引用本文： 寻斯琪, 干昌平, 郭应强, 秦超毅. 急性心肌梗死小鼠模型的血清代谢特征：基于LC-MS/MS的靶向代谢组学分析. 中国胸心血管外科临床杂志, 2023, 30(11): 1609-1617. doi: 10.7507/1007-4848.202302079 复制
心肌梗死 （myocardial infarction，MI） 是指由于冠状动脉血流不足和随后的氧供应减少导致心肌细胞减少[1-2]。MI是全球心血管疾病致残和死亡的主要原因之一，因此对人类健康构成严重威胁，并将在未来成为世界性的严重公共卫生问题[3-4]。此外，其经济负担巨大，2010年该疾病给全球经济造成的损失估计为8 630亿美元[5]。在过去的几十年里，随着包含纤维蛋白溶解、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术在内的再灌注策略，包含抗心力衰竭（心衰）、降脂、抗血栓及抗炎在内的药物治疗和标准化护理等方面的进展，MI的预后显著改善[6-7]。例如，经皮冠状动脉介入治疗能够显著改善左室功能，减少心源性死亡、MI复发以及非计划性血管重建的发生，有效的抗血栓治疗也与缺血事件的大幅减少有关，提高了MI患者存活率[6, 8] 。
然而，大面积梗死患者或未及时接受血运重建的患者发生包括急性二尖瓣反流、室间隔缺损、假性动脉瘤和游离壁破裂在内的机械并发症的风险增加，并导致患者死亡[9]。由此可见，识别有效的代谢标志物和MI治疗靶点能在改善预后中发挥关键性作用[10] 。因此，充分了解 MI 的代谢特征显得尤为迫切。
最近几年中，更具选择性和灵敏度的质谱仪推动了代谢组学研究的快速扩展，与蛋白质组学和基因组学相比，代谢组学可以研究基因型的最终表达，因此是最接近最终表型的分析技术[11] 。其可用于分析代谢表型和探索代谢重编程，从而能够鉴定生物标志物并提供对生理和病理机制进行分析研究[12] 。
本研究通过结扎冠状动脉左前降支建立小鼠急性心肌梗死（acute MI，AMI）模型，对血清进行靶向代谢组学分析，从代谢组学角度探讨心肌细胞缺血状态后的代谢变化，并进一步分析其相关代谢路径并构建网络。这些结果进一步阐明了疾病所涉及的生化机制。
1 材料与方法
1.1 小鼠急性心肌梗死模型的建立
取同批次10周龄雄性C57BL/6小鼠15只［体重15～20 g，实验动物生产许可证号SCXK（川）2020-0030 ］，随机分为两组：假手术对照组（n=5）和AMI模型组（n=10）。在没有通气的情况下用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。在胸骨左侧做一小皮肤切口，并准备了荷包缝合。在第4肋间开一个小孔，用蚊钳扩张。手法挤压外侧胸腔使跳动的心脏轻轻弹出，在冠状动脉左前降支心房下方约3 mm处用7-0丝线快速缝合。当左心室前壁变白时，即可确认结扎成功。结扎后，将心脏放回胸腔内，手动排出胸腔内空气。扎紧之前荷包缝合，在恢复期对小鼠进行监测。假手术对照组小鼠接受相同的手术操作，但未阻断其冠状动脉左前降支。
1.2 UHPLC-QqQ/MS的靶向代谢组学分析
所有小鼠于术后24 h采集血清标本。血清样本添加了两个内标的甲醇沉淀。然后收集上清液，干燥后用10 mM醋酸铵在30%水/70%乙酸乙酯+0.2%冰醋酸中重组，其中含有12.6 μM 3C5-15N-L-酪氨酸和34.68 μM 13C1-L-乳酸。将重组样品分别以正离子和负离子模式加入到UHPLC− MS/MS中，质控样品采用混合所有血清的混合样品。
靶向代谢组学分析在Nexera LC-40A UHPLC系统上进行，该系统与AB Sciex三重四极杆（QQQ）5500质谱仪（美国，马萨诸塞州弗雷明翰）相结合。然后在Waters BEH酰胺柱（2.1×100，1.7 μm，Waters，Milford，MA，USA）上在35℃的温度下进行色层分离。多反应监测模式用于检测感兴趣的代谢物。本研究从40多条代谢途径中选择了238种代谢物进行靶向分析。用Analyst 1.6.3软件采集数据，用Multiquant 3.0.2软件（AB Sciex，Framingham，MA）进行分析。
1.3 统计学分析
所有数据已在SPSS验证正态性分布。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（
±s）表示，组间比较使用SPSSV21软件 （Chicago，IL，USA）进行非配对t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。用代谢组学途径分析（MetaboAnalyst 5.0， http://www.metaboanalyst.ca/）对数据进行自动筛选，并对改变的代谢物进行分析，并与潜在的代谢途径相关。KEGG数据库（http://www.kegg.jp/）用于进一步确定这些改变的代谢物在各种代谢途径中的位置和功能。
