引用本文： 王会新, 李倩, 侯晓雯, 史新竹, 冯旭. 肺腺癌ceRNA调控网络构建及AFAP1-AS1功能验证. 中国胸心血管外科临床杂志, 2024, 31(4): 576-584. doi: 10.7507/1007-4848.202207067 复制
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一（占所有癌症的12.3%），死亡率亦居第一位，肺癌患者平均5年生存率为15%[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小细胞肺癌最常见的类型，约占病例的40% [2]。尽管近年来在诊断和治疗方面取得了进展，但LUAD患者的总生存率仍然不尽人意。因此，寻找新的LUAD治疗策略已成为当前研究热点。近年来，高通量测序技术和生物信息学分析方法不断完善，开辟了研究LUAD的新思路和新方法。
在过去的几十年中，蛋白质编码基因在肺癌中得到了广泛的研究，但人类基因组转录的蛋白质编码基因不到2%，大约85%是非编码RNA，其中包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[3]。LncRNA是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，具有明显表达的细胞或组织特异性，其可在多层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达[4]。LncRNA最初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是一种“噪音”，不具有生物学功能[5]。然而，近年来的研究[6]表明，lncRNA在LUAD中的表达水平与癌旁组织存在显著差异，提示lncRNA可能影响肿瘤发生发展。进一步研究[7-9]发现，lncRNA通过参与包括染色质修饰、基因表达调控、转录激活、转录干扰、核内运输、细胞分化等在内的多种细胞学进程，影响肿瘤转移与侵袭、肿瘤细胞的增殖和凋亡、肿瘤血管生成及调节肿瘤耐药，促进或抑制LUAD的发生发展，为LUAD治疗提供新策略。大量研究[10]表明，lncRNA可以吸附多个miRNA，而每个miRNA又有多个下游靶基因结合，形成了一个十分复杂的lncRNA的调控网络，成为ceRNA，从而影响和调节mRNA的表达。这些lncRNA介导的ceRNA在理论上与癌症的发生发展密切相关。因此，揭示LUAD转移新机制并寻找新的治疗靶点对LUAD患者具有重要作用。在本研究中，通过基因表达综合性基因库（Gene Expression Omnibus，GEO）筛选LUAD患者中lncRNA和mRNA的微阵列基因表达芯片，筛选出差异表达基因，构建ceRNA网络，为LUAD的诊断、治疗和预后提供新的生物标志物。
1 材料与方法
1.1 数据来源
GEO是美国国家生物技术信息中心（NCBI）公开提供的基因组学数据库，提供了大量LUAD的基因组数据。数据集筛选的纳入标准：（1）关于LUAD的研究；（2）组织样本包括肿瘤和相应的邻近组织或正常组织；（3）总样本数≥40个；（4）数据集必须包括lncRNA和mRNA。
1.2 肺腺癌中的差异表达基因
通过GEO2R分析数据集的基因表达谱得到差异表达的lncRNA和mRNA，筛选条件为 |LogFC|>1.5和校正后的P值<0.05。将分析得到的差异表达基因通过韦恩图取交集，得到交集的mRNA和lncRNA。
1.3 构建ceRNA网络
根据筛选出来的lncRNA，应用lncRNA-mRNA在线数据库miRcode预测与其相互作用的靶miRNA，应用miRNA靶基因预测数据库（miRDB、miTarBase和Targetscan）预测靶mRNA。取3个数据库的交集，然后将交集出的mRNA与GEO筛选出的LUAD差异表达基因取交集。基于上述条件筛选出lncRNA、miRNA及mRNA，采用Cytoscape V3.8.2构建ceRNA网络。
1.4 构建蛋白质相互作用网络
蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析是发现基于蛋白质网络的不同模块的LUAD相关差异表达基因的重要工具。构建PPI网络以鉴定与无肿瘤组织相比在LUAD中的关键编码基因和重要基因模块。使用String数据库构建PPI网络，并使用Cytoscape V3.8.2进行可视化。
