性，提高抗钙化性能及使用的便捷性。
作为与血液长期接触的植入器械，要求生物瓣膜具有良好的血液相容性。本研究以戊二醛交联牛心包作为参考材料，通过溶血、体外纤维蛋白原吸附、血小板黏附、凝血酶-抗凝血酶复合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）检测、补体激活及半体内血液循环实验，系统表征了采用非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，以评估其在瓣膜置换应用中的可行性。
1 材料与方法
1.1 实验试剂和仪器
实验试剂：0.9%氯化钠注射液、人血纤维蛋白原（Calbiochem，美国）、Na125I（Pierce Biotechnology，美国）、TAT ELISA试剂盒（Abcam，美国）、C3a ELISA试剂盒（Invitrogen，美国）。
实验仪器：自动伽玛计数器（Perkin Elmer，美国）、酶标仪（Thermo Fisher，美国）、扫描电镜（Phenom，荷兰）。
1.2 实验动物
健康新西兰兔，雄性，体重2～3 kg，由上海甲干生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2015-0005。新鲜牛心包由沛嘉医疗科技（苏州）有限公司提供。
1.3 实验样品
新鲜牛心包剥离脂肪组织后，清洗数次，固定于定制模具中。非戊二醛处理样品（Non-GA）经EDC/（N-羟基琥珀酰亚胺）NHS复合交联、除原体细胞、超临界流体病毒灭活、抗氧化、减薄及超低温真空干燥、环氧乙烷灭菌处理后备用。戊二醛处理样品（GA）经0.625%的戊二醛交联，保存在戊二醛保存液中。样品测试前，Non-GA组在生理盐水中复水5 min，GA组用生理盐水清洗3次，每次15 min。
1.4 实验方法
1.4.1 溶血实验
由健康新西兰兔心脏采血10 mL，加质量浓度20 g/L草酸钾溶液0.5 mL，制备成新鲜抗凝兔血。取新鲜抗凝兔血8 mL，加质量浓度9 g/L的氯化钠注射液10 mL稀释。实验样品组每管加入表面积60 cm2的样品，按6 cm2/mL的比例加入氯化钠注射液10 mL；阴性对照组每管加入氯化钠注射液10 mL；阳性对照组每管加入蒸馏水10 mL。每组平行操作3管。全部试管放入37℃水浴中保温30 min后，每支试管加入0.2 mL稀释兔血，轻轻混匀，37℃继续保温60 min。倒出管内液体以800 g离心5 min。吸取上清液，用酶标仪在545 nm波长处测定吸光度，并计算样品溶血率：
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公式中：A：实验样品吸光度；B：阴性对照吸光度；C：阳性对照吸光度。
1.4.2 纤维蛋白原吸附
125I 标记于蛋白质酪氨酸残基上（未标记上的游离 125I 需低于 1%）。将标记的蛋白质与未标记的蛋白质按照一定比例混合，配制成 1 mg/mL 溶液作为吸附液。将样品尺寸裁剪成5 mm×5 mm，置于蛋白质吸附液中，37℃下静置浸泡 3 h 后用 pH 7.4 的缓冲液浸泡清洗。最后将样品转移至干净的测试管中，采用 Wizard 3001480 自动伽玛计数器检测γ-射线的放射量，并换算为样品表面吸附的蛋白质质量。
1.4.3 血小板黏附
由健康志愿者静脉采血约25 mL，迅速与109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂按1∶9的比例混合，置于离心管中，200 g离心15 min，收集上层富血小板血浆（PRP）。将PRP加入到放置有样品（5 mm×5 mm，n=3）的48孔板中，每孔200 μL，37℃孵育1 h后，弃去PRP，PBS清洗3次。每孔加入2.5%的戊二醛4℃固定过夜后，PBS清洗3次，乙醇梯度脱水，冷冻干燥并喷金后使用扫描电镜观察血小板黏附情况。
1.4.4 TAT检测
参考Denzinger的方法并略作修改[6]。健康志愿者静脉采血后采用肝素抗凝，使肝素浓度为5 U/mL。样品置于试管中（2 cm×3 cm，n=3），每管加入肝素抗凝血2 mL；同时设置不加样品的空白对照组，同样加入2 mL肝素抗凝血。所有试管于37℃、60 rpm转速下振荡1 h后，收集试管内血液，迅速与109 mmol/L的枸橼酸钠抗凝剂按1∶9的比例混合，3 000 g离心10 min分离血浆，然后通过ELISA方法按照TAT试剂盒中说明检测血浆中TAT浓度。