1.4 伦理审查
此研究经四川大学华西医院动物伦理委员会批准，批准号为20220221020。
2 结果
2.1 两组代谢谱分析
2.1.1 与心肌缺血相关的代谢物
129种代谢物中的50种与心肌缺血相关［fold change（FC）<0.5或>2，P的阈值被设定为0.05，且经伪发现率（FDR）矫正］；见图1。其包括11种氨基酸（丝氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苏氨酸、D-亮氨酸、胱氨酸、肌氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸）、2种甲基化氨基酸（二甲基甘氨酸、1/3-甲基组氨酸）、1种乙酰化氨基酸（N-乙酰甘氨酸）、2种碱基（胞嘧啶、腺嘌呤）、6种核苷（2'-脱氧尿苷、胞苷、腺苷、肌苷、1-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷）、9种其他有机酸（杏仁酸、甘油酸、草乙酸、柠康酸、牛磺酸、壬二酸、2-氨基己二酸、2-羟基异戊酸、OH-苯基丙酮酸）、4种有机酸酯（胍基乙酸酯、腺苷酸琥珀酸酯、琥珀酸甲酯、丙二酸甲酯）、2种胆碱类及其相关产物（乙酰胆碱、三甲胺-N-氧化物），1种维生素（烟酸）、3种生物碱（色胺、脱氧肉碱、甜菜碱）及其他9种有机化合物；见表1。
图1
血清代谢物的总体趋势火山图
每个点代表一个血清代谢物，模型组中明显较高（FC>2）为红色，较低（FC＜0.5）为蓝色；不变的代谢物为灰色
表1
血清中的主要差异代谢物数据分析结果
在129种代谢的火山图中，位于中央的代谢物代表模型组和对照组的样本之间丰度相比只有较小的变化，红点显著表达上调的代谢物（共14种）。蓝点是显著表达下调的代谢物（共36种），灰点是无显著差异的代谢物。腺苷在MI模型组的血清样本中高出202.91倍，而2'-脱氧尿苷（FC=0.046051）、腺苷琥珀酸酯（FC=0.047406）、胞嘧啶（FC=0.047183）在MI模型组的血清样本的含量最低。
2.1.2 129种代谢物在样本中的变异系数
变异系数（CV）表示代谢物浓度的个体变异性的度量，从LC-MS数据中获得每种血清代谢物的浓度，随后计算CVs。根据其CV的大小分为7个亚组。在50种与心肌缺血相关的血清代谢物中，只有2种—色胺和2-氨基己二酸酯，属于可变性较小的组（共17种，CV 0.3～0.4）。14种化合物在下一个变异最小的组中（共22 种，CV 0.4～0.5）。27种代谢物的变异性相对较大，CV的范围为0.5～1.0。7种代谢物—1/3-甲基组氨酸、腺苷琥珀酸酯、甲基丙二酸、2'-脱氧尿苷、胞嘧啶、肌氨酸、黄嘌呤核苷，属于最不稳定的亚组（共12种，CV>1.0）（图2）。因此，超过一半的与心肌缺血相关的代谢物（27/50）的CV相对可变（CV 0.5～1.0）。
图2
129种代谢物根据CV大小可分为7个亚组
红色代表MI模型组相比对照组显著上调（FC＞2）的代谢物；蓝色代表MI模型组相比对照组显著下调（FC＜0.5）的代谢物；MI：心肌梗死
2.1.3 主成分分析及建立PLS-DA和OPLS模型
采用主成分分析来降低血清代谢物丰度数据的维数。主成分分析结果显示，两组的血清代谢物图标可以分开，提示在心肌缺血时代谢产物与正常状态明显不同（图3a）。由于样本量远远小于变量，故又建立了PLS-DA模型及OPLS-DA模型并进行了验证。 图3b 和图3c分别清晰展示了PLS-DA评分图及OPLS-DA评分图，可以清晰地分离MI模型组和假手术对照组血清样本的不同。图3d及图3e显示了两个模型的验证参数及用CV-ANOVA检验的P值，OPLS-DA模型的Q2和R2都>0.5，所有模型的P值均≤0.05，表明模型有效。
图3
两组血清代谢物的主成分分析
a：PCA评分图；b：PLS-DA评分图；c：OPLS-DA评分图；a～c评分图揭示了两组样本的聚类性强，组内差异不大；d：PLS-DA模型；e：OPLS-DA模型；d和e的
2.2 与心肌缺血相关的代谢物改变
以验证的OPLS-DA模型中的vip≥1、FDR≤0.05、组内CV＜0.2差异代谢物的筛选条件。假手术对照组、MI模型组血清中代谢产物变化的统计分析结果见表1。血清中共发现27种代谢物变化，包含氨基酸及其衍生物、有机酸、酯类。这些代谢产物在MI模型组和假手术对照组之间有较大差异。
2.3 心肌缺血相关代谢通路的改变