1.5 功能富集分析
通过预测ceRNA网络中mRNA的相关生物学功能和通路，从而对网络中共表达lncRNA的功能进行推断分析。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在线工具对所得的55个mRNA进行功能富集分析，基因本体论数据库（Gene Ontology，GO，包括分子功能、细胞成分和生物学过程）以及基因和基因组的京都百科全书数据库（KEGG）用于阐明差异表达基因在ceRNA网络中的潜在作用。
1.6 细胞培养和转染
细胞系选择A549细胞和MRC-5细胞（Procell）。并用RPMI-1640（Sigma-Aldrich，Whitehouse Station，New Jersey）培养基培养，其中含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco，Carlsbad，California）。为了沉默肌动蛋白纤维相关蛋白 1-反义 RNA1（actinfilament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）的表达，在细胞处于对数生长期时，并且细胞融合率为70%～80%的情况下进行转染。siRNA由金拓思设计并合成（表1）。转染载体和脂质体6000（Beyotime Biotechnology，China）用Opti-MEM稀释。混合并孵育20 min后，将细胞置于每个孔中。
表1
AFAP1-AS1的siRNA引物序列
1.7 反转录定量聚合酶链式反应
从A549细胞和MRC-5细胞中提取总RNA，用NanoDrop2000分光光度分析仪定量。用Prime Script RT试剂将总RNA逆转录成互补的脱氧核糖核酸（cDNA）。利用SYBR Premiex ExTaq进行定量PCR扩增获得的cDNA。采用2-∆∆Ct法对相对水平进行定量分析。以甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参比（表2）。
表2
qPCR的引物设计
1.8 细胞增殖实验
将细胞接种于96孔板中，每孔接种2.0×103个细胞，分别用0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL和2.5 mg/mL RPMI-1640培养液孵育。每个实验重复进行3次。用CCK8试剂盒记录450 nm处的吸光度，绘制活性曲线。分别于第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d测定细胞活力。
1.9 细胞划痕实验
将细胞接种于6孔板中，加入5.0×104细胞/孔并孵育。并在6孔板上画一条直线。用PBS洗涤脱落的细胞。分别在0 h和48 h时观察细胞的划痕宽度（n=5）。
1.10 细胞侵袭实验
在侵袭实验中，将4.0×104个细胞添加到覆盖基质凝胶的上部腔室Transwell膜的顶部。在底井中加入一个完整的培养基以刺激入侵。然后将细胞在37℃下孵育48 h。去除上室的细胞，下室的细胞用20%甲醇固定（5 min），用0.1%结晶紫（n=5）染色。然后在倒置显微镜下观察并计数染色细胞，随机选取5个不同的显微镜视图进行分析，包括不同的倍数。
1.11 细胞凋亡实验
采用AnnexinV-PI细胞凋亡检测试剂盒，流式细胞术检测细胞凋亡情况。用siRNA处理细胞48 h。然后收集细胞，按照说明用AnnexinV-PI染色。双染色后，用流式细胞术检测早期和晚期凋亡细胞。
1.12 统计学分析
采用SPSS 22.0软件对数据进行分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（
±s）描述，组间比较采用t检验或单因素方差分析。P≤0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 肺腺癌中的差异表达基因
从GEO数据库下载了基因表达微阵列数据集GSE27262（25个正常组织和25个LUAD组织）和GSE19804（60个正常组织和60个LUAD组织）。为了避免不同平台带来的偏倚，2个数据集选择同一平台GPL570。
从GSE27262数据集中，总共获得1051个差异表达的mRNA（358个上调和693个下调的mRNA）和19个差异表达的lncRNA（9个上调和10个下调的lncRNA）。
