引用本文： 蔺军平, 孟于琪, 李斌, 冯海明, 李政. DDX46基因调控TE-1食管鳞状细胞癌细胞侵袭转移行为的相关性研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(7): 1030-1037. doi: 10.7507/1007-4848.202204019 复制
食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，我国属于食管癌的高发地域，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第6位和第5位[1]。近些年随着研究的深入，食管癌的手术治疗、根治性放化疗、联合免疫治疗、靶向治疗等均取得了相当的成果[2]，并逐渐形成了以外科手术治疗为主的综合治疗模式[3]，但目前整体治疗效果并不理想。数据显示，中国食管癌患者的整体5年生存率仅为29.7%[4]，这与食管癌细胞的侵袭和转移等恶性生物学行为密切相关。RNA解旋酶是RNA代谢活动中起重要作用的物质，可利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解产生的能量参与RNA的转录、剪接和生物合成等代谢过程[5]。DDX46作为RNA解旋酶家族成员参与多种肿瘤的发生、发展过程[6-10]。先前的研究[11]已经证实了食管鳞状细胞癌（鳞癌）组织及细胞中存在DDX46基因及蛋白的过表达，敲减DDX46基因能够抑制食管鳞癌细胞的增殖并诱发细胞凋亡。本研究通过shRNA慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞以敲减DDX46基因表达，初步探讨DDX46与食管鳞癌细胞侵袭和转移过程的相关性及可能存在的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
主要试剂：anti-DDX46（美国Sigma），anti-GAPDH（美国Santa Cruz），anti-rabbit IgG（美国Santa Cruz），BCA蛋白浓度测定试剂（上海碧云天），Bulge-LoopTM miRNARTFQPCR Primer Set（广州锐博），D-Hanks（上海吉凯），DMEM（美国Corning），dNTPs（美国Promega），M-MLV（美国Promega），ECL-PLUS/Kit（美国Thermo），matrigel基质胶（BD Biocoat），Oligo dT（上海生工），Prestained Protein Marker（美国Thermo），Puromycin（美国Clontech），PVDF膜（美国Millipore），RIPA裂解液（上海碧云天），RNase Inhibitor（美国Promega），SYBR Master Mixture（日本TaKaRa），0.5%结晶紫水溶液（上海源叶），TRIzol提取液（上海普飞），X线胶片定影粉和显影粉（上海冠龙），侵袭试剂盒（美国Corning），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，澳大利亚Ausbian），胰酶（上海生工），引物（上海吉凯）。主要仪器：PCR仪（瑞士Roche），蛋白电泳仪和蛋白转膜仪（上海天能），电泳稳压电源及稳压电泳仪（上海天能），离心机（美国赛默飞），CO2培养箱（日本Sanyo），荧光显微镜（日本Olympus）。
1.2 细胞培养及转染
TE-1食管鳞癌细胞由上海生命科学研究院细胞资源中心提供，上海吉凯基因化学技术有限公司负责完成慢病毒的制备包装及基因靶点序列设计。DDX46基因shRNA序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'（shDDX46组），阴性shCtrl对照序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（shCtrl组）[12]。胰蛋白酶消化对数生长期TE-1食管鳞癌细胞，然后用完全培养基制成（3～5）×104个/mL的悬液，均匀接种至6孔板中继续培养；铺板量达30%左右时，更换感染培养基，加入适量的慢病毒进行感染，具体操作同慢病毒转染实验[13]；感染后12 h更换常规培养基继续培养；观察各组细胞状态良好，未见大量死亡现象；72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达量，即为转染效率，细胞转染率达70%以上可继续下游实验。
1.3 实时荧光定量PCR
