引用本文： 黄德荣, 陈忠秀, 陈红英, 陈雪梅, 赁可. 微小RNA-484参与肥厚型心肌病心肌纤维化的机制研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(9): 1316-1322. doi: 10.7507/1007-4848.202203039 复制
肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种常见的遗传性心脏病，以心肌肥厚、发育不良和纤维化为特征[1]。其中心肌纤维化是引起恶性心律失常和不良心脏重构的重要病理基础[2]。过度纤维化可引起微血管功能障碍，心房、心室变薄，并逐渐扩张，引起收缩、舒张功能障碍，最终导致心力衰竭甚至死亡[3-8]。微小RNAs（miRNAs）通过与目标mRNA互补序列结合从而负性调控基因表达[9]，在心脏纤维化的发生、发展过程中发挥着重要的调控作用。本研究通过对HCM患者心肌组织中差异表达的miRNAs进行分析，并在细胞水平对其调控机制进行深入研究，探讨其调控HCM心肌纤维化的机制。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选择2014年1月—2018年6月42例在四川大学华西医院诊断并行外科手术治疗的HCM患者，其中男29例、女13例，中位年龄46（15～69）岁。纳入标准：（1）年龄14～70岁，性别不限；（2）明确诊断HCM，符合以下诊断标准：① 通过心脏彩色超声、磁共振成像或心脏CT测量的左室壁厚度>15 mm；② 排除瓣膜狭窄、高血压等病因所引起的心肌肥厚；（3）具有外科手术指征，同意进行外科手术，且术前评估无严重器官功能衰竭、感染等，可耐受外科手术治疗；（4）同意参加研究且术后能随访。排除标准：同期行冠状动脉旁路移植术等手术。根据术中切除的心肌组织分别进行组织染色。通过组织切片中纤维化染色计算胶原容积指数（collagen volume fraction，CVF）。根据纤维化程度（CVF%）计算平均值，并将患者分为两组：低于平均值者为轻度纤维化组，高于平均值者为重度纤维组。然后在两组分别检测纤维化相关的4个miRNAs（miR-19b、miR-484、miR-221和miR-222）的表达差异，寻找差异表达的目标RNA。
1.2 实验动物和材料
选取健康Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠（0～2 d龄）20只，重量50～60 g，雌雄不限（成都达硕实验动物有限公司提供）。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-0030。
实验材料：DMEM基础培养基（上海中乔新舟生物科技有限公司）；胰酶细胞消化液（0.05%胰酶）（C0202，上海碧云天生物技术有限公司）；Collagenase TypeⅡ （9001-12-1，北京亚米生物科技有限公司）；D-PBS （C0221D，上海碧云天生物技术有限公司）；PeproTech重组人转化生长因子（tansforming growth factor-β1，TGF-β1，100-21c，派普泰克）；α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab7817，Abcam）；miR-484 antagomir（R10034.8，广州锐博）；HIPK-1（YN0007，Immunoway）；细胞蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010S，上海碧云天生物技术有限公司）；PVDF膜（FFP24，上海碧云天生物技术有限公司）；双荧光素酶试剂盒（上海吉玛生物制药有限公司）；mRNA/lncRNA qRT-PCR Kit（R11088.2，广州锐博）；Masson三色染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；逆转录试剂盒 （Qiagen 218161）；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒 （广州锐博）；QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit试剂盒（Qiagen，德国）；4%多聚甲醛、甲醇、乙醇（成都市科龙化工试剂厂）；Trizol RNA分离试剂（Life）；Uni-Reverse primer（广州锐博）；miRs Forward primer（广州锐博）；RNA 逆转录仪（美国 Bio-Rad 公司）；全视野细胞扫描分析仪（美国Nexcelom）； BIO-RAD CFX96 q-PCR system（美国Bio-Rad公司）。
1.3 心肌组织Masson染色与miRNAs表达检测
（1）纤维化程度检测：取手术切除的心肌组织（<15 min），将其剪切成厚度<5 mm、长度<1 cm长方体状，甲醛固定，石蜡包埋，按说明书进行三色染色。经染色后胶原纤维染成蓝色，肌纤维染成红色，使用Image-pro-plus 6.0分析测量胶原纤维面积得出CVF值（%）。每个切片测量2次，误差<3%。
