引用本文： 古丽娜孜·叶斯塔依, 王琪, 伊力哈木江·克尤木, 马翔. 主动脉夹层细胞焦亡相关miRNAs筛选及功能分析. 中国胸心血管外科临床杂志, 2024, 31(8): 1181-1189. doi: 10.7507/1007-4848.202305023 复制
急性主动脉夹层（acute aortic dissection，AAD）发病急且进展迅速，严重威胁患者的生命和健康[1]。2019年全球心血管相关疾病负担与危险因素数据[2]显示，AAD给个人、家庭和社会带来了沉重负担。AAD的形成是由于血管壁无法承受腔内高压，导致主动脉壁扩张、主动脉内侧层破裂使血液从破口处流入内中膜之间，剥离的内膜将血管腔分隔形成真假腔，最坏的情况是夹层破裂，患者猝死[3]。其中急性Stanford A型主动脉夹层，若不进行紧急干预，发病1周内死亡率达50%以上[4]。目前针对AAD的治疗方法中，手术被认为是根除主动脉破裂的最有效方法，包括开放手术修复和血管腔内治疗。此外，一些药物如β-阻滞剂等，已广泛被用于AAD治疗，但临床疗效有限[5]。因此，鉴于临床上治疗AAD的局限性，亟需探索AAD发病过程中可能引起血管损伤的机制，寻找其中关键机制及潜在的药物治疗靶点。
细胞焦亡是机体内程序性细胞死亡的方式之一[6]。近几年，诸多研究[7]已证明焦亡在心血管疾病中发挥重要作用，如动脉粥样硬化、心肌缺血-再灌注损伤等。焦亡发生时细胞首先形成气道、质膜破裂、细胞内促炎因子及细胞因子的释放，最终导致细胞炎症与死亡，同时具有细胞凋亡和坏死的特点[8]。研究[9]发现，与正常主动脉相比，AAD主动脉中焦亡相关蛋白，如半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteine aspartase-1，Caspase-1）、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白-3和凋亡相关斑点样蛋白的表达显著上调，这表明细胞焦亡参与了主动脉夹层的发病过程。同时，体内研究[10]表明，Caspase-1的缺失减轻了高脂饮食和血管紧张素Ⅱ诱导的AAD的发展，并减轻主动脉直径的扩张程度。上述研究表明细胞焦亡是AAD发生发展过程中的关键一环，但细胞焦亡在AAD中的调控机制尚未完全阐明。
非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是一群没有蛋白质编码能力的RNA分子，占哺乳动物中所有基因组RNA的90%以上[11]，其中微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类长度为17～25个核苷酸的内源性ncRNAs，可以通过与靶mRNAs的3'端非翻译区（3'UTRs）配对来调控基因表达[12-13]。近十几年来，越来越多的研究[14-15]表明，miRNAs可能通过不同的机制参与AAD的发生发展，通过比较正常主动脉和夹层主动脉中的miRNAs表达谱筛选出异常表达的miRNAs较多，AAD患者中miR-134-5p、miR-15a、miR-23a和miR-21表达显著上调等，都与AAD中血管病理学改变高度相关。综上所述，我们认为miRNAs可能介导了主动脉夹层患者的焦亡病变，但具体的生物标志物及机制尚不清楚。
1 资料与方法
1.1 数据来源
基于人类AAD组织的miRNAs芯片数据来自GEO数据库（
1.2 主动脉组织的获取及纳入和排除标准
收集AAD患者撕裂的主动脉，取材部位为升主动脉夹层破口处，大小为2 cm×2 cm；同时，收集对照健康人群的主动脉，取材部位为腹主动脉和肝脏分支吻合处，大小为1.5 cm×1.5 cm。术中留取组织标本后立即转移至−80℃冰箱保存。纳入标准：AAD组：在新疆医科大学第一附属医院经全主动脉CT血管造影诊断为AAD，并接受手术治疗的Stanford A型AAD患者；健康对照组：年龄、性别匹配的肝脏移植健康供体的主动脉组织。排除标准：AAD组：（1）遗传性主动脉疾病、自身免疫或结缔组织疾病；（2）家族性主动脉夹层及复发性主动脉夹层；（3）二叶式主动脉瓣等结构性心脏病；（4）合并有急性心肌梗死、急性脑梗死、严重肝肾疾病及癌症。对照组：（1）自身免疫或结缔组织疾病；（2）严重血液系统疾病、肝肾疾病及癌症；（3）合并大血管病变。
1.3 差异表达miRNAs的筛选及靶基因预测