收集对数生长期的目的细胞，经Trizol裂解液充分裂解后提取总RNA。选择GAPDH为内参基因 ，两步法进行PCR。首先参照M-MLV 操作要求进行反转录获得 cDNA，再以cDNA为模板进行PCR。DDX46基因mRNA的相对表达量F=2-∆∆Ct，即反映各样品相对shCtrl组样品目的基因的相对表达水平（ΔCt=DDX46基因Ct值−GAPDH基因Ct值，ΔΔCt=shRNA组ΔCt均数值−shCtrl组ΔCt均数值）。实验重复进行3次。
1.4 蛋白质印迹
提取转染成功的TE-1食管鳞癌细胞中的总蛋白，检测DDX46基因敲减前后DDX46蛋白及纤连蛋白的表达变化情况，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每孔上样量20 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后改用条件为4℃、300 mA恒定电流持续电转150 min，转移蛋白到PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液在室温条件下封闭1 h，使用封闭液稀释一抗（anti-DDX46：1∶200；anti-Fibronectin：1∶500；anti-GAPDH：1∶2 000）后将封闭好的PVDF膜在室温条件下孵育2 h，TBST清洗；同样用封闭液稀释二抗（anti-rabbit IgG：1∶2 000；anti-mouse IgG：1∶2 000）后与PVDF膜在室温环境中孵育1.5 h，TBST清洗；显色，拍照。采用Image J软件进行灰度值分析。
1.5 划痕实验
依据实验分组在各孔中依次加入5×105个慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞，24 h后更换低浓度血清培养基，采用划痕仪在96孔板的细胞层上划痕，使用无血清培养基漂洗2～3遍后加入低浓度血清培养基，放入37℃、5% CO2培养箱培养，细胞生长状态良好，分别于0 h及8 h时间点随机选择3孔拍照记录，结果根据划痕间距随时间的改变量计算DDX46基因敲减前后的细胞迁移率。
1.6 Transwell小室实验
接种TE-1食管鳞癌细胞到Transwell小室上室中，确保接种细胞数达到5×105个/孔，下室内加入30% FBS培养基600 µL；接种TE-1细胞后于37℃恒温CO2培养箱培养24 h，培养结束后去除上室中未转移的细胞及多余培养基，向小室膜的下表面滴入0.5%结晶紫水溶液染色5 min，冲洗后晾干。200倍镜下随机选取3孔，各9个不同视野拍照，计数分析。
1.7 侵袭实验
从冰箱−20℃中取出试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，无菌操作台内放置使其恢复到室温，将500 μL无血清培养基加入小室后将其置入37℃ 恒温CO2培养箱中静置2 h，待聚碳酸酯膜上的Matrigel基质层水化完成后，将侵袭小室转移至新的24孔板中，小心除去侵袭小室中的多余培养基后，下层小室内加入30% FBS培养基750 μL，上层小室中加入500 μL TE-1食管鳞癌细胞悬液，另用该细胞悬液铺24孔板为侵袭对照，并确保接种细胞数达到5×105个/孔，接种后37℃培养箱中培养24 h，培养结束后去除多余培养基和未转移细胞，向小室膜的下表面滴入0.5%结晶紫水溶液染色5 min，冲洗晾干。200倍镜下随机选取3孔，各9个不同视野拍照，计数分析。
1.8 差异基因在经典通路中的富集分析
本课题组前期研究[14]采用Affymetrix人类全基因表达谱芯片检测敲减DDX46基因后的TE-1食管鳞癌细胞中全基因的表达丰度变化，获得差异基因表达谱。本研究中将前期获得的差异表达基因导入Ingenuity Pathway Analysis（www.ingenuity.com，IPA）在线工具中分析差异基因调控经典通路的状态变化[15]，所有的信号通路使用−log（P-value）进行排序，得到差异基因在经典信号通路中的富集情况，结果采用信号通路柱状图表示。
1.9 统计学分析
结果采用SPSS 23.0软件分析，计量资料服从正态分布，采用均数±标准差（
±s）表示，组间比较采用t检验，t检验前先进行F检验，当F检验值>0.05时按等方差双样本检验得到t检验值，当F检验值≤0.05时按异方差双样本检验得到t检验值。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 慢病毒转染及效率评价
慢病毒转染后72 h于荧光显微镜下观察TE-1食管鳞癌细胞中绿色荧光蛋白表达情况，shDDX46组和shCtrl组细胞荧光率达到80%以上，提示TE-1细胞感染率达到80%以上；见图1a。PCR结果显示，TE-1食管鳞癌细胞经shRNA慢病毒转染后，DDX46基因表达明显下调，基因敲减效率达88.2%（P=0.011）；见图1b。同时Western blotting结果显示DDX46基因在蛋白水平的表达也被显著抑制；见图1c。上述结果表明shRNA慢病毒转染后TE-1食管鳞癌细胞中DDX46基因实现敲减表达，目的基因靶点是有效靶点，转染效率及敲减效率均满足后续实验要求。