（2）心肌组织中miRNAs表达量检测：用Trizol法提取心肌组织中总RNA。取100 g组织磨成粉末状，加入1 mL Trizol液，摇匀；使用酚氯仿法抽取总RNAs。测量浓度后，取0.5 µg总RNAs使用加尾法加尾，按说明书进行逆转录体系配制，进行逆转录程序；所有cDNAs放入–20℃保存。进行qPCR反应体系制备：引物序列如下： U6：CAAGGATGAC ACGCAAATTCG；hsa-miR-19b：TGTGCAAATCCATGCA AAACTGA；hsa-miR-221：AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC；hsa-miR-222：AGCTACATCT GGCT ACTGGGT；hsa-miR-484：ATCATGATGGGCTCCTCGGTGT。按说明书，反应体系总量为10 µL（2×QuantiFast® SYBR® Green PCR Master 5 µL+Universal primer0.2 µL+miR-specific primer 0.2 µL+cDNA 1 µL+Nuclease-free H2O 3.6 µL）。反应条件为：95℃ 5 min预变性，95℃ 10 s 变性，60℃ 30 s 退火和延伸，共计40个循环后，将温度从60℃缓慢升至97℃，温度每变化1℃连续进行5次采集绘制溶解曲线。Ct值定义即 PCR 扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数。表达量采用 2–∆∆Ct 法计算。∆Ct=Ct 目的基因–Ct 内参基因，∆∆Ct=∆Ct 实验组–∆Ct对照组，相对表达量=2–∆∆Ct。
1.4 生物信息学预测 miR-484 的靶基因
在TargetScan官网和miRBase数据库中输入miR-484，预测其靶基因，根据预测结果选择可能的靶标蛋白，再根据该蛋白在器官的表达情况和既往文献报道，最终选择了HIPK1作为miR-484的靶基因进行进一步验证。
1.5 细胞实验
1.5.1 心脏成纤维细胞的分离、培养、鉴定、活化与质粒转染
取乳鼠左心室心肌组织，剪碎后使用酶消化法消化心肌组织，再使用差速贴壁法分离心脏成纤维细胞。用10%FBS DMEM高糖培养基，于37℃ 5%CO2孵箱中培养心脏成纤维细胞，并使其传代，传至3～4代。使用免疫荧光法对心脏成纤维细胞进行鉴定后，使用TGF-β1使心脏成纤维细胞活化、增殖，根据其是否使用TGF-β1活化分为TGF-β1组和对照组（Control）。通过检测α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）表达量确定心脏成纤维化细胞的活化。将活化后的心脏成纤维细胞按说明书分别转染NC-antagomir（TGF-β1+NC-antagomir组）和miR-484 antagomir（TGF-β1+miR-484-antagomir组）。
1.5.2 各组心脏成纤维细胞中RNAs表达量的检测
将培养的心脏成纤维细胞加入氯仿（1 mL Trizol/0.2 mL 氯仿）充分乳化后，取上清液加入等体积异丙醇，离心后弃上清液，加入75%乙醇（1 mLTrizol/1 mL 乙醇）漂洗，干燥，加入RNase-free water 20 µL溶解，以提取细胞中总RNAs。miRNAs第4步进行加尾、逆转录和PCR反应，分别计算miRNAs的表达量。
mRNAs采用茎环法进行检测，取1 µg总RNAs配制成10 µL体系进行逆转录，所得cDNAs放入–20℃冰箱保存。引物设计：小鼠HIPK1上游引物5'-GACC AGCA TCAGCCAATCAT-3'，下游引物5'-GACATTAGACCTCGCCTTCAG-3'；小鼠GAPDH上游引物5'-GAGAAGGCTGGGGCTCAC-3'，下游引物5'-GTTGTC ATGGATGACCTTGGC-3'。根据试剂盒说明书配制成20 µL体系，反应条件为：95℃ 10 min预变性，95℃ 5 s 变性，60℃ 30 s 退火和72℃ 30 s 延伸，共计40个循环后，绘制溶解曲线。按上述方法1.3计算相对表达量。
1.5.3 细胞蛋白表达量测定
根据蛋白提取盒说明书所示，在细胞培养皿中加入RIPA裂解液，提取总蛋白；根据BCA试剂盒进行蛋白定量；加十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液煮沸10 min，取20 µg蛋白样品上样，10% SDS-PAGE电泳（80 V，30 min，然后100 V，60 min）；放入4℃层析柜中转膜（电流150 mA，12%胶转50 min，8%胶转90 min）；5%脱脂牛奶50 mL室温封闭1 h；加一抗HIPK1 （1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）内参、GDPDH （1∶1 000）4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，配显影液（说明书按A∶B∶C=1∶1∶1比例混合），与蛋白膜反应15 s后，在凝胶成像系统中曝光并采集图像；采用Image lab软件进行蛋白条带分析，用HIPK1条带灰度值与GAPDH条带灰度值比较计算HIPK1的相对表达量。
1.6 双荧光素酶报告基因检测