探索生物途径可能有助于阐明心肌缺血时的代谢变化。结果表明代谢产物和代谢生物网络发生了显著变化；见图4和表2。基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）基于代谢物（impact value>0.2，FDR<0.05）的信号通路分析，筛选出影响最显著的代谢途径：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；（2）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；（3）乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。为了探讨心肌缺血时代谢变化，我们更多关注与特定代谢途径相关的代谢物。参与氨基酸代谢途径的代谢物在心肌缺血处理后显著减低；见图5。
图4
心肌缺血时血清代谢物的通路分析概览
每个圆圈的大小和颜色分别以Impact值和
表2
心肌缺血时涉及的代谢途径总览
图5
在代谢途径中定位相关代谢物
心肌梗死涉及3个代谢途径：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及乙醛酸盐和二羧酸盐代谢，柠檬酸循环可能沟通了这3个通路；红色表示显著增加，蓝色表示减少，绿色表示不变，灰色表示非差异代谢物或未涉及
3 讨论
本研究对急性MI小鼠血清进行了基于LC-MS/MS的代谢组学分析。提示在模型组的血清中存在明显的代谢途径紊乱和代谢产物改变。进一步分析发现丝氨酸相关代谢途径参与了AMI的发病过程，并探讨了其参与机制。
代谢组学作为一门新兴的技术，多在AMI患者或AMI动物模型上开展[13-14]。当在动物模型中诱导MI时，不同方法诱导的MI之间的病理生理学差异有时会被忽视。在评估新的治疗策略或评估实验室之间的比较研究时，这种缺乏区分可能会导致混乱。并且因为代谢组学的高度敏感性，在人类研究中的组内一致性是困难的[4, 13]。而大型动物模型虽然可以更好地概括心脏重构和心律失常导致的缺血性损伤的临床表现，但啮齿动物模型，特别是小鼠，可以更深入地剖析MI的细胞和分子机制，尤其适用于高通量分析[15]。故而本研究选择了C57BL/6小鼠品系，在基因组稳定的背景上，通过改良的快速冠状动脉结扎手术，使用微创肋间（第4肋间）开胸，不涉及肋骨的切割。与最初的经胸骨切开，切开大约3根肋骨，进入心脏，然后结扎左冠状动脉的手术入路相比，本研究采用的术式能够防止因手术引起过度炎症的发生，最大化避免了掩盖早期MI引起的炎症问题[15]。同时对照组小鼠也接受了相同的手术操作，以消除因手术导致的两组血清代谢物变化不一致。采集血清标本的时间是术后24 h。此外，使用血清样本而非心脏组织样本，规避因难以识别的梗死区域导致的正常心脏组织混入样本，从而影响代谢组学结果的问题。
本研究中，差异代谢物中大部分属于氨基酸及其衍生物，这些血清代谢物可能是心肌细胞的特异性降解过程的指示物或者是与心肌缺血相关的系统性组织改变。与假手术对照组相比，2种代谢物（色氨、2-氨基己二酸酯）在MI模型组的血清中的含量显著升高。色胺在MI模型组小鼠血清中的浓度升高了2.1816倍。色胺是一种微量胺类的神经递质，在血清中的浓度与前体色氨酸的浓度相关，后者被芳香族L-胺基酸类脱羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC）代谢成色胺。色胺能够通过直接刺激α肾上腺素受体和5-羟色胺受体升高血压[16]。2-氨基己二酸则是线粒体代谢产物，由必需氨基酸赖氨酸的分解代谢产生，具有能够拮抗由谷氨酸的离子通道型受体，即N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）调节的神经兴奋的特性[17-18]。在AMI期间，该受体经D丝氨酸内源性激活后，允许谷氨酸打开阳离子通道，增加交感神经的放电，从而进一步影响心脏功能[2, 19-20]。研究[1]表明，NMDAR受体阻剂美金刚（msemantine）能在MI模型中发挥心脏保护作用，这可能归因于促炎和氧化应激因子的减少以及随后心脏重塑的减少。此外，还有研究[21]表明，2-氨基己二酸血清水平的高低与线粒体功能障碍有关，并且与高密度脂蛋白负相关，而胆固醇的代谢在动脉粥样硬化中起着至关重要的作用，个体中2-氨基己二酸的升高可能通过调节高密度脂蛋白和胆固醇水平而导致心脏代谢风险[17]。在心衰后的心室重构中，它与左室舒张期末内径有关。