从GSE19804数据集中，总共获得510个差异表达的mRNA（129个上调和381个下调的mRNA）和6个差异表达的lncRNA（3个上调和3个下调的lncRNA）（图1）。
图1
在肺腺癌组织和癌旁组织中鉴定差异表达基因
a：GSE19804差异表达；b：GSE27262差异表达的基因；红色代表上调的基因，蓝色代表下调的基因
韦恩图显示了差异表达的mRNA和差异表达的lncRNA的交集，共有494个差异表达的mRNA和6个差异表达的lncRNA（图2）。
图2
差异表达基因的韦恩图
a：GSE27262和GSE19804中差异表达的mRNA的交集基因数；b：GSE27262和GSE19804中差异表达的lncRNA的交集基因数
2.2 ceRNA网络的构建
根据上述lncRNA，miRNA和mRNA之间的相互作用，共有6个lncRNA与22个miRNA之间相互作用（表3），22个miRNA与55个mRNA之间相互作用（表4）。最后，LUAD特异的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，包含83个节点和155个边缘。使用Cytoscape进行可视化，得到lncRNA介导的ceRNA网络（图3）。
图3
在肺腺癌中构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络
绿色圆形节点代表mRNA，蓝色矩形代表miRNA，粉色菱形代表lncRNA
表3
ceRNA网络中lncRNA的靶向miRNA
表4
ceRNA网络中miRNA的靶向mRNA
2.3 GO和KEGG途径富集分析
GO和KEGG通路富集分析发现，参与ceRNA网络的mRNA与37种生物过程（biological process，BP）显著相关，其中主要包括MAPK活性激活、蛋白激酶B信号血管生成的正调控、细胞增殖负调控等；mRNA与6种分子功能（molecular function，MF）显著相关，分别为：肝素结合、信号蛋白受体结合、化学驱避活性、SMAD结合、生长因子活性、受体结合；与5种细胞组分（cellular component，CC）显著相关，即胞外区、质膜外侧、细胞外间隙、质膜的组成部分、蛋白质细胞外基质。ceRNA网络相关基因在3个KEGG途径中显著富集，即调节干细胞多能性的信号通路、TGF-β信号通路和蛋白质消化和吸收。富集分析表明，通过调节这些生物学过程和途径，LUAD特异的ceRNA网络可能参与了肿瘤过程（图4）。此外，为鉴定ceRNA网络中mRNA蛋白质之间的相互作用，构建了PPI网络。我们发现一些综合评分较高的基因，包括FGF2、COL1A2，BMP2、KLF4、CXCL5和MMP11，主要在“TGF-β信号通路”途径中富集（图5）。
图4
ceRNA网络中mRNA的GO和KEGG富集分析
a：CC的气泡图；b：MF的气泡图；c：BP的气泡图；d：KEGG的气泡图；BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能
图5
在ceRNA网络中mRNA的PPI网络
圆圈代表基因，线条代表基因编码的蛋白质之间的相互作用
2.4 AFAP1-AS1在肺腺癌细胞中的表达
AFAP1-AS1在A549细胞中的表达量为1.37±0.15。MRC-5的表达水平为0.57±0.13。AFAP1-AS1在A549中表达量更高。
2.5 siRNA的转染
AFAP1-AS1在siRNA-NC、siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3组中的表达量分别为1.23±0.11、0.55±0.09、0.31±0.04和0.44±0.02（F=90.05，P<0.001）。与siRNA-NC组相比，siRNA-2组中AFAP1-AS1的表达明显降低。
2.6 沉默AFAP1-AS1抑制肿瘤生长
通过CCK8实验发现，在第4 d和第5 d，沉默的AFAP1-AS1的生长速率显著低于对照组，差异有统计学意义（图6）。
图6
转染siRNA-NC和siRNA-2的A549细胞增殖情况
*：
2.7 沉默AFAP1-AS1抑制细胞迁移和细胞侵袭
通过细胞迁移实验检测AFAP1-AS1对LUAD细胞迁移能力的影响。在A549细胞系中，AFAP1-AS1 siRNA-2组的细胞迁移数量明显低于对照组（图7）。
图7