将HIPK1 3'UTR区域（预测出来的与miR-484结合的位点）构建到pmiR-GLO载体的海肾荧光素酶基因的后面，称之为正常（WT）型；将结合位点突变后构建获得的称之为突变（MUT）型；以萤火虫荧光素酶为内参。将WT型与MUT型载体质粒与miR-484 mimics 和miR-484 NC mimics质粒共转染293T细胞。由此分为4组，即：WT+miR-484 mimics、WT+NC-mimics、MUT+miR-484 mimics、WUT+NC-mimics。培养48 h后，按双荧光素酶报告检测试剂盒说明书裂解细胞并于双荧光素酶报告基因系统分别检测其荧光值，并进一步计算荧光素酶活性。
1.7 统计学分析
使用 SPSS 22.0 进行统计分析与处理。Kolmogorov-Smirnov检验用于检验计量资料是否服从正态分布，正态分布的计量资料采用均数±标准差（
±s）描述，两组间比较采用独立样本t检验；不符合则用中位数（上下四分位数）［M（Q1，Q3）］描述，两组间比较采用非参数检验；多组间计量资料比较采用One-way ANOVA。计数资料采用率描述，组间比较采用χ2 检验。P≤0.05表示差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究已通过四川大学华西医院伦理委员会批准（2018250）。研究遵循世界卫生组织赫尔辛基宣言拟定的道德标准，所有的入选患者在研究前均被给予研究知情同意书，本研究也对所有研究中的临床资料坚持严格的保密原则。动物实验方案经四川大学华西医院动物实验伦理委员会审查和批准（2018107A）。对动物的所有操作均符合美国国立卫生研究院发布的关于用于生物医学研究的实验动物的使用和护理指南（第85-23号，1996年修订）。
2 结果
2.1 心肌组织中miRNAs表达量测定
根据心肌组织切片进行Masson染色，分别计算各样本CVF值。轻度纤维化组CVF值明显低于重度纤维化组，差异具有统计学意义（12.128%±2.104% vs. 42.936%±9.528%，P<0.05）。 在轻度与重度纤维化组中分别检检测miR-221、miR-222、miR-19b和miR-484的表达差异，结果显示miR-221、miR-222和miR-484在重度纤维化组的表达量明显高于轻度纤维化组，而miR-19b则明显低于轻度纤维化组，差异均具有统计学意义；见图1。
图1
轻、重度纤维化组的心肌组织中miRNAs表达情况
*：
2.2 心脏成纤维细胞活化前、后miRNAs表达量
心脏成纤维细胞受TGF-β1刺激增殖分化为肌成纤维细胞，与活化前比较，miR-484、miR-221和miR-222表达量分别为：miR-484：5.375±1.032 vs. 1.060±0.068（P<0.05），miR-221：2.638±0.531 vs. 1.096±0.124（P<0.05）， miR-222：2.036±0.349 vs. 0.987±0.047（P<0.05），可见心脏成纤维细胞活化后其表达量均明显增加，而miR-19b表达量在活化前、后无明显变化（0.988±0.034 vs. 1.061±0.197，P>0.05）；见图2。因miR-484在活化后表达量大于活化前的4倍以上，故选择miR-484进行后续研究。
图2
miRNAs在 CF 活化前、后的表达差异
Control：对照组；TGF-β1：转化生长因子-β1；CF：心脏成纤维细胞；*：
2.3 调控miRNA-484表达对心脏成纤维细胞表型变化的影响
心脏成纤维细胞受TGF-β1刺激活化后，分别转染miR-484 antagomir或NC antagomir。通过检测miR-484的表达发现，转染NC antagomir与转染miR-484 antagomir的心脏成纤维细胞中miR-484的表达量分别为 5.466±0.317和0.301±0.013（P<0.05），可见miR-484表达水平较明显下降，证明转染成功。
我们进一步检测了心脏成纤维细胞中的促纤维化相关蛋白在各组中的表达情况，结果发现：转染NC antagomir组与miR-484 antagomir组中，α-SMA蛋白表达水平分别为2.964±0.022和1.654±0.021（P<0.05）；CollagenⅠ在两组中的蛋白表达量分别为2.725±0.077和1.277±0.721（P<0.05）；见图3。
图3
调控miRNA-484表达后，纤维化相关蛋白在心脏成纤维细胞中的表达情况
a：免疫印迹条带图；b：促纤维化蛋白表达量；α-SMA：α-肌动蛋白；CollagenⅠ：Ⅰ型胶原蛋白；*：
2.4 调控miRNA-484表达后靶基因的表达变化
心脏成纤维细胞经TGF-β1刺激转化为肌成纤维细胞。再分别转染miR-484 antagomir和 NC antagomir，并分别在mRNA和蛋白水平测定了HIPK1 的表达情况（使用GAPDH为内参基因）。结果如下：心脏成纤维细胞在TGF-β1刺激活化后，miR-484表达增加，HIPK1的mRNA表达量在活化前与活化后的表达量分别为1.001±0.019 和0.501±0.232（P<0.05）；而转染NC antagomir和miR-484 antagomir后，HIPK1的mRNA表达量在两组间的表达水平分别为0.626±0.077和0.595±0.095（ P>0.05）；在蛋白表达水平，HIPK1在TGF-β1+NC antagomir组与TGF-β1+miR-484 antagomir组的表达量分别为0.326±0.015和0.972±0.013（P<0.05）；见图4。