图1
慢病毒转染效率及DDX46基因敲减效率检测
a：慢病毒TE-1细胞感染率达到80%以上（100×）；b：PCR检测DDX46基因在mRNA水平的表达丰度；c：Western blotting检测DDX46基因目的蛋白表达变化
2.2 敲减DDX46基因后细胞迁移能力变化
2.2.1 划痕实验
TE-1细胞慢病毒转染成功后接种到划痕仪上培养，在划痕后8 h测量划痕间距的改变量，shDDX46组细胞平均迁移率低于shCtrl组，差异有统计学意义（0.41±0.04 vs. 0.61±0.02，P=0.001），提示敲减DDX46基因后TE-1食管鳞癌细胞的迁移能力减弱；见图2。
图2
划痕实验
a：DDX46基因敲减前后TE-1食管鳞癌细胞划痕间距的变化图；b：shCtrl组与shDDX46组细胞迁移率的比较
2.2.2 Transwell小室实验
两组转移细胞数分别为170.00±1.43、81.00±8.08，shDDX46组转移细胞数显著少于shCtrl组，细胞转移率下降了52%，差异有统计学意义（P<0.001），说明敲减DDX46基因表达能抑制TE-1食管鳞癌细胞的迁移能力；见图3。
图3
Transwell小室实验
a：慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞在Transwell小室内孵育24 h后，于200倍镜下观察细胞转移情况；b：细胞相对转移率
2.3 敲减DDX46基因后细胞侵袭能力变化
将慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞接种到侵袭小室培养24 h，染色晾干后拍照，分析计数发现shDDX46组能透过Matrigel基质胶和滤膜的细胞数量少于shCtrl组，相比shCtrl组，shDDX46组细胞侵袭率降低了54%（P<0.001），表明敲减DDX46基因使得TE-1食管鳞癌细胞的侵袭能力明显减弱；见图4。
图4
侵袭实验
a：转染后的TE-1细胞在侵袭小室内孵育24 h后，于200倍镜下观察细胞侵袭情况；b：侵袭细胞数的变化
2.4 富集分析及纤连蛋白表达情况
敲减DDX46基因后TE-1食管鳞癌细胞差异基因在经典信号通路中的富集情况见图5。差异基因对18个经典信号通路均有调控作用，而在敲减食管鳞癌细胞DDX46基因后仅有整合素信号通路（Z-score为−2.324）的活性是被显著抑制的，而其他信号通路的活性无明显变化，因此整合素信号通路可能受到DDX46基因调控。进一步的Western blotting结果显示敲减食管鳞癌细胞中DDX46基因后，TE-1食管鳞癌细胞与细胞粘附相关的纤连蛋白表达量较shCtrl组减少，其相对表达量下降了11%；见图6。
图5
差异基因在18条经典信号通路中的富集分析结果
横坐标代表经典信号通路名称，纵坐标表示差异基因在信号通路中富集的显著性水平，其中纵坐标值越大，表示差异基因在该信号通路中越富集，Ratio表示在该信号通路中差异基因数与该通路中包含的所有基因数的比值。图中采用蓝色标注的信号通路代表通路被抑制，而使用橙色标注的信号通路则代表通路被激活，当｜Z-score｜>2表示差异基因对通路的调控作用显著
图6
纤连蛋白表达情况
a：Western blotting 检测纤连蛋白表达条带；b：经shCtrl校正后的纤连蛋白相对定量分析结果
3 讨论
肿瘤的侵袭和转移行为是肿瘤细胞具有恶性特征的主要体现，也是引发患者临床治疗失败和预后不良的直接原因。DDX46作为依赖于ATP的RNA解旋酶家族成员，可以在mRNA前体剪接与核糖体组装的过程中发挥重要作用，参与肿瘤的发生、发展过程。现已发现DDX46在多种肿瘤组织及细胞中存在过表达，沉默DDX46基因可抑制结直肠癌及皮肤鳞癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[6, 9]。在骨肉瘤的研究[8]中发现，敲减DDX46可以在下调细胞内磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化水平后，实现抑制骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移。同样在神经胶质瘤的研究[10]中发现DDX46可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶-p38信号通路增强胶质瘤细胞的增殖能力，但其迁移能力与DDX46并无显著关联。一项有关胃癌的研究[7]发现，DDX46在胃癌组织及细胞中均存在过表达，敲减 DDX46可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，这个过程可能是DDX46敲减抑制了胃癌细胞中的 Akt/GSK-3β/β-catenin 信号通路，值得注意的是，Akt或β-catenin过表达的激活逆转了DDX46敲减所产生的抗癌作用。