转染siRNA-NC和siRNA-2后A549细胞的迁移能力评价（×10）
Transwell实验检测AFAP1-AS1对LUAD细胞侵袭的下调。下调AFAP1-AS1后的细胞侵袭次数低于对照组（图8）。
图8
siRNA-2和siRNA-NC转染A549细胞的侵袭能力（×10）及直条图
*：
2.8 沉默AFAP1-AS1促进细胞凋亡
流式细胞术检测AFAP1-AS1下调后LUAD细胞凋亡的结果显示，抑制AFAP1-AS1显著增加了A549的凋亡，差异有统计学意义（图9）。
图9
siRNA-2和siRNA-NC转染A549细胞后的细胞凋亡能力
3 讨论
LUAD是最常见的非小细胞肺癌组织学类型，每年在全球造成约50万例死亡。尽管在揭示LUAD的机制方面取得了重大进展，但确切的发病机制仍不完全了解，因此确定用于诊断和治疗LUAD患者的特定生物标志物已成为当务之急。越来越多的研究[11-12]表明，lncRNA通过多种途径促进肿瘤发生和发展。2011年Salmena等[13]首次提出ceRNA假说，在该假说中，lncRNA可作为ceRNA，通过竞争共享的miRNA来调控恶性肿瘤中的基因表达，其揭示了lncRNA-miRNA-mRNA调控相互作用的新概念，为深入了解各种疾病，特别是癌症的机制提供了依据。如H19诱导miR-675-5p上调，而P53的水平则显著下调，P53被鉴定为miR-675的靶基因，因此，H19的高表达通过调控miR-675-5p缩短LUAD患者的生存时间[14]。此外，LINC00355和LINC00466可以分别通过海绵作用miR-195和miR-144靶向CCNE1和HOXA10，从而促进LUAD的进展[15-16]。然而，对LUAD中lncRNA介导的ceRNA网络的全基因组筛选仍然缺乏。
在本研究中，我们从GEO数据库获得微阵列数据集，使用生物信息学分析来挖掘LUAD相关具有差异表达的lncRNA和mRNA。通过构建lncRNA-miRNA-mRNA网络，总共鉴定了6个lncRNA，22个miRNA和55个mRNA，其中包括83个节点和155个边缘。GO富集分析的结果表明，与ceRNA相关的RNA主要参与癌症相关的生物学过程，例如DNA转录正调控，信号蛋白受体结合和细胞外间隙。此外，参与ceRNA网络的mRNA在3个KEGG途径（调节干细胞多能性的信号通路、TGF-β信号通路、蛋白质消化和吸收）中显著丰富。富集结果表明，ceRNA网络可能调节LUAD的生物学过程和途径。
在参与ceRNA网络中的lncRNA，AFAP1-AS1基因位于人类第4号染色体的反义链上，在哺乳动物的发育中起着至关重要的作用[17]。AFAP1-AS1已被描述为多种癌症的致癌基因，包括胃癌、结直肠癌、肝癌和肺癌[18]。AFAP1-AS1作为胃癌的生物标记物，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并作为ceRNA通过海绵体miR-205-5p靶向AFPA1[19]。越来越多的研究证明lncRNA在结直肠癌中具有重要的调节作用。Tang等[20]的研究发现AFAP1-AS1促进结直肠癌的发生，并且在结直肠癌组织中表达上调，可能是结直肠癌一种新的预后分子。AFAP1-AS1的高表达是LUAD患者预后不良的独立危险因素，可通过调节miR-545-3p/肝癌源性生长因子轴[21-22]促进LUAD细胞凋亡。通过生物信息学预测发现，AFAP1-AS1在LUAD中上调，但相关研究较少。因此，我们特别关注了差异表达基因AFAP1-AS1在LUAD中的生物学功能。为了检测AFAP1-AS1的生物学功能，本研究设计了siRNA，可以有效地沉默AFAP1-AS1在A549细胞中的表达。AFAP1-AS1在LUAD细胞中的表达明显高于正常肺细胞。如预测的那样，AFAP1-AS1的沉默抑制了LUAD细胞的增殖，抑制细胞迁移能力，降低细胞侵袭能力，但促进细胞凋亡。这些结果表明，AFAP1-AS1可能作为一种促癌基因，在LUAD中发挥重要作用。
近年来，关于癌症靶向治疗的研究越来越多，相信也会有更多的靶标位点被人类发现。这预示着靶标治疗在不久的将来可能会应用于多种肿瘤的临床治疗。
本研究构建了一个lncRNA介导的ceRNA网络，这可能有助于进一步研究LUAD的作用机制。此外，通过细胞实验，本研究发现AFAP1-AS1有潜力作为LUAD的治疗靶点。
利益冲突：无。