图4
调控miR-484表达后靶基因HIPK1的蛋白表达变化
a：免疫印迹条带图；b：HIPK1 表达量；TGF-β1：转化生长因子-β1；C：对照组；T：TGF-β1组；T+N：TGF-β1+NC antagomir组；T+M：TGF-β1+miR-484 antagomir组；HIPK-1：同源结构域相互蛋白激酶-1；**：
2.5 双荧光素酶报告基因检测结果
预测结合位点，并定义MUT组和WT组。结合位点突变者为MUT组，结合位点未突变者为WT组。分别与NC mimics、miR-484 mimics共转染后，再分别比较它们的荧光素酶活性，结果如下：MUT组：转染NC mimics与转染miR-484 mimics的荧光素酶活性分别为1.012±0.021和0.990±0.002（P>0.05）；而在WT组，它们的荧光素酶活性分别为0.995±0.050和0.662±0.008（P<0.05）。可见将带有结合位点的质粒与miR-484 mimics质粒共转染后荧光素酶活性明显下降，这表明HIPK1与miR-484之间存在靶向结合关系。
3 讨论
心肌纤维化是心脏针对各种刺激（生理或病理）所作出的病理反应，是引起心功能衰竭的重要病理生理机制。HCM尤其是合并流出道梗阻者，长时间的压力超负荷会导致严重的间质和血管周围纤维化[10-12]，严重破坏心脏结构，使心肌兴奋-收缩耦合机制严重受损，收缩和舒张功能进行性下降，出现恶性心律失常、心力衰竭甚至死亡的严重后果[13-14]。
心脏成纤维细胞是纤维化主要的效应细胞，它在各种病因刺激下转分化为具有分泌和收缩功能的肌成纤维细胞，是驱动纤维化的关键因素[15]。心脏成纤维细胞是肌成纤维细胞的主要来源[16]。在各种病理因素作用下，心脏成纤维细胞被激活并转分化为具有广泛内质网的肌成纤维细胞，可合成和分泌收缩蛋白如α-SMA，是细胞活化成熟的表型特征[17]，故α-SMA有助于识别组织中的肌成纤维细胞。miRNAs是研究最为普遍的非编码RNA，它可以调节多种细胞类型。现已证实，多种miRNAs参与了心脏成纤维细胞的活化过程。既往文献[18]报道，miR-484已被证实参与了肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移等过程，同时，miR-484已被报道参与了肝脏纤维化过程，而其在心肌纤维化中的作用尚未阐明。我们在肥厚型心肌患者心肌组织样本中发现：在重度纤维化组中，miR-484的表达量明显高于轻度纤维化组，证明miR-484可能参与HCM患者心肌纤维化的过程。进一步的细胞实验显示，心脏成纤维细胞受到TGF-β1刺激后，α-SMA蛋白表达量明显增加，证明成纤维细胞得到活化。并在其活化前、后分别测量了miR-484的表达，发现miR-484的表达量也明显上调，CollagenⅠ的表达也随之增加。而使用miR-484 antagomir下调miR-484的表达后，心脏成纤维细胞中α-SMA和CollagenⅠ的表达量也随之下降，证明心脏成纤维细胞的活化受到了抑制。由此可得出，细胞内miR-484的变化可能参与心脏成纤维细胞活化过程，调控miR-484 的表达可抑制心脏成纤维细胞介导的心肌纤维化过程，从而缓解纤维化程度。可见细胞内miR-484可成为心肌纤维化的调控靶点，为心肌纤维化治疗提供策略。
另外，在我们的研究中，首次发现HIPK1为miR-484的直接靶标。体外实验发现：在心脏成纤维细胞增殖、分化过程中，miR-484表达明显增加，HIPK1 mRNA水平下降，在转染miR-484 antagomir下调miR-484的表达后，虽然HIPK1在mRNA水平无明显改变，但在蛋白表达水平，HIPK1的表达水平较转染NC antagomir组明显升高，证明细胞内miR-484可调控HIPK1的表达。双荧光素酶报告基因检测也发现：miR-484与HIPK1之间存在靶向结合位点，故确认HIPK1为miR-484的靶基因之一。既往研究[19-20]发现：HIPK1是蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）家族成员，其高度保守，可通过多种途径参与细胞增殖、凋亡和mRNA的转录等过程，在器官纤维化方面，可通过激活TGF-β信号通路的上游因子参与肾脏纤维化的发生、发展。Hong 等[21]的研究发现，miR-22是一种抗纤维化的miRNA，其过度表达可抑制其靶基因HIPK1的表达，进而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的纤维化过程，是治疗心脏纤维化的潜在靶点。可见HIPK1可作为miRNAs的靶基因参与纤维化的过程。在我们的研究中也得出miR-484通过HIPK1参与了心肌纤维化的调控。
综上所述，细胞内miR-484参与心肌纤维化的过程是通过其调控目标基因HIPK1的表达来实现，下调miR-484可拮抗心脏成纤维细胞的纤维化反应，抑制心脏成纤维细胞介导的心肌纤维化的过程，细胞内miR-484的变化可能与心脏纤维化过程有关。下一步，我们将进行深入研究，以明确miR-484是否可成为调控的位点，制定延缓甚至逆转心肌纤维化的新方案。