通过GEO数据库下载的miRNAs芯片表达数据采用R语言软件（version4.2.1，
1.4 AAD细胞焦亡相关基因筛选及生物信息学分析
取miRWalk数据库预测的靶向基因和细胞焦亡相关基因的交集基因，此为AAD细胞焦亡相关基因，具体研究流程见图1。将用于基因GO和KEGG富集分析的AAD细胞焦亡相关基因导入DAVID网站，通过R语言脚本进行分析。GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC）3个方面。富集分析以P≤0.05为差异有统计学意义。
图1
AAD细胞焦亡相关miRNAs筛选及分析流程图
AAD：急性主动脉夹层
1.5 PPI网络互作构建与核心基因筛选
将AAD细胞焦亡相关基因放入STRING数据库（http://string-db.org）中构建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，通过Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，进一步通过cytoHubba的Degree算法筛选核心基因，其中连通度最大的前3个基因作为AAD的关键细胞焦亡相关基因。
1.6 Western blotting 检测相关蛋白
（1）提取人主动脉组织蛋白：将人主动脉组织剪碎至适量大小装入EP管中，按比例加入裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解、匀浆；超声波破碎仪进一步破碎组织，冰上静置30 min；低温高速（
1.7 RT-qPCR检测AAD细胞焦亡相关miRNAs水平
（1）提取人主动脉总mRNA：向剪碎的主动脉组织中加入Trizol，冰上静置5 min；在组织研磨器中研磨匀浆，将氯仿按5∶1的比例加入震荡混匀；离心后取上清，加入等体积的异丙醇；离心后弃上清，75%乙醇洗涤沉淀3遍，用无菌无酶水溶解沉淀后测定总RNA的纯度和浓度。（2）配制10 µL的ployA加尾反应体系，反应条件为37℃ 1 h，85℃ 5 s。（3）按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。（4）利用荧光实时定量PCR仪进行RT-qPCR反应：反应体系为2×qPCR Mix 10 µL，miRNA qPCR Primer 2 µL，PCR Primer 2 µL，cDNA 2 µL，ddH2O 4 µL。反应条件为95℃ 30 s（预变性），94℃ 5 s，60℃ 34 s（退火），72℃ 10 s（延伸），共40个循环。通过U6对表达数据进行归一化，并应用2−ΔΔCT方法对结果进行分析。每个样本检测3次，取平均值。引物序列信息见表1。
表1
引物序列信息
1.8 统计学分析
采用GraphPad Prism 9.2进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
±s）描述，组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用频数（百分比）描述，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
1.9 伦理审查
本研究符合医学伦理规范，遵从《赫尔辛基宣言》原则，本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理审查编号：230306-88。
2 结果
2.1 AAD细胞焦亡相关基因的选取
本研究通过PubMed数据库获取72个细胞焦亡相关基因。基于miRNAs芯片数据筛选出46个差异表达miRNAs，其中26个上调、20个下调miRNAs（见附表1，
图2
46个差异miRNAs通过miRWalk数据库预测的靶向基因与PRGs的韦恩图
PRGs：细胞焦亡相关基因
2.2 GO和KEGG富集分析
对AAD细胞焦亡相关基因进行GO分析。BP分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要涉及半胱氨酸内肽酶活性的正向调节、白介素-1和细胞因子的正向调节、对脂多糖及细菌来源分子的反应等；见图3a。MF分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要富集于半胱氨酸内肽酶活性、细胞因子受体结合、肽酶连接及肽酶活性调节等；见图3b。CC分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要富集于ESCRTⅢ复合体、囊泡膜、动粒微管、炎性小体、多泡体膜及自噬体膜等；见图3c。此外，本研究通过KEGG富集分析发现，上述AAD细胞焦亡相关基因涉及到的信号通路为沙门氏菌感染、程序性坏死、Nod样受体信号通路、致病性大肠杆菌感染、血脂与动脉粥样硬化、志贺氏菌病、Toll样受体信号通路、凋亡等；见图4。
