引用本文： 黄立勇, 潘杰, 卢星榕, 池畔. miR-196和HoxB8与结直肠癌Folfox4化疗敏感性的相关研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(1): 35-39. doi: 10.7507/1007-9424.20140007 复制
目前，结直肠癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第3位[1]，国内的发病率和死亡率也呈上升趋势[2]。在肿瘤早期，多数结直肠癌可通过手术治疗治愈，但对局部进展及发生远处转移的患者，需联合化疗来治疗，目前，Folfox4方案是临床上针对进展期结直肠癌患者较常用的化疗方案之一。笔者的研究发现（待发表），HoxB8基因的差异表达与Folfox4化疗方案的敏感性相关，在结直肠癌细胞中通过RNAi方式抑制HoxB8基因表达，可显著提高结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。国外有研究[3]发现，HoxB8的上游调控基因miR-196的表达差异也可导致结直肠癌细胞对铂类化疗药物敏感性的不同。本研究拟通过检测结直肠癌患者新辅助化疗组与未行化疗组，以及化疗敏感组与不敏感组中miR-196及HoxB8表达的差异，以探讨两者表达水平与Folfox4化疗方案的相关性及其意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2008年11月至2011年12月期间在福建医科大学协和医院结直肠外科手术切除的80例结直肠癌组织标本，所有患者均经术后病理检查确诊，其临床及病理资料完整，所有病例在接受治疗前均未行其他治疗。纳入研究的80例患者，根据其治疗方式的不同分为了新辅助化疗组（50例）和未化疗组（30例）。患者接受入选组的治疗计划并签署知情同意书。对于接受新辅助化疗（Folfox4≥3次）的患者，于化疗前后均常规行腹部及盆腔CT或MR扫描检查，并请影像学专家根据实体肿瘤评价标准（RECIST标准）[4]对化疗反应进行评估，将完全缓解（CR）和部分缓解（PR）者纳入敏感组（25例），而疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）者则纳入不敏感组（25例）。3组患者的基本资料见表 1，由表 1可见，3组患者的基本资料相似，具有可比性。
表1
3组患者的基本资料
Table1.
The basic data of patients in 3 groups
1.2 治疗
1.2.1 新辅助化疗组
均采用Folfox4方案化疗，至少完成3个周期，即奥沙利铂（OXA）85 mg/m2（第1天）联合亚叶酸钙（LV）200 mg/m2（第1和第2天）静脉滴注2 h，序贯氟脲嘧啶（FU）400 mg/m2静脉推注以及1 200 mg/m2持续44 h静脉滴注，每2周为1个疗程，≥3疗程。患者于化疗前后行腹部及盆腔CT或MR检查，根据RECIST实体瘤评判标准对肿瘤化疗反应进行评估。于化疗结束后4～6周进行手术切除肿瘤。
1.2.2 未化疗组
纳入该组的患者经相关检查无明显手术禁忌证后行标准结直肠癌根治术。
所有纳入研究患者的手术切除标本离体后均迅速放入10%甲醛固定液中保存，并及时送笔者所在医院病理科行石蜡包埋保存，以尽量降低其RNA的降解。
1.3 方法
1.3.1 主要试剂与仪器
病理组织蜡块中总RNA提取试剂盒（miRNeasy FFPE Kit）购自德国QIAG-ENE公司；逆转录试剂盒（miScript Reverse Transc-ription Kit）及荧光定量PCR试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均购自日本TAKARA公司；miR-196、 HoxB8及内参照U6引物委托商业公司（上海生工）合成（表 2）；HoxB8抗体（goat polyclonal IgG）购自美国santa cruz公司（产品代号：sc-82879），工作浓度为1︰200；SABC试剂盒（包含有二抗：SA1023-山羊IgG）购买自武汉博士德生物公司；酶标仪（DU-600型分光度计）为Beckman公司产品，real-time PCR仪ABI 7500 Fast为美国Ambion公司产品。
表2
real-time PCR的引物序列
Table2.