另有研究[16]报道，在子痫前期的孕妇患者胎盘组织中发现DDX46基因的mRNA水平低于正常孕妇，敲减DDX46基因能显著抑制滋养层细胞增殖并降低滋养层细胞的迁移和侵袭能力，而DDX46的过表达能促进滋养层细胞的迁移和侵袭；敲减DDX46后，PI3K、Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白水平呈现下降趋势。这与我们课题组前期完成的DDX46与食管鳞癌细胞增殖和凋亡实验中的研究[12]结果一致。但是关于DDX46基因与食管鳞癌细胞侵袭和转移行为的相关性目前并不明确。
本研究通过慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞实现了DDX46基因敲减，相比空载体转染，shRNA慢病毒转染组DDX46基因的敲减效率达80%，证明目的基因靶点为有效靶点。后续划痕间距的改变提示在敲减DDX46基因表达后食管鳞癌细胞的迁移能力下降，同时Transwell小室实验中通过滤膜转移到下室的细胞数目相比对照组减少，表明敲减DDX46基因能抑制食管鳞癌细胞的迁移能力。同样在侵袭实验中观察到，shDDX46组食管鳞癌细胞通过降解滤膜表面基质胶进入下室的细胞数相比对照组减少。食管鳞癌细胞要通过滤膜，首先需要分泌基质金属蛋白酶降解附着于滤膜表面的基质胶，因此敲减DDX46基因后食管鳞癌细胞的侵袭能力下降，这一过程可能是通过降低基质金属蛋白酶的表达实现的。
为了进一步探讨其可能存在的作用机制，本研究将前期通过敲减DDX46基因后获得的食管鳞癌细胞差异基因表达谱[14]导入IPA在线分析工具中进行经典通路的富集分析，差异基因所调控的经典通路由IPA所收集归纳的800条信号、代谢通路所总结。结果显示在18条经典信号通路中整合素信号通路的活性被显著抑制，而与粘附相关的整合素作为整合素信号通路中的关键分子，能借助精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD）结合胞外基质中的纤连蛋白，为此我们进一步检测了纤连蛋白的表达情况。结果表明在敲减TE-1食管鳞癌细胞DDX46基因后间质中纤连蛋白的表达下调，同样敲减DDX46基因后食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力下降，因此敲减DDX46基因可能是通过下调整合素信号通路影响细胞粘附功能，从而改变肿瘤细胞的侵袭和转移能力。
整合素一方面介导了细胞与细胞间、细胞与细胞外基质以及细胞与病原体之间的相互作用[17]，能在细胞表面与细胞外基质中的纤连蛋白结合，提供肿瘤细胞粘附和迁移的位点[18]；另一方面，整合素是连接细胞内外信号传导过程的桥梁[19]，能够双向传导跨膜信号，可与信号通路中的下游分子在细胞内集聚启动多条胞内信号转导途径，从而影响肿瘤细胞的生理和病理功能[20]。当整合素受到胞外因素的刺激后，细胞表面的整合素RGD序列结合纤连蛋白等介导细胞粘附，而整合素位于胞内片段则通过黏着斑蛋白将细胞外基质与细胞骨架的肌动蛋白连接在一起，形成细胞外基质‐整合素‐细胞骨架跨膜信号结构，使胞外刺激信号传递到细胞骨架，细胞骨架的结构改变引发细胞运动介导细胞迁移[21]。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是黏着斑蛋白的重要成分，在细胞质中的激酶活性主要依赖整合素信号传导[22]，是整合素信号通路的下游分子，参与多种肿瘤的发生、发展过程[17]。FAK作为整合素信号通路中胞外信号向胞内传递的关键分子，通过黏着斑的形成和细胞骨架的重构介导了多种肿瘤的侵袭和转移行为[23-25]。PI3K/AKT是细胞内进行信号传递的重要通路，而PI3K作为细胞内PI3K/Akt信号通路的节点，也是整合素信号通路下游的分子，当细胞内接收胞外基质与整合素及黏着斑所传递的信号刺激后，PI3K结合FAK并被活化，完成信号的传递。相关研究[26-27]发现，FAK/PI3K/Akt信号通路传导途径能够影响肝癌细胞及结直肠癌细胞的侵袭和转移等恶性生物学行为。本课题组的前期研究[28]表明，敲减DDX46基因后细胞内PI3K及Akt均呈现下调表达，PI3K/Akt通路及下游部分分子表达被抑制。PI3K/Akt信号通路也参与食管癌细胞的侵袭和转移等系列恶性行为的发生[29]。因此，敲减DDX46后整合素信号通路的活性下降，引起细胞内外信号传导障碍，同时细胞骨架的重构进一步降低了细胞的侵袭与迁移能力。
综上所述，DDX46基因参与调控食管鳞癌细胞的侵袭和迁移过程，敲减DDX46基因可能是通过下调整合素通路信号，使得细胞外信号向细胞内传递过程受阻，影响细胞粘附及骨架重构，从而抑制食管鳞癌细胞侵袭和转移能力，未来有望为食管癌的治疗提供新的思路。