图3
AAD细胞焦亡相关基因的GO富集分析
a：生物过程富集分析；b：分子功能富集分析；c：细胞成分富集分析；AAD：急性主动脉夹层
图4
急性主动脉夹层细胞焦亡相关基因的KEGG富集分析
2.3 PPI网络图和核心基因筛选
将AAD细胞焦亡相关基因导入到STRING数据库得到一个含有49个节点和326条边的PPI网络图；见图5a。基于Cytoscape的cytoHubba插件中Degree算法选取前3个关键AAD细胞焦亡相关基因分别为Caspase-1、IL-1β和TNF；见图5b。这3个关键AAD细胞焦亡相关基因对应的12个AAD细胞焦亡相关差异表达miRNAs见图5c。Caspase-1对应的差异表达miRNAs分别为miR-198、miR-3202和miR-514b-5p，在AAD组织中均下调；IL-1β对应的miRNAs包括下调的miR-1321、miR-3188、miR-3202和miR-4327，上调的miR-659-3p和miR-193-5P；而TNF对应的miRNAs包括miR-29b-2-5p、miR-564和miR-744-5p，在AAD组织中均下调。
图5
AAD细胞焦亡相关基因
a：AAD细胞焦亡相关基因的蛋白互作网络图；b：Cytoscape筛选关键的AAD细胞焦亡相关基因；c：AAD细胞焦亡相关miRNAs；AAD：急性主动脉夹层
2.4 AAD及健康主动脉中Caspase-1的表达
为进一步验证细胞焦亡在AAD中发挥的关键作用，我们分别获取了AAD患者和健康人的主动脉，各6例。AAD组男5例、女1例，平均年龄（48.70±6.35）岁；健康对照组男4例、女2例，平均年龄（45.30±4.58）岁。两组性别、年龄、吸烟史、高血压病史、糖尿病史和冠心病史差异均无统计学意义（P>0.05）。Western blotting检测了49个AAD细胞焦亡相关基因中最显著的核心基因Caspase-1，与健康主动脉组织相比，Caspase-1在AAD患者撕裂的主动脉组织中的表达水平显著上调，差异有统计学意义（Ρ=0.002）；见图6。
图6
AAD与健康主动脉组织Caspase-1表达水平（n=6）
AAD：急性主动脉夹层
2.5 AAD细胞焦亡相关差异表达的miRNAs
为进一步评估核心基因Caspase-1对应的AAD细胞焦亡相关miRNAs的水平，我们用RT-qPCR技术分别检测了miR-198、miR-3202和miR-514b-5p在AAD组织中的转录水平。图7显示，RT-qPCR实验表明，与健康主动脉组织相比，3个miRNAs在AAD主动脉组织中显著下调且差异有统计学意义（miR-198：P=0.004；miR-3202：P=0.015；miR-514b-5p：P=0.002），这一结果与GEO公共数据库中筛选的差异表达的miRNAs结果一致。因此，我们认为miR-198、miR-3202和miR-514b-5p的下调可能在由细胞焦亡介导的AAD的发病过程中发挥至关重要的作用，需进一步探索它们在AAD中的具体分子途径，为AAD治疗提供新的靶点。
图7
RT-qPCR验证ADD与健康主动脉组织AAD细胞焦亡关键miRNAs的表达水平（n=3）
a：miR-198；b：miR-514b-5p；c：miR-3202；AAD：急性主动脉夹层
3 讨论