作者贡献：王会新负责论文设计、撰写与修改，数据整理分析；李倩、冯旭参与选题，负责论文审阅与修改；侯晓雯、史新竹和冯旭负责对文章的知识性内容作批判性审阅。
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一（占所有癌症的12.3%），死亡率亦居第一位，肺癌患者平均5年生存率为15%[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小细胞肺癌最常见的类型，约占病例的40% [2]。尽管近年来在诊断和治疗方面取得了进展，但LUAD患者的总生存率仍然不尽人意。因此，寻找新的LUAD治疗策略已成为当前研究热点。近年来，高通量测序技术和生物信息学分析方法不断完善，开辟了研究LUAD的新思路和新方法。
在过去的几十年中，蛋白质编码基因在肺癌中得到了广泛的研究，但人类基因组转录的蛋白质编码基因不到2%，大约85%是非编码RNA，其中包括长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）[3]。LncRNA是一类本身不编码蛋白、转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子，具有明显表达的细胞或组织特异性，其可在多层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达[4]。LncRNA最初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是一种“噪音”，不具有生物学功能[5]。然而，近年来的研究[6]表明，lncRNA在LUAD中的表达水平与癌旁组织存在显著差异，提示lncRNA可能影响肿瘤发生发展。进一步研究[7-9]发现，lncRNA通过参与包括染色质修饰、基因表达调控、转录激活、转录干扰、核内运输、细胞分化等在内的多种细胞学进程，影响肿瘤转移与侵袭、肿瘤细胞的增殖和凋亡、肿瘤血管生成及调节肿瘤耐药，促进或抑制LUAD的发生发展，为LUAD治疗提供新策略。大量研究[10]表明，lncRNA可以吸附多个miRNA，而每个miRNA又有多个下游靶基因结合，形成了一个十分复杂的lncRNA的调控网络，成为ceRNA，从而影响和调节mRNA的表达。这些lncRNA介导的ceRNA在理论上与癌症的发生发展密切相关。因此，揭示LUAD转移新机制并寻找新的治疗靶点对LUAD患者具有重要作用。在本研究中，通过基因表达综合性基因库（Gene Expression Omnibus，GEO）筛选LUAD患者中lncRNA和mRNA的微阵列基因表达芯片，筛选出差异表达基因，构建ceRNA网络，为LUAD的诊断、治疗和预后提供新的生物标志物。
1 材料与方法
1.1 数据来源
GEO是美国国家生物技术信息中心（NCBI）公开提供的基因组学数据库，提供了大量LUAD的基因组数据。数据集筛选的纳入标准：（1）关于LUAD的研究；（2）组织样本包括肿瘤和相应的邻近组织或正常组织；（3）总样本数≥40个；（4）数据集必须包括lncRNA和mRNA。
1.2 肺腺癌中的差异表达基因
通过GEO2R分析数据集的基因表达谱得到差异表达的lncRNA和mRNA，筛选条件为 |LogFC|>1.5和校正后的P值<0.05。将分析得到的差异表达基因通过韦恩图取交集，得到交集的mRNA和lncRNA。
1.3 构建ceRNA网络
根据筛选出来的lncRNA，应用lncRNA-mRNA在线数据库miRcode预测与其相互作用的靶miRNA，应用miRNA靶基因预测数据库（miRDB、miTarBase和Targetscan）预测靶mRNA。取3个数据库的交集，然后将交集出的mRNA与GEO筛选出的LUAD差异表达基因取交集。基于上述条件筛选出lncRNA、miRNA及mRNA，采用Cytoscape V3.8.2构建ceRNA网络。
1.4 构建蛋白质相互作用网络
蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析是发现基于蛋白质网络的不同模块的LUAD相关差异表达基因的重要工具。构建PPI网络以鉴定与无肿瘤组织相比在LUAD中的关键编码基因和重要基因模块。使用String数据库构建PPI网络，并使用Cytoscape V3.8.2进行可视化。
1.5 功能富集分析