利益冲突：无。
作者贡献：蔺军平参与研究设计，实验实施，论文初稿撰写；孟于琪参与论文设计与数据统计学分析；李斌参与研究设计与指导，论文审阅修改；冯海明参与论文的数据整理与生物信息学分析；李政参与研究相关的实验操作。
食管癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，我国属于食管癌的高发地域，其发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤的第6位和第5位[1]。近些年随着研究的深入，食管癌的手术治疗、根治性放化疗、联合免疫治疗、靶向治疗等均取得了相当的成果[2]，并逐渐形成了以外科手术治疗为主的综合治疗模式[3]，但目前整体治疗效果并不理想。数据显示，中国食管癌患者的整体5年生存率仅为29.7%[4]，这与食管癌细胞的侵袭和转移等恶性生物学行为密切相关。RNA解旋酶是RNA代谢活动中起重要作用的物质，可利用三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解产生的能量参与RNA的转录、剪接和生物合成等代谢过程[5]。DDX46作为RNA解旋酶家族成员参与多种肿瘤的发生、发展过程[6-10]。先前的研究[11]已经证实了食管鳞状细胞癌（鳞癌）组织及细胞中存在DDX46基因及蛋白的过表达，敲减DDX46基因能够抑制食管鳞癌细胞的增殖并诱发细胞凋亡。本研究通过shRNA慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞以敲减DDX46基因表达，初步探讨DDX46与食管鳞癌细胞侵袭和转移过程的相关性及可能存在的作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和设备
主要试剂：anti-DDX46（美国Sigma），anti-GAPDH（美国Santa Cruz），anti-rabbit IgG（美国Santa Cruz），BCA蛋白浓度测定试剂（上海碧云天），Bulge-LoopTM miRNARTFQPCR Primer Set（广州锐博），D-Hanks（上海吉凯），DMEM（美国Corning），dNTPs（美国Promega），M-MLV（美国Promega），ECL-PLUS/Kit（美国Thermo），matrigel基质胶（BD Biocoat），Oligo dT（上海生工），Prestained Protein Marker（美国Thermo），Puromycin（美国Clontech），PVDF膜（美国Millipore），RIPA裂解液（上海碧云天），RNase Inhibitor（美国Promega），SYBR Master Mixture（日本TaKaRa），0.5%结晶紫水溶液（上海源叶），TRIzol提取液（上海普飞），X线胶片定影粉和显影粉（上海冠龙），侵袭试剂盒（美国Corning），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，澳大利亚Ausbian），胰酶（上海生工），引物（上海吉凯）。主要仪器：PCR仪（瑞士Roche），蛋白电泳仪和蛋白转膜仪（上海天能），电泳稳压电源及稳压电泳仪（上海天能），离心机（美国赛默飞），CO2培养箱（日本Sanyo），荧光显微镜（日本Olympus）。
1.2 细胞培养及转染
TE-1食管鳞癌细胞由上海生命科学研究院细胞资源中心提供，上海吉凯基因化学技术有限公司负责完成慢病毒的制备包装及基因靶点序列设计。DDX46基因shRNA序列：5'-AGAAATCACCAGGCTCATA-3'（shDDX46组），阴性shCtrl对照序列：5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（shCtrl组）[12]。胰蛋白酶消化对数生长期TE-1食管鳞癌细胞，然后用完全培养基制成（3～5）×104个/mL的悬液，均匀接种至6孔板中继续培养；铺板量达30%左右时，更换感染培养基，加入适量的慢病毒进行感染，具体操作同慢病毒转染实验[13]；感染后12 h更换常规培养基继续培养；观察各组细胞状态良好，未见大量死亡现象；72 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达量，即为转染效率，细胞转染率达70%以上可继续下游实验。
1.3 实时荧光定量PCR
收集对数生长期的目的细胞，经Trizol裂解液充分裂解后提取总RNA。选择GAPDH为内参基因 ，两步法进行PCR。首先参照M-MLV 操作要求进行反转录获得 cDNA，再以cDNA为模板进行PCR。DDX46基因mRNA的相对表达量F=2-∆∆Ct，即反映各样品相对shCtrl组样品目的基因的相对表达水平（ΔCt=DDX46基因Ct值−GAPDH基因Ct值，ΔΔCt=shRNA组ΔCt均数值−shCtrl组ΔCt均数值）。实验重复进行3次。