AAD是一种灾难性疾病，仍然是全球公共卫生面临的一个重大挑战[16]。AAD进展的病理特征主要包括内侧层免疫系统炎症过度激活、中层平滑肌表型转换以及细胞外基质降解导致的主动脉壁减弱及血管重塑异常。血管内膜在生理状态下位于血液和间质组织的交界处，是抵御内源性危险信号的屏障，能有效隔离血液和组织液且使血管壁免受体内外各种物理、化学因素的损伤[17]。但当血管内膜受到高速血流的冲刷、血脂紊乱、烟草、药物、病原微生物等危险因素的刺激时，就会导致血管功能紊乱[18]。因此，AAD中血管内膜的内侧层免疫系统炎症过程如何被激活、血管结构的平衡以何种形式被破坏，是针对性干预和治疗的关键。miRNAs能够通过调节细胞增殖、分化、凋亡和迁移在转录后水平参与机体炎症和肿瘤等疾病过程，除了作为疾病生物标志物还可成为治疗靶点。细胞焦亡，作为一种炎性程序性死亡参与AAD的发生发展，可以被多种方式诱导发生，如化疗药物、细菌内容物、病毒感染、人体的部分调节因子等[19]。其过程有经典及非经典途径，经典途径细胞焦亡主要通过Caspase-1调控，过程主要依赖Caspase-1、消皮素D（GSDMD）等分子导致细胞肿胀破裂，细胞内容物释放，进而产生强烈的炎症反应[20]；非经典途径则通过Caspase-4/5/11通路调控[21]，同时还有Caspase-3、Caspase-8等途径[22-23]。我们认为在形成AAD前，差异表达的miRNAs在细胞焦亡产生的炎性小体及因子介导的AAD发生发展中发挥重要的作用。
因此，本研究整合了GEO数据库中AAD患者的差异miRNAs和PubMed数据库中的细胞焦亡相关基因，筛选了AAD细胞焦亡相关基因，进一步探索了AAD细胞焦亡相关基因的功能分析，其中KEGG富集分析结果表明其主要富集于沙门氏菌感染、程序性坏死、Nod样受体信号通路、致病性大肠杆菌感染、血脂与动脉粥样硬化等。通过Cytoscape软件筛选出前3个关键基因：Caspase-1、IL-1β和TNF。这3个关键AAD细胞焦亡相关基因对应12个AAD细胞焦亡相关差异表达miRNAs。其中与AAD最显著相关的细胞焦亡基因为Caspase-1，对应的显著差异表达的miRNAs为：miR-198、miR-514b-5p和miR-3202。Alvandi等[17]从小鼠组织和人类细胞系中克隆了miR-198，其是为数不多的外显子miRNA之一（3.9%），miR-198被预测受其宿主基因FSTL1启动子的调控。Sundaram等[24]在健康表皮中发现，miR-198通过下调参与迁移和增殖的靶mRNA，在健康稳定状态下减少角质形成细胞迁移。在慢性糖尿病溃疡的人体皮肤离体器官损伤后，miR-198表达降低，不利于伤口愈合。本研究发现，AAD患者组织中miR-198下调，且参与调控了Caspase-1途径。因此，miR-198是否在血管损伤时通过焦亡途径导致愈合失衡有待探索。另一个与Caspase-1调控相关的下调miRNA为miR-514b-5p，其在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中表达显著增加，通过靶向SGTB，阻断PI3K/AKT和p38信号通路促进NSCLC细胞分裂而促进细胞凋亡，被认为是治疗NSCLC的有前途的诊断和治疗靶点[25]。而miR-514b-5p是否在AAD中也具有治疗靶点的潜力仍需进一步研究。最后，miR-3202作为AAD组织中显著下调的miRNA，同时调控了AAD细胞焦亡相关基因Caspase-1和IL-1β。既往研究[26-27]表明，miR-3202靶向抗凋亡蛋白FAIM2，过表达FAIM2的人成肌细胞对DUX4诱导的细胞死亡表现出更强的抵抗力，从而为研究面肩肱肌营养不良的药物靶点开辟了新途径。此外，研究[28]发现，miR-3202通过抑制FAIM2保护吸烟者免于慢性阻塞性肺疾病。与此同时，吸烟作为AAD重要的危险因素，miR-3202的下调是否诱导焦亡从而减少其在AAD发展过程中的保护作用还未知。综上所述，我们认为miR-198、miR-514b-5p和miR-3202的下调可能与焦亡介导的AAD密切相关。
本研究利用GEO数据库挖掘基于AAD组织中显著差异表达的miRNAs，通过预测差异表达miRNAs的靶向基因，从中选取AAD细胞焦亡相关基因并进行富集分析，进一步探索焦亡介导AAD可能的生物学过程。一方面，cytoHubba筛选调控AAD细胞焦亡关键基因分别为Caspase-1、IL-1β及TNF，进而确定了12个AAD细胞焦亡相关的关键miRNAs。另一方面，人主动脉组织的Western blotting结果显示，在AAD患者主动脉中Caspase-1显著上调意味细胞焦亡参与了AAD的发病过程；利用RT-qPCR技术检测AAD患者和健康对照人群主动脉中miR-198、miR-3202和miR-514b-5p的表达水平，发现上述miRNAs均显著下调且与数据库中miRNAs的芯片表达谱一致。本研究从介导AAD细胞焦亡相关差异表达的miRNAs出发，为进一步探索AAD的焦亡机制及新的治疗靶点提供了依据。
利益冲突：无。