利益冲突：无。
作者贡献：赁可负责研究构思与设计，论文修改；黄德荣负责实验操作，数据收集、分析，论文撰写；陈忠秀负责课题设计，资料分析，论文修改；陈红英、陈雪梅负责实验设计，指导实验操作，数据收集、分析、统计。
肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一种常见的遗传性心脏病，以心肌肥厚、发育不良和纤维化为特征[1]。其中心肌纤维化是引起恶性心律失常和不良心脏重构的重要病理基础[2]。过度纤维化可引起微血管功能障碍，心房、心室变薄，并逐渐扩张，引起收缩、舒张功能障碍，最终导致心力衰竭甚至死亡[3-8]。微小RNAs（miRNAs）通过与目标mRNA互补序列结合从而负性调控基因表达[9]，在心脏纤维化的发生、发展过程中发挥着重要的调控作用。本研究通过对HCM患者心肌组织中差异表达的miRNAs进行分析，并在细胞水平对其调控机制进行深入研究，探讨其调控HCM心肌纤维化的机制。
1 资料与方法
1.1 临床资料和分组
选择2014年1月—2018年6月42例在四川大学华西医院诊断并行外科手术治疗的HCM患者，其中男29例、女13例，中位年龄46（15～69）岁。纳入标准：（1）年龄14～70岁，性别不限；（2）明确诊断HCM，符合以下诊断标准：① 通过心脏彩色超声、磁共振成像或心脏CT测量的左室壁厚度>15 mm；② 排除瓣膜狭窄、高血压等病因所引起的心肌肥厚；（3）具有外科手术指征，同意进行外科手术，且术前评估无严重器官功能衰竭、感染等，可耐受外科手术治疗；（4）同意参加研究且术后能随访。排除标准：同期行冠状动脉旁路移植术等手术。根据术中切除的心肌组织分别进行组织染色。通过组织切片中纤维化染色计算胶原容积指数（collagen volume fraction，CVF）。根据纤维化程度（CVF%）计算平均值，并将患者分为两组：低于平均值者为轻度纤维化组，高于平均值者为重度纤维组。然后在两组分别检测纤维化相关的4个miRNAs（miR-19b、miR-484、miR-221和miR-222）的表达差异，寻找差异表达的目标RNA。
1.2 实验动物和材料
选取健康Sprague Dawley（SD）大鼠乳鼠（0～2 d龄）20只，重量50～60 g，雌雄不限（成都达硕实验动物有限公司提供）。实验动物生产许可证号：SCXK（川）2020-0030。
实验材料：DMEM基础培养基（上海中乔新舟生物科技有限公司）；胰酶细胞消化液（0.05%胰酶）（C0202，上海碧云天生物技术有限公司）；Collagenase TypeⅡ （9001-12-1，北京亚米生物科技有限公司）；D-PBS （C0221D，上海碧云天生物技术有限公司）；PeproTech重组人转化生长因子（tansforming growth factor-β1，TGF-β1，100-21c，派普泰克）；α-肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA，ab7817，Abcam）；miR-484 antagomir（R10034.8，广州锐博）；HIPK-1（YN0007，Immunoway）；细胞蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010S，上海碧云天生物技术有限公司）；PVDF膜（FFP24，上海碧云天生物技术有限公司）；双荧光素酶试剂盒（上海吉玛生物制药有限公司）；mRNA/lncRNA qRT-PCR Kit（R11088.2，广州锐博）；Masson三色染色试剂盒（南京森贝伽生物科技有限公司）；逆转录试剂盒 （Qiagen 218161）；riboSCRIPTTM mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit试剂盒 （广州锐博）；QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit试剂盒（Qiagen，德国）；4%多聚甲醛、甲醇、乙醇（成都市科龙化工试剂厂）；Trizol RNA分离试剂（Life）；Uni-Reverse primer（广州锐博）；miRs Forward primer（广州锐博）；RNA 逆转录仪（美国 Bio-Rad 公司）；全视野细胞扫描分析仪（美国Nexcelom）； BIO-RAD CFX96 q-PCR system（美国Bio-Rad公司）。
1.3 心肌组织Masson染色与miRNAs表达检测
（1）纤维化程度检测：取手术切除的心肌组织（<15 min），将其剪切成厚度<5 mm、长度<1 cm长方体状，甲醛固定，石蜡包埋，按说明书进行三色染色。经染色后胶原纤维染成蓝色，肌纤维染成红色，使用Image-pro-plus 6.0分析测量胶原纤维面积得出CVF值（%）。每个切片测量2次，误差<3%。