与之呈现相反趋势的代谢物有13种，其中有3种氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），这表明其利用增加或消耗增加。氨基酸影响细胞信号传导、募集和增殖，并且在各种代谢物和相关途径的生物合成中也具有重要作用[22]。例如，丝氨酸是一种非必需氨基酸，可以经甘氨酸转化产生，并为单碳代谢提供碳单元，参与多种生理过程和生物途径[23]。根据旋光度的不同，分为L-丝氨酸和D-丝氨酸，D-丝氨酸是由L-丝氨酸通过一种特定的消旋酶（serine racemase，SR）消旋产生的[20]。在神经系统中，它作为一种自分泌调节剂，由突触后神经元释放，可以与自己的NMDAR结合，从而“启动”受体对突触处的谷氨酸作出即时反应，促进神经元去极化和兴奋[19-20]。苏氨酸是必需氨基酸的一种，在调节营养代谢、大分子生物合成（参与形成肠黏膜蛋白和分泌的糖蛋白）和维持肠道稳态中起着至关重要的作用[24-26]。酪氨酸有β-肾上腺素受体（ESBAR）内源性敏化的作用，通过与β-肾上腺素受体位点结合，提高肾上腺素激活受体的效率，能对心衰患者心脏起正性肌力的作用[27]。
对生物途径改变的研究可以进一步探讨MI的发病机制。与假手术对照组相比，MI模型小鼠共有几种常见的代谢紊乱途径，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。而柠檬酸循环（citrate cycle）可能沟通了上述3个通路，而甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢是最受影响的通路。后者为前者提供了重要的能量代谢前体；见图5[28]。前者不仅是3大营养素（碳水化合物、脂质、氨基酸）的最终代谢途径，也是碳水化合物、脂质和氨基酸之间代谢联系的重要枢纽[29]，其在心肌的氧化磷酸化中起核心作用。因此，缺血后的心脏循环活动下降，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）产生减少，心脏收缩效率降低[30-31]。甘氨酸和丝氨酸可以通过激活心肌细胞中的甘氨酸受体来减少心中肌炎症，间接抑制心脏成纤维细胞中胶原蛋白的产生，从而改善心肌纤维化，而苏氨酸则与缺血-再灌注诱导的心肌损伤的改善有关[28-29]。另有研究[32]提到，稳定型心绞痛患者血浆甘氨酸水平与AMI风险呈负相关。
我们认为丝氨酸相关生物途径可能成为改善AMI患者预后的一个治疗靶点。丝氨酸的生物合成更是与线粒体功能和ATP的生产直接相关。有研究[33]表明，钙调神经磷酸酶Aβ1（Calcineurin，CnAβ1）依赖于通过雷帕霉素靶蛋白途径（mechanistic target of rapamycin pathway，mTOR）增强了丝氨酸和单碳代谢，从而促使了对包括谷胱甘肽在内的活性氧物质具有保护作用的抗氧化代谢产物的产生，减少了线粒体中的蛋白质氧化，并保持了ATP的产生，这反过来改善了收缩功能，并防止了心脏肥大背景下的心室重塑。而丝氨酸的生物合成有助于进入柠檬酸循环的葡萄糖通量的增加，促进NADPH的产生，以促进线粒体生成、修复及呼吸，并与衰竭心脏卸负后的心肌恢复有关[23]。来自体外吸收和体内糖酵解分支合成的丝氨酸可以转化为甘氨酸，以供给单碳代谢一碳单位。 丝氨酸是单碳代谢的主要底物。甘氨酸和一碳单位必须在细胞质或线粒体中由丝氨酸经叶酸代谢产生，而一碳单位不仅是NADH和NADPH的主要来源，还参与动脉粥样硬化和心血管疾病的发展[32, 34-35]。但在缺氧的条件下，细胞呼吸受到抑制，线粒体中的电子传递失败，丝氨酸成为NADH的主要来源，而这种累积的NADH抑制柠檬酸循环，反而存在细胞毒性[35]。
丝氨酸及一碳代谢对心肌细胞的作用可能与能量途径的改变有关。正常心脏主要消耗脂肪酸，而很少消耗葡萄糖[36]。而MI状态下能量代谢异常，心脏主要消耗葡萄糖经糖酵解获得能量[27, 31]。我们不妨提出猜想，由于电子传递链的阻断或抑制，心肌细胞可能通过丝氨酸和单碳代谢途径促进进入柠檬酸循环的葡萄糖通量，以期促进线粒体的恢复，并提供额外的ATP，帮助维持心脏的持续收缩。
这项研究也有一些局限性。首先，只对血清样本进行了分析，未对心肌细胞进行研究，从而建立代谢物变化的联系。其次，本研究所用的动物模型只采用了雄性小鼠，但在一些研究中，性别也作为能够影响MI血清代谢物中变化的因素[13, 15]。因此在未来的研究中，动物模型将包含同等数量的雄性和雌性。前文已述内源性生成的丝氨酸可以经由单碳代谢改善线粒体功能，进而改善心脏收缩功能，但外源性给予丝氨酸对心脏细胞的作用尚不知晓。因此，细胞研究及相关动物研究将在未来进行。
综上所述，本研究使用靶向的LC-MS/MS方法比较了MI小鼠和假手术对照组的血清代谢特征，反映了MI相关的能量缺乏、离子失衡、氧化应激、酸中毒和心脏损伤的病理生理过程。结果表明，存在由心肌缺血引起的代谢变化。在MI中发现丝氨酸相关代谢途径中的代谢物在血清中含量降低。根据代谢组学研究，对MI时心肌保护提出新的治疗方向。