通过预测ceRNA网络中mRNA的相关生物学功能和通路，从而对网络中共表达lncRNA的功能进行推断分析。利用DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）在线工具对所得的55个mRNA进行功能富集分析，基因本体论数据库（Gene Ontology，GO，包括分子功能、细胞成分和生物学过程）以及基因和基因组的京都百科全书数据库（KEGG）用于阐明差异表达基因在ceRNA网络中的潜在作用。
1.6 细胞培养和转染
细胞系选择A549细胞和MRC-5细胞（Procell）。并用RPMI-1640（Sigma-Aldrich，Whitehouse Station，New Jersey）培养基培养，其中含有10%的胎牛血清（FBS，Gibco，Carlsbad，California）。为了沉默肌动蛋白纤维相关蛋白 1-反义 RNA1（actinfilament-associated protein 1-antisense RNA1，AFAP1-AS1）的表达，在细胞处于对数生长期时，并且细胞融合率为70%～80%的情况下进行转染。siRNA由金拓思设计并合成（表1）。转染载体和脂质体6000（Beyotime Biotechnology，China）用Opti-MEM稀释。混合并孵育20 min后，将细胞置于每个孔中。
表1
AFAP1-AS1的siRNA引物序列
1.7 反转录定量聚合酶链式反应
从A549细胞和MRC-5细胞中提取总RNA，用NanoDrop2000分光光度分析仪定量。用Prime Script RT试剂将总RNA逆转录成互补的脱氧核糖核酸（cDNA）。利用SYBR Premiex ExTaq进行定量PCR扩增获得的cDNA。采用2-∆∆Ct法对相对水平进行定量分析。以甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参比（表2）。
表2
qPCR的引物设计
1.8 细胞增殖实验
将细胞接种于96孔板中，每孔接种2.0×103个细胞，分别用0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL和2.5 mg/mL RPMI-1640培养液孵育。每个实验重复进行3次。用CCK8试剂盒记录450 nm处的吸光度，绘制活性曲线。分别于第1 d、2 d、3 d、4 d、5 d测定细胞活力。
1.9 细胞划痕实验
将细胞接种于6孔板中，加入5.0×104细胞/孔并孵育。并在6孔板上画一条直线。用PBS洗涤脱落的细胞。分别在0 h和48 h时观察细胞的划痕宽度（n=5）。
1.10 细胞侵袭实验
在侵袭实验中，将4.0×104个细胞添加到覆盖基质凝胶的上部腔室Transwell膜的顶部。在底井中加入一个完整的培养基以刺激入侵。然后将细胞在37℃下孵育48 h。去除上室的细胞，下室的细胞用20%甲醇固定（5 min），用0.1%结晶紫（n=5）染色。然后在倒置显微镜下观察并计数染色细胞，随机选取5个不同的显微镜视图进行分析，包括不同的倍数。
1.11 细胞凋亡实验
采用AnnexinV-PI细胞凋亡检测试剂盒，流式细胞术检测细胞凋亡情况。用siRNA处理细胞48 h。然后收集细胞，按照说明用AnnexinV-PI染色。双染色后，用流式细胞术检测早期和晚期凋亡细胞。
1.12 统计学分析
采用SPSS 22.0软件对数据进行分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）描述，组间比较采用t检验或单因素方差分析。P≤0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 肺腺癌中的差异表达基因
从GEO数据库下载了基因表达微阵列数据集GSE27262（25个正常组织和25个LUAD组织）和GSE19804（60个正常组织和60个LUAD组织）。为了避免不同平台带来的偏倚，2个数据集选择同一平台GPL570。
从GSE27262数据集中，总共获得1051个差异表达的mRNA（358个上调和693个下调的mRNA）和19个差异表达的lncRNA（9个上调和10个下调的lncRNA）。
从GSE19804数据集中，总共获得510个差异表达的mRNA（129个上调和381个下调的mRNA）和6个差异表达的lncRNA（3个上调和3个下调的lncRNA）（图1）。
图1
在肺腺癌组织和癌旁组织中鉴定差异表达基因