1.4.5 补体激活
由健康志愿者静脉采血，1 500 g离心10 min分离血清。分别将实验样品、阴性对照（高密度聚乙烯）、阳性对照（醋酸纤维素）置于试管中（n=3），按表面积比例6 cm2/mL加入血清，每管加入肝素抗凝血2 mL，空白对照为未接触材料的血清。所有试管在37℃、60 rpm转速下振荡1 h。孵育完成后，转移各试管中血清，通过ELISA方法根据试剂盒说明书进行补体激活产物的C3a检测。
1.4.6 半体内血液循环
样品卷曲至闭合，置于PVC循环导管的回路中。选取健康的新西兰大白兔，耳缘静脉注射麻醉，并采用300 U/kg的肝素抗凝。分离出兔颈部的动静脉，分别插入留置针并固定，将含有样品的PVC循环导管通过留置针连接构成一个完整的通路（从动脉出发至静脉）。循环1 h后，剪下装有样品的导管段，生理盐水清洗后取出样品，拍照记录样品表面的血栓形成情况。最后将样品浸泡在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜，PBS清洗后乙醇梯度脱水，冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜观察样品表面的血栓情况。
1.5 统计学分析
数据统计采用Minitab 21软件进行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。
1.6 伦理审查
动物实验经中检华通威国际检验（苏州）有限公司实验动物福利伦理委员会批准，批准号：2021102801，所有实验操作均符合实验动物伦理原则。
2 结果
2.1 溶血实验
GA组样品溶血率为0%，Non-GA组样品溶血率为1.0%，均符合标准GB/T 16886.4-2003要求的样品溶血率＜5%。
2.2 纤维蛋白原吸附
样品在纤维蛋白原溶液中孵育3 h后，GA组的表面纤维蛋白原吸附量为（32.76±5.36）μg/cm2，Non-GA组的吸附量为（6.80±0.44）μg/cm2，较GA组下降了79.2%，差异具有统计学意义（P＜0.01）。
2.3 血小板黏附实验
样品与富血小板血浆孵育1 h后，表面黏附的血小板扫描电镜照片见图1。GA组样品上黏附有大量血小板，血小板存在一定程度的激活，有伪足伸出，同时有明显的团聚。相比之下，Non-GA组样品上血小板虽然也有激活和部分聚集，但黏附数量明显减少。
图1
血小板黏附扫描电镜照片
a、c：×2 000；b、d：×10 000
2.4 TAT检测
样品与全血孵育后，空白对照组TAT浓度为（8.17±0.47）ng/mL，GA组TAT浓度为（7.76±0.39）ng/mL，Non-GA组TAT浓度为（8.44±1.22）ng/mL。GA组和Non-GA组的TAT浓度与空白对照组差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.5 补体激活
样品与血清孵育后，血清中的补体激活产物C3a浓度结果见图2。各组样品中，仅阳性对照组的C3a浓度与空白对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。GA组和Non-GA组C3a浓度分别为（13.27±2.25）μg/mL和（19.39±4.24）μg/mL。虽然相比于Non-GA组，GA组C3a浓度略有降低，但两组差异无统计学意义。
图2
补体激活实验结果（n=3）
**：
2.6 半体内血液循环实验
半体内血液循环实验结果见图3。经过 1 h的体外循环后，GA组样品上的血栓覆盖面积和沉积厚度都明显高于Non-GA组（图3 b）。扫描电镜结果表明，GA组样品的纤维表面被大量血栓成分所覆盖，包括沉积了大量红细胞的纤维蛋白网络以及活化的血小板，而Non-GA组样品的纤维表面仅有少量的红细胞和血小板分布，尚未形成密集的纤维蛋白沉积（图3 c）。
图3
半体内血液循环实验结果
a：实验示意图；b：样品表面血栓宏观照片；c：样品表面血栓扫描电镜照片；左图：×2 000；右图：×5 000
3 讨论