利益冲突：无。
作者贡献：寻斯琪主要负责代谢组学数据的采集分析和论文撰写；干昌平和郭应强主要负责学术指导和论文审核；秦超毅主要负责实验设计、动物实验和论文最终审核定稿。
心肌梗死 （myocardial infarction，MI） 是指由于冠状动脉血流不足和随后的氧供应减少导致心肌细胞减少[1-2]。MI是全球心血管疾病致残和死亡的主要原因之一，因此对人类健康构成严重威胁，并将在未来成为世界性的严重公共卫生问题[3-4]。此外，其经济负担巨大，2010年该疾病给全球经济造成的损失估计为8 630亿美元[5]。在过去的几十年里，随着包含纤维蛋白溶解、经皮冠状动脉介入治疗和冠状动脉旁路移植术在内的再灌注策略，包含抗心力衰竭（心衰）、降脂、抗血栓及抗炎在内的药物治疗和标准化护理等方面的进展，MI的预后显著改善[6-7]。例如，经皮冠状动脉介入治疗能够显著改善左室功能，减少心源性死亡、MI复发以及非计划性血管重建的发生，有效的抗血栓治疗也与缺血事件的大幅减少有关，提高了MI患者存活率[6, 8] 。
然而，大面积梗死患者或未及时接受血运重建的患者发生包括急性二尖瓣反流、室间隔缺损、假性动脉瘤和游离壁破裂在内的机械并发症的风险增加，并导致患者死亡[9]。由此可见，识别有效的代谢标志物和MI治疗靶点能在改善预后中发挥关键性作用[10] 。因此，充分了解 MI 的代谢特征显得尤为迫切。
最近几年中，更具选择性和灵敏度的质谱仪推动了代谢组学研究的快速扩展，与蛋白质组学和基因组学相比，代谢组学可以研究基因型的最终表达，因此是最接近最终表型的分析技术[11] 。其可用于分析代谢表型和探索代谢重编程，从而能够鉴定生物标志物并提供对生理和病理机制进行分析研究[12] 。
本研究通过结扎冠状动脉左前降支建立小鼠急性心肌梗死（acute MI，AMI）模型，对血清进行靶向代谢组学分析，从代谢组学角度探讨心肌细胞缺血状态后的代谢变化，并进一步分析其相关代谢路径并构建网络。这些结果进一步阐明了疾病所涉及的生化机制。
1 材料与方法
1.1 小鼠急性心肌梗死模型的建立
取同批次10周龄雄性C57BL/6小鼠15只［体重15～20 g，实验动物生产许可证号SCXK（川）2020-0030 ］，随机分为两组：假手术对照组（n=5）和AMI模型组（n=10）。在没有通气的情况下用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。在胸骨左侧做一小皮肤切口，并准备了荷包缝合。在第4肋间开一个小孔，用蚊钳扩张。手法挤压外侧胸腔使跳动的心脏轻轻弹出，在冠状动脉左前降支心房下方约3 mm处用7-0丝线快速缝合。当左心室前壁变白时，即可确认结扎成功。结扎后，将心脏放回胸腔内，手动排出胸腔内空气。扎紧之前荷包缝合，在恢复期对小鼠进行监测。假手术对照组小鼠接受相同的手术操作，但未阻断其冠状动脉左前降支。
1.2 UHPLC-QqQ/MS的靶向代谢组学分析
所有小鼠于术后24 h采集血清标本。血清样本添加了两个内标的甲醇沉淀。然后收集上清液，干燥后用10 mM醋酸铵在30%水/70%乙酸乙酯+0.2%冰醋酸中重组，其中含有12.6 μM 3C5-15N-L-酪氨酸和34.68 μM 13C1-L-乳酸。将重组样品分别以正离子和负离子模式加入到UHPLC− MS/MS中，质控样品采用混合所有血清的混合样品。
靶向代谢组学分析在Nexera LC-40A UHPLC系统上进行，该系统与AB Sciex三重四极杆（QQQ）5500质谱仪（美国，马萨诸塞州弗雷明翰）相结合。然后在Waters BEH酰胺柱（2.1×100，1.7 μm，Waters，Milford，MA，USA）上在35℃的温度下进行色层分离。多反应监测模式用于检测感兴趣的代谢物。本研究从40多条代谢途径中选择了238种代谢物进行靶向分析。用Analyst 1.6.3软件采集数据，用Multiquant 3.0.2软件（AB Sciex，Framingham，MA）进行分析。
1.3 统计学分析
所有数据已在SPSS验证正态性分布。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较使用SPSSV21软件 （Chicago，IL，USA）进行非配对t检验，P≤0.05为差异有统计学意义。用代谢组学途径分析（MetaboAnalyst 5.0， http://www.metaboanalyst.ca/）对数据进行自动筛选，并对改变的代谢物进行分析，并与潜在的代谢途径相关。KEGG数据库（http://www.kegg.jp/）用于进一步确定这些改变的代谢物在各种代谢途径中的位置和功能。