作者贡献：古丽娜孜·叶斯塔依负责研究设计，数据统计分析，论文撰写；王琪负责数据收集、整理；伊力哈木江·克尤木负责样本收集；马翔负责对文章的知识性内容作批评性审阅。
急性主动脉夹层（acute aortic dissection，AAD）发病急且进展迅速，严重威胁患者的生命和健康[1]。2019年全球心血管相关疾病负担与危险因素数据[2]显示，AAD给个人、家庭和社会带来了沉重负担。AAD的形成是由于血管壁无法承受腔内高压，导致主动脉壁扩张、主动脉内侧层破裂使血液从破口处流入内中膜之间，剥离的内膜将血管腔分隔形成真假腔，最坏的情况是夹层破裂，患者猝死[3]。其中急性Stanford A型主动脉夹层，若不进行紧急干预，发病1周内死亡率达50%以上[4]。目前针对AAD的治疗方法中，手术被认为是根除主动脉破裂的最有效方法，包括开放手术修复和血管腔内治疗。此外，一些药物如β-阻滞剂等，已广泛被用于AAD治疗，但临床疗效有限[5]。因此，鉴于临床上治疗AAD的局限性，亟需探索AAD发病过程中可能引起血管损伤的机制，寻找其中关键机制及潜在的药物治疗靶点。
细胞焦亡是机体内程序性细胞死亡的方式之一[6]。近几年，诸多研究[7]已证明焦亡在心血管疾病中发挥重要作用，如动脉粥样硬化、心肌缺血-再灌注损伤等。焦亡发生时细胞首先形成气道、质膜破裂、细胞内促炎因子及细胞因子的释放，最终导致细胞炎症与死亡，同时具有细胞凋亡和坏死的特点[8]。研究[9]发现，与正常主动脉相比，AAD主动脉中焦亡相关蛋白，如半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteine aspartase-1，Caspase-1）、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白-3和凋亡相关斑点样蛋白的表达显著上调，这表明细胞焦亡参与了主动脉夹层的发病过程。同时，体内研究[10]表明，Caspase-1的缺失减轻了高脂饮食和血管紧张素Ⅱ诱导的AAD的发展，并减轻主动脉直径的扩张程度。上述研究表明细胞焦亡是AAD发生发展过程中的关键一环，但细胞焦亡在AAD中的调控机制尚未完全阐明。
非编码RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是一群没有蛋白质编码能力的RNA分子，占哺乳动物中所有基因组RNA的90%以上[11]，其中微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类长度为17～25个核苷酸的内源性ncRNAs，可以通过与靶mRNAs的3'端非翻译区（3'UTRs）配对来调控基因表达[12-13]。近十几年来，越来越多的研究[14-15]表明，miRNAs可能通过不同的机制参与AAD的发生发展，通过比较正常主动脉和夹层主动脉中的miRNAs表达谱筛选出异常表达的miRNAs较多，AAD患者中miR-134-5p、miR-15a、miR-23a和miR-21表达显著上调等，都与AAD中血管病理学改变高度相关。综上所述，我们认为miRNAs可能介导了主动脉夹层患者的焦亡病变，但具体的生物标志物及机制尚不清楚。
1 资料与方法
1.1 数据来源
基于人类AAD组织的miRNAs芯片数据来自GEO数据库（
1.2 主动脉组织的获取及纳入和排除标准
收集AAD患者撕裂的主动脉，取材部位为升主动脉夹层破口处，大小为2 cm×2 cm；同时，收集对照健康人群的主动脉，取材部位为腹主动脉和肝脏分支吻合处，大小为1.5 cm×1.5 cm。术中留取组织标本后立即转移至−80℃冰箱保存。纳入标准：AAD组：在新疆医科大学第一附属医院经全主动脉CT血管造影诊断为AAD，并接受手术治疗的Stanford A型AAD患者；健康对照组：年龄、性别匹配的肝脏移植健康供体的主动脉组织。排除标准：AAD组：（1）遗传性主动脉疾病、自身免疫或结缔组织疾病；（2）家族性主动脉夹层及复发性主动脉夹层；（3）二叶式主动脉瓣等结构性心脏病；（4）合并有急性心肌梗死、急性脑梗死、严重肝肾疾病及癌症。对照组：（1）自身免疫或结缔组织疾病；（2）严重血液系统疾病、肝肾疾病及癌症；（3）合并大血管病变。
1.3 差异表达miRNAs的筛选及靶基因预测
通过GEO数据库下载的miRNAs芯片表达数据采用R语言软件（version4.2.1，
1.4 AAD细胞焦亡相关基因筛选及生物信息学分析