a：GSE19804差异表达；b：GSE27262差异表达的基因；红色代表上调的基因，蓝色代表下调的基因
韦恩图显示了差异表达的mRNA和差异表达的lncRNA的交集，共有494个差异表达的mRNA和6个差异表达的lncRNA（图2）。
图2
差异表达基因的韦恩图
a：GSE27262和GSE19804中差异表达的mRNA的交集基因数；b：GSE27262和GSE19804中差异表达的lncRNA的交集基因数
2.2 ceRNA网络的构建
根据上述lncRNA，miRNA和mRNA之间的相互作用，共有6个lncRNA与22个miRNA之间相互作用（表3），22个miRNA与55个mRNA之间相互作用（表4）。最后，LUAD特异的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，包含83个节点和155个边缘。使用Cytoscape进行可视化，得到lncRNA介导的ceRNA网络（图3）。
图3
在肺腺癌中构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络
绿色圆形节点代表mRNA，蓝色矩形代表miRNA，粉色菱形代表lncRNA
表3
ceRNA网络中lncRNA的靶向miRNA
表4
ceRNA网络中miRNA的靶向mRNA
2.3 GO和KEGG途径富集分析
GO和KEGG通路富集分析发现，参与ceRNA网络的mRNA与37种生物过程（biological process，BP）显著相关，其中主要包括MAPK活性激活、蛋白激酶B信号血管生成的正调控、细胞增殖负调控等；mRNA与6种分子功能（molecular function，MF）显著相关，分别为：肝素结合、信号蛋白受体结合、化学驱避活性、SMAD结合、生长因子活性、受体结合；与5种细胞组分（cellular component，CC）显著相关，即胞外区、质膜外侧、细胞外间隙、质膜的组成部分、蛋白质细胞外基质。ceRNA网络相关基因在3个KEGG途径中显著富集，即调节干细胞多能性的信号通路、TGF-β信号通路和蛋白质消化和吸收。富集分析表明，通过调节这些生物学过程和途径，LUAD特异的ceRNA网络可能参与了肿瘤过程（图4）。此外，为鉴定ceRNA网络中mRNA蛋白质之间的相互作用，构建了PPI网络。我们发现一些综合评分较高的基因，包括FGF2、COL1A2，BMP2、KLF4、CXCL5和MMP11，主要在“TGF-β信号通路”途径中富集（图5）。
图4
ceRNA网络中mRNA的GO和KEGG富集分析
a：CC的气泡图；b：MF的气泡图；c：BP的气泡图；d：KEGG的气泡图；BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能
图5
在ceRNA网络中mRNA的PPI网络
圆圈代表基因，线条代表基因编码的蛋白质之间的相互作用
2.4 AFAP1-AS1在肺腺癌细胞中的表达
AFAP1-AS1在A549细胞中的表达量为1.37±0.15。MRC-5的表达水平为0.57±0.13。AFAP1-AS1在A549中表达量更高。
2.5 siRNA的转染
AFAP1-AS1在siRNA-NC、siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3组中的表达量分别为1.23±0.11、0.55±0.09、0.31±0.04和0.44±0.02（F=90.05，P<0.001）。与siRNA-NC组相比，siRNA-2组中AFAP1-AS1的表达明显降低。
2.6 沉默AFAP1-AS1抑制肿瘤生长
通过CCK8实验发现，在第4 d和第5 d，沉默的AFAP1-AS1的生长速率显著低于对照组，差异有统计学意义（图6）。
图6
转染siRNA-NC和siRNA-2的A549细胞增殖情况
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2.7 沉默AFAP1-AS1抑制细胞迁移和细胞侵袭
通过细胞迁移实验检测AFAP1-AS1对LUAD细胞迁移能力的影响。在A549细胞系中，AFAP1-AS1 siRNA-2组的细胞迁移数量明显低于对照组（图7）。
图7
转染siRNA-NC和siRNA-2后A549细胞的迁移能力评价（×10）
Transwell实验检测AFAP1-AS1对LUAD细胞侵袭的下调。下调AFAP1-AS1后的细胞侵袭次数低于对照组（图8）。
图8