1.4 伦理审查
此研究经四川大学华西医院动物伦理委员会批准，批准号为20220221020。
2 结果
2.1 两组代谢谱分析
2.1.1 与心肌缺血相关的代谢物
129种代谢物中的50种与心肌缺血相关［fold change（FC）<0.5或>2，P的阈值被设定为0.05，且经伪发现率（FDR）矫正］；见图1。其包括11种氨基酸（丝氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、谷氨酸、酪氨酸、苏氨酸、D-亮氨酸、胱氨酸、肌氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸）、2种甲基化氨基酸（二甲基甘氨酸、1/3-甲基组氨酸）、1种乙酰化氨基酸（N-乙酰甘氨酸）、2种碱基（胞嘧啶、腺嘌呤）、6种核苷（2'-脱氧尿苷、胞苷、腺苷、肌苷、1-甲基鸟苷、黄嘌呤核苷）、9种其他有机酸（杏仁酸、甘油酸、草乙酸、柠康酸、牛磺酸、壬二酸、2-氨基己二酸、2-羟基异戊酸、OH-苯基丙酮酸）、4种有机酸酯（胍基乙酸酯、腺苷酸琥珀酸酯、琥珀酸甲酯、丙二酸甲酯）、2种胆碱类及其相关产物（乙酰胆碱、三甲胺-N-氧化物），1种维生素（烟酸）、3种生物碱（色胺、脱氧肉碱、甜菜碱）及其他9种有机化合物；见表1。
图1
血清代谢物的总体趋势火山图
每个点代表一个血清代谢物，模型组中明显较高（FC>2）为红色，较低（FC＜0.5）为蓝色；不变的代谢物为灰色
表1
血清中的主要差异代谢物数据分析结果
在129种代谢的火山图中，位于中央的代谢物代表模型组和对照组的样本之间丰度相比只有较小的变化，红点显著表达上调的代谢物（共14种）。蓝点是显著表达下调的代谢物（共36种），灰点是无显著差异的代谢物。腺苷在MI模型组的血清样本中高出202.91倍，而2'-脱氧尿苷（FC=0.046051）、腺苷琥珀酸酯（FC=0.047406）、胞嘧啶（FC=0.047183）在MI模型组的血清样本的含量最低。
2.1.2 129种代谢物在样本中的变异系数
变异系数（CV）表示代谢物浓度的个体变异性的度量，从LC-MS数据中获得每种血清代谢物的浓度，随后计算CVs。根据其CV的大小分为7个亚组。在50种与心肌缺血相关的血清代谢物中，只有2种—色胺和2-氨基己二酸酯，属于可变性较小的组（共17种，CV 0.3～0.4）。14种化合物在下一个变异最小的组中（共22 种，CV 0.4～0.5）。27种代谢物的变异性相对较大，CV的范围为0.5～1.0。7种代谢物—1/3-甲基组氨酸、腺苷琥珀酸酯、甲基丙二酸、2'-脱氧尿苷、胞嘧啶、肌氨酸、黄嘌呤核苷，属于最不稳定的亚组（共12种，CV>1.0）（图2）。因此，超过一半的与心肌缺血相关的代谢物（27/50）的CV相对可变（CV 0.5～1.0）。
图2
129种代谢物根据CV大小可分为7个亚组
红色代表MI模型组相比对照组显著上调（FC＞2）的代谢物；蓝色代表MI模型组相比对照组显著下调（FC＜0.5）的代谢物；MI：心肌梗死
2.1.3 主成分分析及建立PLS-DA和OPLS模型
采用主成分分析来降低血清代谢物丰度数据的维数。主成分分析结果显示，两组的血清代谢物图标可以分开，提示在心肌缺血时代谢产物与正常状态明显不同（图3a）。由于样本量远远小于变量，故又建立了PLS-DA模型及OPLS-DA模型并进行了验证。 图3b 和图3c分别清晰展示了PLS-DA评分图及OPLS-DA评分图，可以清晰地分离MI模型组和假手术对照组血清样本的不同。图3d及图3e显示了两个模型的验证参数及用CV-ANOVA检验的P值，OPLS-DA模型的Q2和R2都>0.5，所有模型的P值均≤0.05，表明模型有效。
图3
两组血清代谢物的主成分分析
a：PCA评分图；b：PLS-DA评分图；c：OPLS-DA评分图；a～c评分图揭示了两组样本的聚类性强，组内差异不大；d：PLS-DA模型；e：OPLS-DA模型；d和e的
2.2 与心肌缺血相关的代谢物改变
以验证的OPLS-DA模型中的vip≥1、FDR≤0.05、组内CV＜0.2差异代谢物的筛选条件。假手术对照组、MI模型组血清中代谢产物变化的统计分析结果见表1。血清中共发现27种代谢物变化，包含氨基酸及其衍生物、有机酸、酯类。这些代谢产物在MI模型组和假手术对照组之间有较大差异。
2.3 心肌缺血相关代谢通路的改变