取miRWalk数据库预测的靶向基因和细胞焦亡相关基因的交集基因，此为AAD细胞焦亡相关基因，具体研究流程见图1。将用于基因GO和KEGG富集分析的AAD细胞焦亡相关基因导入DAVID网站，通过R语言脚本进行分析。GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞成分（cellular component，CC）3个方面。富集分析以P≤0.05为差异有统计学意义。
图1
AAD细胞焦亡相关miRNAs筛选及分析流程图
AAD：急性主动脉夹层
1.5 PPI网络互作构建与核心基因筛选
将AAD细胞焦亡相关基因放入STRING数据库（http://string-db.org）中构建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络，通过Cytoscape软件对PPI网络进行可视化分析，进一步通过cytoHubba的Degree算法筛选核心基因，其中连通度最大的前3个基因作为AAD的关键细胞焦亡相关基因。
1.6 Western blotting 检测相关蛋白
（1）提取人主动脉组织蛋白：将人主动脉组织剪碎至适量大小装入EP管中，按比例加入裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解、匀浆；超声波破碎仪进一步破碎组织，冰上静置30 min；低温高速（
1.7 RT-qPCR检测AAD细胞焦亡相关miRNAs水平
（1）提取人主动脉总mRNA：向剪碎的主动脉组织中加入Trizol，冰上静置5 min；在组织研磨器中研磨匀浆，将氯仿按5∶1的比例加入震荡混匀；离心后取上清，加入等体积的异丙醇；离心后弃上清，75%乙醇洗涤沉淀3遍，用无菌无酶水溶解沉淀后测定总RNA的纯度和浓度。（2）配制10 µL的ployA加尾反应体系，反应条件为37℃ 1 h，85℃ 5 s。（3）按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA。（4）利用荧光实时定量PCR仪进行RT-qPCR反应：反应体系为2×qPCR Mix 10 µL，miRNA qPCR Primer 2 µL，PCR Primer 2 µL，cDNA 2 µL，ddH2O 4 µL。反应条件为95℃ 30 s（预变性），94℃ 5 s，60℃ 34 s（退火），72℃ 10 s（延伸），共40个循环。通过U6对表达数据进行归一化，并应用2−ΔΔCT方法对结果进行分析。每个样本检测3次，取平均值。引物序列信息见表1。
表1
引物序列信息
1.8 统计学分析
采用GraphPad Prism 9.2进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）描述，组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用频数（百分比）描述，组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
1.9 伦理审查
本研究符合医学伦理规范，遵从《赫尔辛基宣言》原则，本实验经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，伦理审查编号：230306-88。
2 结果
2.1 AAD细胞焦亡相关基因的选取
本研究通过PubMed数据库获取72个细胞焦亡相关基因。基于miRNAs芯片数据筛选出46个差异表达miRNAs，其中26个上调、20个下调miRNAs（见附表1，
图2
46个差异miRNAs通过miRWalk数据库预测的靶向基因与PRGs的韦恩图
PRGs：细胞焦亡相关基因
2.2 GO和KEGG富集分析
对AAD细胞焦亡相关基因进行GO分析。BP分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要涉及半胱氨酸内肽酶活性的正向调节、白介素-1和细胞因子的正向调节、对脂多糖及细菌来源分子的反应等；见图3a。MF分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要富集于半胱氨酸内肽酶活性、细胞因子受体结合、肽酶连接及肽酶活性调节等；见图3b。CC分析结果表明，差异表达的AAD细胞焦亡相关基因主要富集于ESCRTⅢ复合体、囊泡膜、动粒微管、炎性小体、多泡体膜及自噬体膜等；见图3c。此外，本研究通过KEGG富集分析发现，上述AAD细胞焦亡相关基因涉及到的信号通路为沙门氏菌感染、程序性坏死、Nod样受体信号通路、致病性大肠杆菌感染、血脂与动脉粥样硬化、志贺氏菌病、Toll样受体信号通路、凋亡等；见图4。