1.4 蛋白质印迹
提取转染成功的TE-1食管鳞癌细胞中的总蛋白，检测DDX46基因敲减前后DDX46蛋白及纤连蛋白的表达变化情况，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每孔上样量20 μg进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后改用条件为4℃、300 mA恒定电流持续电转150 min，转移蛋白到PVDF膜上，用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液在室温条件下封闭1 h，使用封闭液稀释一抗（anti-DDX46：1∶200；anti-Fibronectin：1∶500；anti-GAPDH：1∶2 000）后将封闭好的PVDF膜在室温条件下孵育2 h，TBST清洗；同样用封闭液稀释二抗（anti-rabbit IgG：1∶2 000；anti-mouse IgG：1∶2 000）后与PVDF膜在室温环境中孵育1.5 h，TBST清洗；显色，拍照。采用Image J软件进行灰度值分析。
1.5 划痕实验
依据实验分组在各孔中依次加入5×105个慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞，24 h后更换低浓度血清培养基，采用划痕仪在96孔板的细胞层上划痕，使用无血清培养基漂洗2～3遍后加入低浓度血清培养基，放入37℃、5% CO2培养箱培养，细胞生长状态良好，分别于0 h及8 h时间点随机选择3孔拍照记录，结果根据划痕间距随时间的改变量计算DDX46基因敲减前后的细胞迁移率。
1.6 Transwell小室实验
接种TE-1食管鳞癌细胞到Transwell小室上室中，确保接种细胞数达到5×105个/孔，下室内加入30% FBS培养基600 µL；接种TE-1细胞后于37℃恒温CO2培养箱培养24 h，培养结束后去除上室中未转移的细胞及多余培养基，向小室膜的下表面滴入0.5%结晶紫水溶液染色5 min，冲洗后晾干。200倍镜下随机选取3孔，各9个不同视野拍照，计数分析。
1.7 侵袭实验
从冰箱−20℃中取出试剂盒，将所需数目的小室置于新的24孔板中，无菌操作台内放置使其恢复到室温，将500 μL无血清培养基加入小室后将其置入37℃ 恒温CO2培养箱中静置2 h，待聚碳酸酯膜上的Matrigel基质层水化完成后，将侵袭小室转移至新的24孔板中，小心除去侵袭小室中的多余培养基后，下层小室内加入30% FBS培养基750 μL，上层小室中加入500 μL TE-1食管鳞癌细胞悬液，另用该细胞悬液铺24孔板为侵袭对照，并确保接种细胞数达到5×105个/孔，接种后37℃培养箱中培养24 h，培养结束后去除多余培养基和未转移细胞，向小室膜的下表面滴入0.5%结晶紫水溶液染色5 min，冲洗晾干。200倍镜下随机选取3孔，各9个不同视野拍照，计数分析。
1.8 差异基因在经典通路中的富集分析
本课题组前期研究[14]采用Affymetrix人类全基因表达谱芯片检测敲减DDX46基因后的TE-1食管鳞癌细胞中全基因的表达丰度变化，获得差异基因表达谱。本研究中将前期获得的差异表达基因导入Ingenuity Pathway Analysis（www.ingenuity.com，IPA）在线工具中分析差异基因调控经典通路的状态变化[15]，所有的信号通路使用−log（P-value）进行排序，得到差异基因在经典信号通路中的富集情况，结果采用信号通路柱状图表示。
1.9 统计学分析
结果采用SPSS 23.0软件分析，计量资料服从正态分布，采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，t检验前先进行F检验，当F检验值>0.05时按等方差双样本检验得到t检验值，当F检验值≤0.05时按异方差双样本检验得到t检验值。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 慢病毒转染及效率评价
慢病毒转染后72 h于荧光显微镜下观察TE-1食管鳞癌细胞中绿色荧光蛋白表达情况，shDDX46组和shCtrl组细胞荧光率达到80%以上，提示TE-1细胞感染率达到80%以上；见图1a。PCR结果显示，TE-1食管鳞癌细胞经shRNA慢病毒转染后，DDX46基因表达明显下调，基因敲减效率达88.2%（P=0.011）；见图1b。同时Western blotting结果显示DDX46基因在蛋白水平的表达也被显著抑制；见图1c。上述结果表明shRNA慢病毒转染后TE-1食管鳞癌细胞中DDX46基因实现敲减表达，目的基因靶点是有效靶点，转染效率及敲减效率均满足后续实验要求。