探索生物途径可能有助于阐明心肌缺血时的代谢变化。结果表明代谢产物和代谢生物网络发生了显著变化；见图4和表2。基于京都基因和基因组百科全书（KEGG）基于代谢物（impact value>0.2，FDR<0.05）的信号通路分析，筛选出影响最显著的代谢途径：（1）丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；（2）甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；（3）乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。为了探讨心肌缺血时代谢变化，我们更多关注与特定代谢途径相关的代谢物。参与氨基酸代谢途径的代谢物在心肌缺血处理后显著减低；见图5。
图4
心肌缺血时血清代谢物的通路分析概览
每个圆圈的大小和颜色分别以Impact值和
表2
心肌缺血时涉及的代谢途径总览
图5
在代谢途径中定位相关代谢物
心肌梗死涉及3个代谢途径：丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及乙醛酸盐和二羧酸盐代谢，柠檬酸循环可能沟通了这3个通路；红色表示显著增加，蓝色表示减少，绿色表示不变，灰色表示非差异代谢物或未涉及
3 讨论
本研究对急性MI小鼠血清进行了基于LC-MS/MS的代谢组学分析。提示在模型组的血清中存在明显的代谢途径紊乱和代谢产物改变。进一步分析发现丝氨酸相关代谢途径参与了AMI的发病过程，并探讨了其参与机制。
代谢组学作为一门新兴的技术，多在AMI患者或AMI动物模型上开展[13-14]。当在动物模型中诱导MI时，不同方法诱导的MI之间的病理生理学差异有时会被忽视。在评估新的治疗策略或评估实验室之间的比较研究时，这种缺乏区分可能会导致混乱。并且因为代谢组学的高度敏感性，在人类研究中的组内一致性是困难的[4, 13]。而大型动物模型虽然可以更好地概括心脏重构和心律失常导致的缺血性损伤的临床表现，但啮齿动物模型，特别是小鼠，可以更深入地剖析MI的细胞和分子机制，尤其适用于高通量分析[15]。故而本研究选择了C57BL/6小鼠品系，在基因组稳定的背景上，通过改良的快速冠状动脉结扎手术，使用微创肋间（第4肋间）开胸，不涉及肋骨的切割。与最初的经胸骨切开，切开大约3根肋骨，进入心脏，然后结扎左冠状动脉的手术入路相比，本研究采用的术式能够防止因手术引起过度炎症的发生，最大化避免了掩盖早期MI引起的炎症问题[15]。同时对照组小鼠也接受了相同的手术操作，以消除因手术导致的两组血清代谢物变化不一致。采集血清标本的时间是术后24 h。此外，使用血清样本而非心脏组织样本，规避因难以识别的梗死区域导致的正常心脏组织混入样本，从而影响代谢组学结果的问题。
本研究中，差异代谢物中大部分属于氨基酸及其衍生物，这些血清代谢物可能是心肌细胞的特异性降解过程的指示物或者是与心肌缺血相关的系统性组织改变。与假手术对照组相比，2种代谢物（色氨、2-氨基己二酸酯）在MI模型组的血清中的含量显著升高。色胺在MI模型组小鼠血清中的浓度升高了2.1816倍。色胺是一种微量胺类的神经递质，在血清中的浓度与前体色氨酸的浓度相关，后者被芳香族L-胺基酸类脱羧基酶（aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC）代谢成色胺。色胺能够通过直接刺激α肾上腺素受体和5-羟色胺受体升高血压[16]。2-氨基己二酸则是线粒体代谢产物，由必需氨基酸赖氨酸的分解代谢产生，具有能够拮抗由谷氨酸的离子通道型受体，即N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）调节的神经兴奋的特性[17-18]。在AMI期间，该受体经D丝氨酸内源性激活后，允许谷氨酸打开阳离子通道，增加交感神经的放电，从而进一步影响心脏功能[2, 19-20]。研究[1]表明，NMDAR受体阻剂美金刚（msemantine）能在MI模型中发挥心脏保护作用，这可能归因于促炎和氧化应激因子的减少以及随后心脏重塑的减少。此外，还有研究[21]表明，2-氨基己二酸血清水平的高低与线粒体功能障碍有关，并且与高密度脂蛋白负相关，而胆固醇的代谢在动脉粥样硬化中起着至关重要的作用，个体中2-氨基己二酸的升高可能通过调节高密度脂蛋白和胆固醇水平而导致心脏代谢风险[17]。在心衰后的心室重构中，它与左室舒张期末内径有关。