siRNA-2和siRNA-NC转染A549细胞的侵袭能力（×10）及直条图
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2.8 沉默AFAP1-AS1促进细胞凋亡
流式细胞术检测AFAP1-AS1下调后LUAD细胞凋亡的结果显示，抑制AFAP1-AS1显著增加了A549的凋亡，差异有统计学意义（图9）。
图9
siRNA-2和siRNA-NC转染A549细胞后的细胞凋亡能力
3 讨论
LUAD是最常见的非小细胞肺癌组织学类型，每年在全球造成约50万例死亡。尽管在揭示LUAD的机制方面取得了重大进展，但确切的发病机制仍不完全了解，因此确定用于诊断和治疗LUAD患者的特定生物标志物已成为当务之急。越来越多的研究[11-12]表明，lncRNA通过多种途径促进肿瘤发生和发展。2011年Salmena等[13]首次提出ceRNA假说，在该假说中，lncRNA可作为ceRNA，通过竞争共享的miRNA来调控恶性肿瘤中的基因表达，其揭示了lncRNA-miRNA-mRNA调控相互作用的新概念，为深入了解各种疾病，特别是癌症的机制提供了依据。如H19诱导miR-675-5p上调，而P53的水平则显著下调，P53被鉴定为miR-675的靶基因，因此，H19的高表达通过调控miR-675-5p缩短LUAD患者的生存时间[14]。此外，LINC00355和LINC00466可以分别通过海绵作用miR-195和miR-144靶向CCNE1和HOXA10，从而促进LUAD的进展[15-16]。然而，对LUAD中lncRNA介导的ceRNA网络的全基因组筛选仍然缺乏。
在本研究中，我们从GEO数据库获得微阵列数据集，使用生物信息学分析来挖掘LUAD相关具有差异表达的lncRNA和mRNA。通过构建lncRNA-miRNA-mRNA网络，总共鉴定了6个lncRNA，22个miRNA和55个mRNA，其中包括83个节点和155个边缘。GO富集分析的结果表明，与ceRNA相关的RNA主要参与癌症相关的生物学过程，例如DNA转录正调控，信号蛋白受体结合和细胞外间隙。此外，参与ceRNA网络的mRNA在3个KEGG途径（调节干细胞多能性的信号通路、TGF-β信号通路、蛋白质消化和吸收）中显著丰富。富集结果表明，ceRNA网络可能调节LUAD的生物学过程和途径。
在参与ceRNA网络中的lncRNA，AFAP1-AS1基因位于人类第4号染色体的反义链上，在哺乳动物的发育中起着至关重要的作用[17]。AFAP1-AS1已被描述为多种癌症的致癌基因，包括胃癌、结直肠癌、肝癌和肺癌[18]。AFAP1-AS1作为胃癌的生物标记物，促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并作为ceRNA通过海绵体miR-205-5p靶向AFPA1[19]。越来越多的研究证明lncRNA在结直肠癌中具有重要的调节作用。Tang等[20]的研究发现AFAP1-AS1促进结直肠癌的发生，并且在结直肠癌组织中表达上调，可能是结直肠癌一种新的预后分子。AFAP1-AS1的高表达是LUAD患者预后不良的独立危险因素，可通过调节miR-545-3p/肝癌源性生长因子轴[21-22]促进LUAD细胞凋亡。通过生物信息学预测发现，AFAP1-AS1在LUAD中上调，但相关研究较少。因此，我们特别关注了差异表达基因AFAP1-AS1在LUAD中的生物学功能。为了检测AFAP1-AS1的生物学功能，本研究设计了siRNA，可以有效地沉默AFAP1-AS1在A549细胞中的表达。AFAP1-AS1在LUAD细胞中的表达明显高于正常肺细胞。如预测的那样，AFAP1-AS1的沉默抑制了LUAD细胞的增殖，抑制细胞迁移能力，降低细胞侵袭能力，但促进细胞凋亡。这些结果表明，AFAP1-AS1可能作为一种促癌基因，在LUAD中发挥重要作用。
近年来，关于癌症靶向治疗的研究越来越多，相信也会有更多的靶标位点被人类发现。这预示着靶标治疗在不久的将来可能会应用于多种肿瘤的临床治疗。
本研究构建了一个lncRNA介导的ceRNA网络，这可能有助于进一步研究LUAD的作用机制。此外，通过细胞实验，本研究发现AFAP1-AS1有潜力作为LUAD的治疗靶点。
利益冲突：无。
作者贡献：王会新负责论文设计、撰写与修改，数据整理分析；李倩、冯旭参与选题，负责论文审阅与修改；侯晓雯、史新竹和冯旭负责对文章的知识性内容作批判性审阅。