图1
慢病毒转染效率及DDX46基因敲减效率检测
a：慢病毒TE-1细胞感染率达到80%以上（100×）；b：PCR检测DDX46基因在mRNA水平的表达丰度；c：Western blotting检测DDX46基因目的蛋白表达变化
2.2 敲减DDX46基因后细胞迁移能力变化
2.2.1 划痕实验
TE-1细胞慢病毒转染成功后接种到划痕仪上培养，在划痕后8 h测量划痕间距的改变量，shDDX46组细胞平均迁移率低于shCtrl组，差异有统计学意义（0.41±0.04 vs. 0.61±0.02，P=0.001），提示敲减DDX46基因后TE-1食管鳞癌细胞的迁移能力减弱；见图2。
图2
划痕实验
a：DDX46基因敲减前后TE-1食管鳞癌细胞划痕间距的变化图；b：shCtrl组与shDDX46组细胞迁移率的比较
2.2.2 Transwell小室实验
两组转移细胞数分别为170.00±1.43、81.00±8.08，shDDX46组转移细胞数显著少于shCtrl组，细胞转移率下降了52%，差异有统计学意义（P<0.001），说明敲减DDX46基因表达能抑制TE-1食管鳞癌细胞的迁移能力；见图3。
图3
Transwell小室实验
a：慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞在Transwell小室内孵育24 h后，于200倍镜下观察细胞转移情况；b：细胞相对转移率
2.3 敲减DDX46基因后细胞侵袭能力变化
将慢病毒转染后的TE-1食管鳞癌细胞接种到侵袭小室培养24 h，染色晾干后拍照，分析计数发现shDDX46组能透过Matrigel基质胶和滤膜的细胞数量少于shCtrl组，相比shCtrl组，shDDX46组细胞侵袭率降低了54%（P<0.001），表明敲减DDX46基因使得TE-1食管鳞癌细胞的侵袭能力明显减弱；见图4。
图4
侵袭实验
a：转染后的TE-1细胞在侵袭小室内孵育24 h后，于200倍镜下观察细胞侵袭情况；b：侵袭细胞数的变化
2.4 富集分析及纤连蛋白表达情况
敲减DDX46基因后TE-1食管鳞癌细胞差异基因在经典信号通路中的富集情况见图5。差异基因对18个经典信号通路均有调控作用，而在敲减食管鳞癌细胞DDX46基因后仅有整合素信号通路（Z-score为−2.324）的活性是被显著抑制的，而其他信号通路的活性无明显变化，因此整合素信号通路可能受到DDX46基因调控。进一步的Western blotting结果显示敲减食管鳞癌细胞中DDX46基因后，TE-1食管鳞癌细胞与细胞粘附相关的纤连蛋白表达量较shCtrl组减少，其相对表达量下降了11%；见图6。
图5
差异基因在18条经典信号通路中的富集分析结果
横坐标代表经典信号通路名称，纵坐标表示差异基因在信号通路中富集的显著性水平，其中纵坐标值越大，表示差异基因在该信号通路中越富集，Ratio表示在该信号通路中差异基因数与该通路中包含的所有基因数的比值。图中采用蓝色标注的信号通路代表通路被抑制，而使用橙色标注的信号通路则代表通路被激活，当｜Z-score｜>2表示差异基因对通路的调控作用显著
图6
纤连蛋白表达情况
a：Western blotting 检测纤连蛋白表达条带；b：经shCtrl校正后的纤连蛋白相对定量分析结果
3 讨论
肿瘤的侵袭和转移行为是肿瘤细胞具有恶性特征的主要体现，也是引发患者临床治疗失败和预后不良的直接原因。DDX46作为依赖于ATP的RNA解旋酶家族成员，可以在mRNA前体剪接与核糖体组装的过程中发挥重要作用，参与肿瘤的发生、发展过程。现已发现DDX46在多种肿瘤组织及细胞中存在过表达，沉默DDX46基因可抑制结直肠癌及皮肤鳞癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[6, 9]。在骨肉瘤的研究[8]中发现，敲减DDX46可以在下调细胞内磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的磷酸化水平后，实现抑制骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移。同样在神经胶质瘤的研究[10]中发现DDX46可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶-p38信号通路增强胶质瘤细胞的增殖能力，但其迁移能力与DDX46并无显著关联。一项有关胃癌的研究[7]发现，DDX46在胃癌组织及细胞中均存在过表达，敲减 DDX46可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，这个过程可能是DDX46敲减抑制了胃癌细胞中的 Akt/GSK-3β/β-catenin 信号通路，值得注意的是，Akt或β-catenin过表达的激活逆转了DDX46敲减所产生的抗癌作用。另有研究[16]报道，在子痫前期的孕妇患者胎盘组织中发现DDX46基因的mRNA水平低于正常孕妇，敲减DDX46基因能显著抑制滋养层细胞增殖并降低滋养层细胞的迁移和侵袭能力，而DDX46的过表达能促进滋养层细胞的迁移和侵袭；敲减DDX46后，PI3K、Akt和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白水平呈现下降趋势。这与我们课题组前期完成的DDX46与食管鳞癌细胞增殖和凋亡实验中的研究[12]结果一致。但是关于DDX46基因与食管鳞癌细胞侵袭和转移行为的相关性目前并不明确。