（2）心肌组织中miRNAs表达量检测：用Trizol法提取心肌组织中总RNA。取100 g组织磨成粉末状，加入1 mL Trizol液，摇匀；使用酚氯仿法抽取总RNAs。测量浓度后，取0.5 µg总RNAs使用加尾法加尾，按说明书进行逆转录体系配制，进行逆转录程序；所有cDNAs放入–20℃保存。进行qPCR反应体系制备：引物序列如下： U6：CAAGGATGAC ACGCAAATTCG；hsa-miR-19b：TGTGCAAATCCATGCA AAACTGA；hsa-miR-221：AGCTACATTGTCTGCTGGGTTTC；hsa-miR-222：AGCTACATCT GGCT ACTGGGT；hsa-miR-484：ATCATGATGGGCTCCTCGGTGT。按说明书，反应体系总量为10 µL（2×QuantiFast® SYBR® Green PCR Master 5 µL+Universal primer0.2 µL+miR-specific primer 0.2 µL+cDNA 1 µL+Nuclease-free H2O 3.6 µL）。反应条件为：95℃ 5 min预变性，95℃ 10 s 变性，60℃ 30 s 退火和延伸，共计40个循环后，将温度从60℃缓慢升至97℃，温度每变化1℃连续进行5次采集绘制溶解曲线。Ct值定义即 PCR 扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数。表达量采用 2–∆∆Ct 法计算。∆Ct=Ct 目的基因–Ct 内参基因，∆∆Ct=∆Ct 实验组–∆Ct对照组，相对表达量=2–∆∆Ct。
1.4 生物信息学预测 miR-484 的靶基因
在TargetScan官网和miRBase数据库中输入miR-484，预测其靶基因，根据预测结果选择可能的靶标蛋白，再根据该蛋白在器官的表达情况和既往文献报道，最终选择了HIPK1作为miR-484的靶基因进行进一步验证。
1.5 细胞实验
1.5.1 心脏成纤维细胞的分离、培养、鉴定、活化与质粒转染
取乳鼠左心室心肌组织，剪碎后使用酶消化法消化心肌组织，再使用差速贴壁法分离心脏成纤维细胞。用10%FBS DMEM高糖培养基，于37℃ 5%CO2孵箱中培养心脏成纤维细胞，并使其传代，传至3～4代。使用免疫荧光法对心脏成纤维细胞进行鉴定后，使用TGF-β1使心脏成纤维细胞活化、增殖，根据其是否使用TGF-β1活化分为TGF-β1组和对照组（Control）。通过检测α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白（CollagenⅠ）表达量确定心脏成纤维化细胞的活化。将活化后的心脏成纤维细胞按说明书分别转染NC-antagomir（TGF-β1+NC-antagomir组）和miR-484 antagomir（TGF-β1+miR-484-antagomir组）。
1.5.2 各组心脏成纤维细胞中RNAs表达量的检测
将培养的心脏成纤维细胞加入氯仿（1 mL Trizol/0.2 mL 氯仿）充分乳化后，取上清液加入等体积异丙醇，离心后弃上清液，加入75%乙醇（1 mLTrizol/1 mL 乙醇）漂洗，干燥，加入RNase-free water 20 µL溶解，以提取细胞中总RNAs。miRNAs第4步进行加尾、逆转录和PCR反应，分别计算miRNAs的表达量。
mRNAs采用茎环法进行检测，取1 µg总RNAs配制成10 µL体系进行逆转录，所得cDNAs放入–20℃冰箱保存。引物设计：小鼠HIPK1上游引物5'-GACC AGCA TCAGCCAATCAT-3'，下游引物5'-GACATTAGACCTCGCCTTCAG-3'；小鼠GAPDH上游引物5'-GAGAAGGCTGGGGCTCAC-3'，下游引物5'-GTTGTC ATGGATGACCTTGGC-3'。根据试剂盒说明书配制成20 µL体系，反应条件为：95℃ 10 min预变性，95℃ 5 s 变性，60℃ 30 s 退火和72℃ 30 s 延伸，共计40个循环后，绘制溶解曲线。按上述方法1.3计算相对表达量。
1.5.3 细胞蛋白表达量测定
根据蛋白提取盒说明书所示，在细胞培养皿中加入RIPA裂解液，提取总蛋白；根据BCA试剂盒进行蛋白定量；加十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液煮沸10 min，取20 µg蛋白样品上样，10% SDS-PAGE电泳（80 V，30 min，然后100 V，60 min）；放入4℃层析柜中转膜（电流150 mA，12%胶转50 min，8%胶转90 min）；5%脱脂牛奶50 mL室温封闭1 h；加一抗HIPK1 （1∶1 000）、α-SMA（1∶1 000）、CollagenⅠ（1∶1 000）内参、GDPDH （1∶1 000）4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，配显影液（说明书按A∶B∶C=1∶1∶1比例混合），与蛋白膜反应15 s后，在凝胶成像系统中曝光并采集图像；采用Image lab软件进行蛋白条带分析，用HIPK1条带灰度值与GAPDH条带灰度值比较计算HIPK1的相对表达量。
1.6 双荧光素酶报告基因检测