多年的临床实践已证明，戊二醛交联的牛心包具有可接受的血液相容性[10-11]。然而由于戊二醛生物相容性相对较差，同时也是引起瓣膜钙化的重要因素之一，仍然需要开发新的工艺以进一步优化[12-13]。研究[14]表明采用碳二亚胺交联体系处理的瓣膜材料表现出与戊二醛处理相当的抗酶解性和机械性能，同时体外生物相容性和抗钙化性能优于戊二醛处理。碳二亚胺能够活化胶原分子内羧基，使之与氨基反应形成酰胺键，其交联属于零长度交联，碳二亚胺不会成为实际交联的一部分。我们前期研究发现，这种零长度交联会导致牛心包硬度升高，对瓣膜的血流动力学性能和长期耐久性造成不利影响。另一方面，碳二亚胺交联体系也不能同时具备戊二醛处理体系所包含的消毒、灭菌及液体保存功能。因此，我们在碳二亚胺交联的基础上进行优化处理以解决相应问题，开发了一整套的非戊二醛处理技术。本研究以戊二醛交联牛心包作为参考，系统评估了采用非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料的血液相容性，为临床应用提供研究数据。
材料与血液接触时，有可能对血液中的红细胞造成破坏，因而溶血率是材料血液相容性评价中的一个必要检测指标[15]。本次实验结果表明，GA组样品不会引起溶血，而Non-GA组样品1.0%的溶血率也远低于国家标准的5%，溶血风险可接受。
凝血过程取决于材料表面与血液之间的相互作用。当材料与血液接触时，血浆蛋白将快速吸附并沉积在材料表面，而蛋白吸附层的变性和活化会激活凝血因子、血小板、白细胞及补体系统，导致凝血过程的发生以及最终的血栓形成[16-17]。纤维蛋白原是最早沉积在材料表面的蛋白质之一，是人体内与凝血有关的重要因子，在凝血酶作用下，纤维蛋白原可转化为纤维蛋白单体，然后相互聚合，在活化因子Ⅷ的作用下交联形成稳定的纤维蛋白，即血栓的基质骨架[18]。因此，材料表面的纤维蛋白原吸附可以从一定程度上评估材料的促凝血性，是评价材料血液相容性的指标之一[19]。本次实验中，Non-GA组上的纤维蛋白原吸附量明显低于GA组，这可能是由于我们在基础的EDC/NHS交联上进行了优化处理，增加了牛心包胶原纤维上的亲水基团羧基和羟基，提高了材料表面的亲水性，已有研究[20-21]表明亲水性提高会促进材料表面的抗蛋白吸附能力。
血小板黏附是血浆蛋白吸附后的下一步，在随后的凝血过程中起着重要作用。在瓣膜置换中，血小板沉积是术后早期微栓子的来源，也可能是后期钙化的一个病灶[22]。在我们的研究中，通过扫描电镜观察，发现GA组样品上的血小板黏附数量明显高于Non-GA组，这与纤维蛋白原吸附结果趋势一致。一方面，纤维蛋白原是介导血小板黏附的主要蛋白质[23]；另一方面，材料的表面结构也是影响血小板黏附的重要因素。在非戊二醛处理工艺中包含的表面修饰技术会使牛心包瓣膜材料表面粗糙度降低，而光滑表面相对于粗糙表面会有着更少的血小板沉积[22]。
TAT是凝血酶生成的敏感标志物，表明凝血激活[24]。在本次实验中，GA组和Non-GA组的TAT浓度与空白对照差异无统计学意义，表明在该实验条件下，两种处理体系制备的生物瓣膜材料都不会促进凝血酶介导的凝血途径激活。
补体系统由20多种血浆蛋白组成，如C3和C5，在机体的宿主防御机制中发挥重要作用，是先天免疫系统的一部分[25-26]。材料与血液接触后可能导致补体激活并释放补体激活产物，过敏毒素C3a在补体激活的早期阶段产生，其含量的升高意味着补体系统的激活增加，是评价材料血液相容性的重要因素[27]。本次实验中，GA组和Non-GA组的C3a含量与空白对照组相比差异均无统计学意义，表明两种材料均不会引起补体激活。
半体内血液循环实验能够较大程度上模拟材料与循环血液接触时的环境，能够直观反映材料的血栓形成性。实验结果证明GA组样品上的血栓生成量明显大于Non-GA组，包括大量的纤维蛋白凝块及被纤维蛋白网罗交织的红细胞和活化的血小板，这与纤维蛋白原吸附和血小板黏附实验结果趋势相一致。作为血栓形成的前提条件，纤维蛋白原吸附和血小板黏附的增加会增大材料的凝血反应，导致最终更明显的血栓形成。
综上所述，非戊二醛处理体系制备的牛心包生物瓣膜材料具有可接受的溶血风险，不会促进凝血酶介导的凝血途径激活和补体系统激活。与戊二醛交联牛心包相比，非戊二醛处理体系制备的生物瓣膜材料的纤维蛋白原吸附量和血小板黏附有所降低，血栓沉积也更少，表现出改善的血液相容性。
利益冲突：温晓晓、张坤、潘孔荣为沛嘉医疗科技（苏州）有限公司在职员工，本研究由沛嘉医疗科技（苏州）有限公司资助，研究结果客观公正。
作者贡献：温晓晓、张坤负责实验和数据收集；潘文志、温晓晓负责实验与论文撰写；潘孔荣、周达新负责论文修改；葛均波负责论文总体设计。