与之呈现相反趋势的代谢物有13种，其中有3种氨基酸（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸），这表明其利用增加或消耗增加。氨基酸影响细胞信号传导、募集和增殖，并且在各种代谢物和相关途径的生物合成中也具有重要作用[22]。例如，丝氨酸是一种非必需氨基酸，可以经甘氨酸转化产生，并为单碳代谢提供碳单元，参与多种生理过程和生物途径[23]。根据旋光度的不同，分为L-丝氨酸和D-丝氨酸，D-丝氨酸是由L-丝氨酸通过一种特定的消旋酶（serine racemase，SR）消旋产生的[20]。在神经系统中，它作为一种自分泌调节剂，由突触后神经元释放，可以与自己的NMDAR结合，从而“启动”受体对突触处的谷氨酸作出即时反应，促进神经元去极化和兴奋[19-20]。苏氨酸是必需氨基酸的一种，在调节营养代谢、大分子生物合成（参与形成肠黏膜蛋白和分泌的糖蛋白）和维持肠道稳态中起着至关重要的作用[24-26]。酪氨酸有β-肾上腺素受体（ESBAR）内源性敏化的作用，通过与β-肾上腺素受体位点结合，提高肾上腺素激活受体的效率，能对心衰患者心脏起正性肌力的作用[27]。
对生物途径改变的研究可以进一步探讨MI的发病机制。与假手术对照组相比，MI模型小鼠共有几种常见的代谢紊乱途径，如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，乙醛酸盐和二羧酸盐代谢。而柠檬酸循环（citrate cycle）可能沟通了上述3个通路，而甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢是最受影响的通路。后者为前者提供了重要的能量代谢前体；见图5[28]。前者不仅是3大营养素（碳水化合物、脂质、氨基酸）的最终代谢途径，也是碳水化合物、脂质和氨基酸之间代谢联系的重要枢纽[29]，其在心肌的氧化磷酸化中起核心作用。因此，缺血后的心脏循环活动下降，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）产生减少，心脏收缩效率降低[30-31]。甘氨酸和丝氨酸可以通过激活心肌细胞中的甘氨酸受体来减少心中肌炎症，间接抑制心脏成纤维细胞中胶原蛋白的产生，从而改善心肌纤维化，而苏氨酸则与缺血-再灌注诱导的心肌损伤的改善有关[28-29]。另有研究[32]提到，稳定型心绞痛患者血浆甘氨酸水平与AMI风险呈负相关。
我们认为丝氨酸相关生物途径可能成为改善AMI患者预后的一个治疗靶点。丝氨酸的生物合成更是与线粒体功能和ATP的生产直接相关。有研究[33]表明，钙调神经磷酸酶Aβ1（Calcineurin，CnAβ1）依赖于通过雷帕霉素靶蛋白途径（mechanistic target of rapamycin pathway，mTOR）增强了丝氨酸和单碳代谢，从而促使了对包括谷胱甘肽在内的活性氧物质具有保护作用的抗氧化代谢产物的产生，减少了线粒体中的蛋白质氧化，并保持了ATP的产生，这反过来改善了收缩功能，并防止了心脏肥大背景下的心室重塑。而丝氨酸的生物合成有助于进入柠檬酸循环的葡萄糖通量的增加，促进NADPH的产生，以促进线粒体生成、修复及呼吸，并与衰竭心脏卸负后的心肌恢复有关[23]。来自体外吸收和体内糖酵解分支合成的丝氨酸可以转化为甘氨酸，以供给单碳代谢一碳单位。 丝氨酸是单碳代谢的主要底物。甘氨酸和一碳单位必须在细胞质或线粒体中由丝氨酸经叶酸代谢产生，而一碳单位不仅是NADH和NADPH的主要来源，还参与动脉粥样硬化和心血管疾病的发展[32, 34-35]。但在缺氧的条件下，细胞呼吸受到抑制，线粒体中的电子传递失败，丝氨酸成为NADH的主要来源，而这种累积的NADH抑制柠檬酸循环，反而存在细胞毒性[35]。
丝氨酸及一碳代谢对心肌细胞的作用可能与能量途径的改变有关。正常心脏主要消耗脂肪酸，而很少消耗葡萄糖[36]。而MI状态下能量代谢异常，心脏主要消耗葡萄糖经糖酵解获得能量[27, 31]。我们不妨提出猜想，由于电子传递链的阻断或抑制，心肌细胞可能通过丝氨酸和单碳代谢途径促进进入柠檬酸循环的葡萄糖通量，以期促进线粒体的恢复，并提供额外的ATP，帮助维持心脏的持续收缩。
这项研究也有一些局限性。首先，只对血清样本进行了分析，未对心肌细胞进行研究，从而建立代谢物变化的联系。其次，本研究所用的动物模型只采用了雄性小鼠，但在一些研究中，性别也作为能够影响MI血清代谢物中变化的因素[13, 15]。因此在未来的研究中，动物模型将包含同等数量的雄性和雌性。前文已述内源性生成的丝氨酸可以经由单碳代谢改善线粒体功能，进而改善心脏收缩功能，但外源性给予丝氨酸对心脏细胞的作用尚不知晓。因此，细胞研究及相关动物研究将在未来进行。
综上所述，本研究使用靶向的LC-MS/MS方法比较了MI小鼠和假手术对照组的血清代谢特征，反映了MI相关的能量缺乏、离子失衡、氧化应激、酸中毒和心脏损伤的病理生理过程。结果表明，存在由心肌缺血引起的代谢变化。在MI中发现丝氨酸相关代谢途径中的代谢物在血清中含量降低。根据代谢组学研究，对MI时心肌保护提出新的治疗方向。
利益冲突：无。
作者贡献：寻斯琪主要负责代谢组学数据的采集分析和论文撰写；干昌平和郭应强主要负责学术指导和论文审核；秦超毅主要负责实验设计、动物实验和论文最终审核定稿。