将HIPK1 3'UTR区域（预测出来的与miR-484结合的位点）构建到pmiR-GLO载体的海肾荧光素酶基因的后面，称之为正常（WT）型；将结合位点突变后构建获得的称之为突变（MUT）型；以萤火虫荧光素酶为内参。将WT型与MUT型载体质粒与miR-484 mimics 和miR-484 NC mimics质粒共转染293T细胞。由此分为4组，即：WT+miR-484 mimics、WT+NC-mimics、MUT+miR-484 mimics、WUT+NC-mimics。培养48 h后，按双荧光素酶报告检测试剂盒说明书裂解细胞并于双荧光素酶报告基因系统分别检测其荧光值，并进一步计算荧光素酶活性。
1.7 统计学分析
使用 SPSS 22.0 进行统计分析与处理。Kolmogorov-Smirnov检验用于检验计量资料是否服从正态分布，正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）描述，两组间比较采用独立样本t检验；不符合则用中位数（上下四分位数）［M（Q1，Q3）］描述，两组间比较采用非参数检验；多组间计量资料比较采用One-way ANOVA。计数资料采用率描述，组间比较采用χ2 检验。P≤0.05表示差异有统计学意义。
1.8 伦理审查
本研究已通过四川大学华西医院伦理委员会批准（2018250）。研究遵循世界卫生组织赫尔辛基宣言拟定的道德标准，所有的入选患者在研究前均被给予研究知情同意书，本研究也对所有研究中的临床资料坚持严格的保密原则。动物实验方案经四川大学华西医院动物实验伦理委员会审查和批准（2018107A）。对动物的所有操作均符合美国国立卫生研究院发布的关于用于生物医学研究的实验动物的使用和护理指南（第85-23号，1996年修订）。
2 结果
2.1 心肌组织中miRNAs表达量测定
根据心肌组织切片进行Masson染色，分别计算各样本CVF值。轻度纤维化组CVF值明显低于重度纤维化组，差异具有统计学意义（12.128%±2.104% vs. 42.936%±9.528%，P<0.05）。 在轻度与重度纤维化组中分别检检测miR-221、miR-222、miR-19b和miR-484的表达差异，结果显示miR-221、miR-222和miR-484在重度纤维化组的表达量明显高于轻度纤维化组，而miR-19b则明显低于轻度纤维化组，差异均具有统计学意义；见图1。
图1
轻、重度纤维化组的心肌组织中miRNAs表达情况
*：
2.2 心脏成纤维细胞活化前、后miRNAs表达量
心脏成纤维细胞受TGF-β1刺激增殖分化为肌成纤维细胞，与活化前比较，miR-484、miR-221和miR-222表达量分别为：miR-484：5.375±1.032 vs. 1.060±0.068（P<0.05），miR-221：2.638±0.531 vs. 1.096±0.124（P<0.05）， miR-222：2.036±0.349 vs. 0.987±0.047（P<0.05），可见心脏成纤维细胞活化后其表达量均明显增加，而miR-19b表达量在活化前、后无明显变化（0.988±0.034 vs. 1.061±0.197，P>0.05）；见图2。因miR-484在活化后表达量大于活化前的4倍以上，故选择miR-484进行后续研究。
图2
miRNAs在 CF 活化前、后的表达差异
Control：对照组；TGF-β1：转化生长因子-β1；CF：心脏成纤维细胞；*：
2.3 调控miRNA-484表达对心脏成纤维细胞表型变化的影响
心脏成纤维细胞受TGF-β1刺激活化后，分别转染miR-484 antagomir或NC antagomir。通过检测miR-484的表达发现，转染NC antagomir与转染miR-484 antagomir的心脏成纤维细胞中miR-484的表达量分别为 5.466±0.317和0.301±0.013（P<0.05），可见miR-484表达水平较明显下降，证明转染成功。
我们进一步检测了心脏成纤维细胞中的促纤维化相关蛋白在各组中的表达情况，结果发现：转染NC antagomir组与miR-484 antagomir组中，α-SMA蛋白表达水平分别为2.964±0.022和1.654±0.021（P<0.05）；CollagenⅠ在两组中的蛋白表达量分别为2.725±0.077和1.277±0.721（P<0.05）；见图3。
图3
调控miRNA-484表达后，纤维化相关蛋白在心脏成纤维细胞中的表达情况
a：免疫印迹条带图；b：促纤维化蛋白表达量；α-SMA：α-肌动蛋白；CollagenⅠ：Ⅰ型胶原蛋白；*：
2.4 调控miRNA-484表达后靶基因的表达变化
心脏成纤维细胞经TGF-β1刺激转化为肌成纤维细胞。再分别转染miR-484 antagomir和 NC antagomir，并分别在mRNA和蛋白水平测定了HIPK1 的表达情况（使用GAPDH为内参基因）。结果如下：心脏成纤维细胞在TGF-β1刺激活化后，miR-484表达增加，HIPK1的mRNA表达量在活化前与活化后的表达量分别为1.001±0.019 和0.501±0.232（P<0.05）；而转染NC antagomir和miR-484 antagomir后，HIPK1的mRNA表达量在两组间的表达水平分别为0.626±0.077和0.595±0.095（ P>0.05）；在蛋白表达水平，HIPK1在TGF-β1+NC antagomir组与TGF-β1+miR-484 antagomir组的表达量分别为0.326±0.015和0.972±0.013（P<0.05）；见图4。