图3
AAD细胞焦亡相关基因的GO富集分析
a：生物过程富集分析；b：分子功能富集分析；c：细胞成分富集分析；AAD：急性主动脉夹层
图4
急性主动脉夹层细胞焦亡相关基因的KEGG富集分析
2.3 PPI网络图和核心基因筛选
将AAD细胞焦亡相关基因导入到STRING数据库得到一个含有49个节点和326条边的PPI网络图；见图5a。基于Cytoscape的cytoHubba插件中Degree算法选取前3个关键AAD细胞焦亡相关基因分别为Caspase-1、IL-1β和TNF；见图5b。这3个关键AAD细胞焦亡相关基因对应的12个AAD细胞焦亡相关差异表达miRNAs见图5c。Caspase-1对应的差异表达miRNAs分别为miR-198、miR-3202和miR-514b-5p，在AAD组织中均下调；IL-1β对应的miRNAs包括下调的miR-1321、miR-3188、miR-3202和miR-4327，上调的miR-659-3p和miR-193-5P；而TNF对应的miRNAs包括miR-29b-2-5p、miR-564和miR-744-5p，在AAD组织中均下调。
图5
AAD细胞焦亡相关基因
a：AAD细胞焦亡相关基因的蛋白互作网络图；b：Cytoscape筛选关键的AAD细胞焦亡相关基因；c：AAD细胞焦亡相关miRNAs；AAD：急性主动脉夹层
2.4 AAD及健康主动脉中Caspase-1的表达
为进一步验证细胞焦亡在AAD中发挥的关键作用，我们分别获取了AAD患者和健康人的主动脉，各6例。AAD组男5例、女1例，平均年龄（48.70±6.35）岁；健康对照组男4例、女2例，平均年龄（45.30±4.58）岁。两组性别、年龄、吸烟史、高血压病史、糖尿病史和冠心病史差异均无统计学意义（P>0.05）。Western blotting检测了49个AAD细胞焦亡相关基因中最显著的核心基因Caspase-1，与健康主动脉组织相比，Caspase-1在AAD患者撕裂的主动脉组织中的表达水平显著上调，差异有统计学意义（Ρ=0.002）；见图6。
图6
AAD与健康主动脉组织Caspase-1表达水平（n=6）
AAD：急性主动脉夹层
2.5 AAD细胞焦亡相关差异表达的miRNAs
为进一步评估核心基因Caspase-1对应的AAD细胞焦亡相关miRNAs的水平，我们用RT-qPCR技术分别检测了miR-198、miR-3202和miR-514b-5p在AAD组织中的转录水平。图7显示，RT-qPCR实验表明，与健康主动脉组织相比，3个miRNAs在AAD主动脉组织中显著下调且差异有统计学意义（miR-198：P=0.004；miR-3202：P=0.015；miR-514b-5p：P=0.002），这一结果与GEO公共数据库中筛选的差异表达的miRNAs结果一致。因此，我们认为miR-198、miR-3202和miR-514b-5p的下调可能在由细胞焦亡介导的AAD的发病过程中发挥至关重要的作用，需进一步探索它们在AAD中的具体分子途径，为AAD治疗提供新的靶点。
图7
RT-qPCR验证ADD与健康主动脉组织AAD细胞焦亡关键miRNAs的表达水平（n=3）
a：miR-198；b：miR-514b-5p；c：miR-3202；AAD：急性主动脉夹层
3 讨论
AAD是一种灾难性疾病，仍然是全球公共卫生面临的一个重大挑战[16]。AAD进展的病理特征主要包括内侧层免疫系统炎症过度激活、中层平滑肌表型转换以及细胞外基质降解导致的主动脉壁减弱及血管重塑异常。血管内膜在生理状态下位于血液和间质组织的交界处，是抵御内源性危险信号的屏障，能有效隔离血液和组织液且使血管壁免受体内外各种物理、化学因素的损伤[17]。但当血管内膜受到高速血流的冲刷、血脂紊乱、烟草、药物、病原微生物等危险因素的刺激时，就会导致血管功能紊乱[18]。因此，AAD中血管内膜的内侧层免疫系统炎症过程如何被激活、血管结构的平衡以何种形式被破坏，是针对性干预和治疗的关键。miRNAs能够通过调节细胞增殖、分化、凋亡和迁移在转录后水平参与机体炎症和肿瘤等疾病过程，除了作为疾病生物标志物还可成为治疗靶点。