本研究通过慢病毒转染TE-1食管鳞癌细胞实现了DDX46基因敲减，相比空载体转染，shRNA慢病毒转染组DDX46基因的敲减效率达80%，证明目的基因靶点为有效靶点。后续划痕间距的改变提示在敲减DDX46基因表达后食管鳞癌细胞的迁移能力下降，同时Transwell小室实验中通过滤膜转移到下室的细胞数目相比对照组减少，表明敲减DDX46基因能抑制食管鳞癌细胞的迁移能力。同样在侵袭实验中观察到，shDDX46组食管鳞癌细胞通过降解滤膜表面基质胶进入下室的细胞数相比对照组减少。食管鳞癌细胞要通过滤膜，首先需要分泌基质金属蛋白酶降解附着于滤膜表面的基质胶，因此敲减DDX46基因后食管鳞癌细胞的侵袭能力下降，这一过程可能是通过降低基质金属蛋白酶的表达实现的。
为了进一步探讨其可能存在的作用机制，本研究将前期通过敲减DDX46基因后获得的食管鳞癌细胞差异基因表达谱[14]导入IPA在线分析工具中进行经典通路的富集分析，差异基因所调控的经典通路由IPA所收集归纳的800条信号、代谢通路所总结。结果显示在18条经典信号通路中整合素信号通路的活性被显著抑制，而与粘附相关的整合素作为整合素信号通路中的关键分子，能借助精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸序列（Arg-Gly-Asp，RGD）结合胞外基质中的纤连蛋白，为此我们进一步检测了纤连蛋白的表达情况。结果表明在敲减TE-1食管鳞癌细胞DDX46基因后间质中纤连蛋白的表达下调，同样敲减DDX46基因后食管鳞癌细胞的侵袭和迁移能力下降，因此敲减DDX46基因可能是通过下调整合素信号通路影响细胞粘附功能，从而改变肿瘤细胞的侵袭和转移能力。
整合素一方面介导了细胞与细胞间、细胞与细胞外基质以及细胞与病原体之间的相互作用[17]，能在细胞表面与细胞外基质中的纤连蛋白结合，提供肿瘤细胞粘附和迁移的位点[18]；另一方面，整合素是连接细胞内外信号传导过程的桥梁[19]，能够双向传导跨膜信号，可与信号通路中的下游分子在细胞内集聚启动多条胞内信号转导途径，从而影响肿瘤细胞的生理和病理功能[20]。当整合素受到胞外因素的刺激后，细胞表面的整合素RGD序列结合纤连蛋白等介导细胞粘附，而整合素位于胞内片段则通过黏着斑蛋白将细胞外基质与细胞骨架的肌动蛋白连接在一起，形成细胞外基质‐整合素‐细胞骨架跨膜信号结构，使胞外刺激信号传递到细胞骨架，细胞骨架的结构改变引发细胞运动介导细胞迁移[21]。黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是黏着斑蛋白的重要成分，在细胞质中的激酶活性主要依赖整合素信号传导[22]，是整合素信号通路的下游分子，参与多种肿瘤的发生、发展过程[17]。FAK作为整合素信号通路中胞外信号向胞内传递的关键分子，通过黏着斑的形成和细胞骨架的重构介导了多种肿瘤的侵袭和转移行为[23-25]。PI3K/AKT是细胞内进行信号传递的重要通路，而PI3K作为细胞内PI3K/Akt信号通路的节点，也是整合素信号通路下游的分子，当细胞内接收胞外基质与整合素及黏着斑所传递的信号刺激后，PI3K结合FAK并被活化，完成信号的传递。相关研究[26-27]发现，FAK/PI3K/Akt信号通路传导途径能够影响肝癌细胞及结直肠癌细胞的侵袭和转移等恶性生物学行为。本课题组的前期研究[28]表明，敲减DDX46基因后细胞内PI3K及Akt均呈现下调表达，PI3K/Akt通路及下游部分分子表达被抑制。PI3K/Akt信号通路也参与食管癌细胞的侵袭和转移等系列恶性行为的发生[29]。因此，敲减DDX46后整合素信号通路的活性下降，引起细胞内外信号传导障碍，同时细胞骨架的重构进一步降低了细胞的侵袭与迁移能力。
综上所述，DDX46基因参与调控食管鳞癌细胞的侵袭和迁移过程，敲减DDX46基因可能是通过下调整合素通路信号，使得细胞外信号向细胞内传递过程受阻，影响细胞粘附及骨架重构，从而抑制食管鳞癌细胞侵袭和转移能力，未来有望为食管癌的治疗提供新的思路。
利益冲突：无。
作者贡献：蔺军平参与研究设计，实验实施，论文初稿撰写；孟于琪参与论文设计与数据统计学分析；李斌参与研究设计与指导，论文审阅修改；冯海明参与论文的数据整理与生物信息学分析；李政参与研究相关的实验操作。