图4
调控miR-484表达后靶基因HIPK1的蛋白表达变化
a：免疫印迹条带图；b：HIPK1 表达量；TGF-β1：转化生长因子-β1；C：对照组；T：TGF-β1组；T+N：TGF-β1+NC antagomir组；T+M：TGF-β1+miR-484 antagomir组；HIPK-1：同源结构域相互蛋白激酶-1；**：
2.5 双荧光素酶报告基因检测结果
预测结合位点，并定义MUT组和WT组。结合位点突变者为MUT组，结合位点未突变者为WT组。分别与NC mimics、miR-484 mimics共转染后，再分别比较它们的荧光素酶活性，结果如下：MUT组：转染NC mimics与转染miR-484 mimics的荧光素酶活性分别为1.012±0.021和0.990±0.002（P>0.05）；而在WT组，它们的荧光素酶活性分别为0.995±0.050和0.662±0.008（P<0.05）。可见将带有结合位点的质粒与miR-484 mimics质粒共转染后荧光素酶活性明显下降，这表明HIPK1与miR-484之间存在靶向结合关系。
3 讨论
心肌纤维化是心脏针对各种刺激（生理或病理）所作出的病理反应，是引起心功能衰竭的重要病理生理机制。HCM尤其是合并流出道梗阻者，长时间的压力超负荷会导致严重的间质和血管周围纤维化[10-12]，严重破坏心脏结构，使心肌兴奋-收缩耦合机制严重受损，收缩和舒张功能进行性下降，出现恶性心律失常、心力衰竭甚至死亡的严重后果[13-14]。
心脏成纤维细胞是纤维化主要的效应细胞，它在各种病因刺激下转分化为具有分泌和收缩功能的肌成纤维细胞，是驱动纤维化的关键因素[15]。心脏成纤维细胞是肌成纤维细胞的主要来源[16]。在各种病理因素作用下，心脏成纤维细胞被激活并转分化为具有广泛内质网的肌成纤维细胞，可合成和分泌收缩蛋白如α-SMA，是细胞活化成熟的表型特征[17]，故α-SMA有助于识别组织中的肌成纤维细胞。miRNAs是研究最为普遍的非编码RNA，它可以调节多种细胞类型。现已证实，多种miRNAs参与了心脏成纤维细胞的活化过程。既往文献[18]报道，miR-484已被证实参与了肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移等过程，同时，miR-484已被报道参与了肝脏纤维化过程，而其在心肌纤维化中的作用尚未阐明。我们在肥厚型心肌患者心肌组织样本中发现：在重度纤维化组中，miR-484的表达量明显高于轻度纤维化组，证明miR-484可能参与HCM患者心肌纤维化的过程。进一步的细胞实验显示，心脏成纤维细胞受到TGF-β1刺激后，α-SMA蛋白表达量明显增加，证明成纤维细胞得到活化。并在其活化前、后分别测量了miR-484的表达，发现miR-484的表达量也明显上调，CollagenⅠ的表达也随之增加。而使用miR-484 antagomir下调miR-484的表达后，心脏成纤维细胞中α-SMA和CollagenⅠ的表达量也随之下降，证明心脏成纤维细胞的活化受到了抑制。由此可得出，细胞内miR-484的变化可能参与心脏成纤维细胞活化过程，调控miR-484 的表达可抑制心脏成纤维细胞介导的心肌纤维化过程，从而缓解纤维化程度。可见细胞内miR-484可成为心肌纤维化的调控靶点，为心肌纤维化治疗提供策略。
另外，在我们的研究中，首次发现HIPK1为miR-484的直接靶标。体外实验发现：在心脏成纤维细胞增殖、分化过程中，miR-484表达明显增加，HIPK1 mRNA水平下降，在转染miR-484 antagomir下调miR-484的表达后，虽然HIPK1在mRNA水平无明显改变，但在蛋白表达水平，HIPK1的表达水平较转染NC antagomir组明显升高，证明细胞内miR-484可调控HIPK1的表达。双荧光素酶报告基因检测也发现：miR-484与HIPK1之间存在靶向结合位点，故确认HIPK1为miR-484的靶基因之一。既往研究[19-20]发现：HIPK1是蛋白激酶的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）家族成员，其高度保守，可通过多种途径参与细胞增殖、凋亡和mRNA的转录等过程，在器官纤维化方面，可通过激活TGF-β信号通路的上游因子参与肾脏纤维化的发生、发展。Hong 等[21]的研究发现，miR-22是一种抗纤维化的miRNA，其过度表达可抑制其靶基因HIPK1的表达，进而抑制血管紧张素Ⅱ诱导的纤维化过程，是治疗心脏纤维化的潜在靶点。可见HIPK1可作为miRNAs的靶基因参与纤维化的过程。在我们的研究中也得出miR-484通过HIPK1参与了心肌纤维化的调控。
综上所述，细胞内miR-484参与心肌纤维化的过程是通过其调控目标基因HIPK1的表达来实现，下调miR-484可拮抗心脏成纤维细胞的纤维化反应，抑制心脏成纤维细胞介导的心肌纤维化的过程，细胞内miR-484的变化可能与心脏纤维化过程有关。下一步，我们将进行深入研究，以明确miR-484是否可成为调控的位点，制定延缓甚至逆转心肌纤维化的新方案。
利益冲突：无。
作者贡献：赁可负责研究构思与设计，论文修改；黄德荣负责实验操作，数据收集、分析，论文撰写；陈忠秀负责课题设计，资料分析，论文修改；陈红英、陈雪梅负责实验设计，指导实验操作，数据收集、分析、统计。