细胞焦亡，作为一种炎性程序性死亡参与AAD的发生发展，可以被多种方式诱导发生，如化疗药物、细菌内容物、病毒感染、人体的部分调节因子等[19]。其过程有经典及非经典途径，经典途径细胞焦亡主要通过Caspase-1调控，过程主要依赖Caspase-1、消皮素D（GSDMD）等分子导致细胞肿胀破裂，细胞内容物释放，进而产生强烈的炎症反应[20]；非经典途径则通过Caspase-4/5/11通路调控[21]，同时还有Caspase-3、Caspase-8等途径[22-23]。我们认为在形成AAD前，差异表达的miRNAs在细胞焦亡产生的炎性小体及因子介导的AAD发生发展中发挥重要的作用。
因此，本研究整合了GEO数据库中AAD患者的差异miRNAs和PubMed数据库中的细胞焦亡相关基因，筛选了AAD细胞焦亡相关基因，进一步探索了AAD细胞焦亡相关基因的功能分析，其中KEGG富集分析结果表明其主要富集于沙门氏菌感染、程序性坏死、Nod样受体信号通路、致病性大肠杆菌感染、血脂与动脉粥样硬化等。通过Cytoscape软件筛选出前3个关键基因：Caspase-1、IL-1β和TNF。这3个关键AAD细胞焦亡相关基因对应12个AAD细胞焦亡相关差异表达miRNAs。其中与AAD最显著相关的细胞焦亡基因为Caspase-1，对应的显著差异表达的miRNAs为：miR-198、miR-514b-5p和miR-3202。Alvandi等[17]从小鼠组织和人类细胞系中克隆了miR-198，其是为数不多的外显子miRNA之一（3.9%），miR-198被预测受其宿主基因FSTL1启动子的调控。Sundaram等[24]在健康表皮中发现，miR-198通过下调参与迁移和增殖的靶mRNA，在健康稳定状态下减少角质形成细胞迁移。在慢性糖尿病溃疡的人体皮肤离体器官损伤后，miR-198表达降低，不利于伤口愈合。本研究发现，AAD患者组织中miR-198下调，且参与调控了Caspase-1途径。因此，miR-198是否在血管损伤时通过焦亡途径导致愈合失衡有待探索。另一个与Caspase-1调控相关的下调miRNA为miR-514b-5p，其在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中表达显著增加，通过靶向SGTB，阻断PI3K/AKT和p38信号通路促进NSCLC细胞分裂而促进细胞凋亡，被认为是治疗NSCLC的有前途的诊断和治疗靶点[25]。而miR-514b-5p是否在AAD中也具有治疗靶点的潜力仍需进一步研究。最后，miR-3202作为AAD组织中显著下调的miRNA，同时调控了AAD细胞焦亡相关基因Caspase-1和IL-1β。既往研究[26-27]表明，miR-3202靶向抗凋亡蛋白FAIM2，过表达FAIM2的人成肌细胞对DUX4诱导的细胞死亡表现出更强的抵抗力，从而为研究面肩肱肌营养不良的药物靶点开辟了新途径。此外，研究[28]发现，miR-3202通过抑制FAIM2保护吸烟者免于慢性阻塞性肺疾病。与此同时，吸烟作为AAD重要的危险因素，miR-3202的下调是否诱导焦亡从而减少其在AAD发展过程中的保护作用还未知。综上所述，我们认为miR-198、miR-514b-5p和miR-3202的下调可能与焦亡介导的AAD密切相关。
本研究利用GEO数据库挖掘基于AAD组织中显著差异表达的miRNAs，通过预测差异表达miRNAs的靶向基因，从中选取AAD细胞焦亡相关基因并进行富集分析，进一步探索焦亡介导AAD可能的生物学过程。一方面，cytoHubba筛选调控AAD细胞焦亡关键基因分别为Caspase-1、IL-1β及TNF，进而确定了12个AAD细胞焦亡相关的关键miRNAs。另一方面，人主动脉组织的Western blotting结果显示，在AAD患者主动脉中Caspase-1显著上调意味细胞焦亡参与了AAD的发病过程；利用RT-qPCR技术检测AAD患者和健康对照人群主动脉中miR-198、miR-3202和miR-514b-5p的表达水平，发现上述miRNAs均显著下调且与数据库中miRNAs的芯片表达谱一致。本研究从介导AAD细胞焦亡相关差异表达的miRNAs出发，为进一步探索AAD的焦亡机制及新的治疗靶点提供了依据。
利益冲突：无。
作者贡献：古丽娜孜·叶斯塔依负责研究设计，数据统计分析，论文撰写；王琪负责数据收集、整理；伊力哈木江·克尤木负责样本收集；马翔负责对文章的知识性内容作批评性审阅。