Primer sequence of real-time PCR
1.3.2 石蜡包埋组织的总RNA提取切取10 μm
厚石蜡组织块2片，放入经焦碳酸二乙酯（DEPC）水及高压处理后的1.5 mL EP管中，加1 mL二甲苯常规脱蜡2次，尽可能清除石蜡，经100%乙醇洗涤2次后离心（14 000 r/min，r=8 cm，2 min），除去乙醇，室温晾干15 min使剩余乙醇完全挥发。参照德国QIAGENE公司miRNeasy FFPE Kit试剂盒说明书中的方法，提取蜡块组织中的总RNA（包括mRNA和microRNA），将所提取的总RNA溶于15～20 μL的去核糖核酸酶（Rnase-free）水中，用酶标仪测定所提取的总RNA溶液浓度以及波长260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），选取总RNA浓度大于100 ng/μL及A260 /A280比值介于1.8～2.1之间者用于后续实验。
1.3.3 miR-196和HoxB8的逆转录反应
参照日本TAKARA公司逆转录试剂盒产品说明书配制逆转录反应混合液（2×miRNA逆转录缓冲液10 μL；0.1%BSA 2 μL；miRNA逆转录酶混合液2 μL；RNA定量至0.5 μg，加Rnase-free水至总反应液量达20 μL），反应条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.3.4 SYBR Green荧光定量PCR
参照日本TAK-ARA公司的荧光定量PCR试剂盒说明书分别配制miR-196和HoxB8的反应混合液（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL；F-Primer 0.8 μL；R-Primer 0.8 μL；校正染料（ROX Reference Dye Ⅱ）0.4 μL；RNase-free水6 μL；cDNA 2 μL），反应条件参照说明书如下：预变性95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃，3 s；60 ℃，30 s，共40个循环，均以U6为内参照，重复3个复孔，取所得Ct均值；采用2-ΔΔct法分析。
1.3.5 HoxB8蛋白表达检测
采用免疫组化SABC法检测化疗敏感组及不敏感组中HoxB8蛋白的表达情况。参照说明书进行实验，以PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照图片由试剂公司提供。结果判定标准：按每张切片中的阳性细胞的百分比和着色深浅计分，行半定量分析[5-6]。在高倍镜视野下（400倍）随机选取5个视野（上中下及左右），根据其着色强度评分：0分为无着色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色；并根据阳性细胞百分比评分：阳性细胞所占百分比＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。分别计算其均值，最后将两项评分的乘积作为总评分，总分为0分判为阴性（−），1～3分判为弱阳性（＋），4～7分判为阳性（＋＋），8～12分判为强阳性（＋＋＋）。以上结果判断均在双盲法下进行。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 新辅助化疗组与未化疗组中miR-196和HoxB8 mRNA表达检测结果
新辅助化疗组中miR-196和HoxB8 mRNA的相对表达量分别为0.646 8±0.683 9和0.607 6±0.418 9，其表达水平均低于未化疗组的1.000 0±0.000 0和1.000 0±0.000 0（均P＜0.01）。
2.2 化疗敏感组与不敏感组中miR-196和HoxB8 mRNA表达检测结果
2.2.1 PCR结果
miR-196在化疗敏感组与不敏感组中的表达相对量分别为0.948 9±0.691 0和0.344 7±0.536 1，化疗敏感组的miR-196表达水平明显高于不敏感组，Mann-Whitney检验提示2组间的差异有统计学意义（Z=-3.172，P＜0.01）。HoxB8 mRNA在化疗敏感组与不敏感组中的表达相对量分别为0.489 9±0.371 5和0.725 3±0.437 5，化疗敏感组的HoxB8 mRNA表达水平低于不敏感组，Mann-Whitney检验提示2组间的差异有统计学意义（Z=-2.222，P＜0.05）。
2.2.2 免疫组化染色结果
结果见图 1和表 3。由图 1和表 3可见，HoxB8蛋白在结直肠癌组织中主要表达于细胞质；在化疗敏感组其HoxB8蛋白表达阳性率低于不敏感组，经Mann-Whitney检验其差异有统计学意义（Z=-2.396，P=0.017）。
图1
示HoxB8蛋白在结直肠癌组织中的表达（SABC ×400）。1A：敏感组；1B：不敏感组
Figure1.
Expression of HoxB8 protein in colorectal carcinoma tissues (SABC ×400). 1A:Sensitive group; 1B:Insensitive group
表3
化疗敏感组与不敏感组HoxB8蛋白表达检测结果〔例（%）〕
Table3.
Results of HoxB8 protein expression between the sensitive group and insensitive group for chemotherapy〔case(%)〕
2.3 miR-196和HoxB8 mRNA表达的相关性分析结果
在未化疗组的30例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表达存在负相关关系，其Spearman相关系数r=-0.435，P=0.016。在新辅助化疗组的50例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表达也存在负相关关系，其Spearman相关系数r=-0.595，P＜0.01。
3 讨论
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种由内源基因编码的小分子单链非编码RNA，长约21～25个核苷酸，可以通过形成RNA诱导沉默复合体（RISC）与靶基因完全或不完全互补结合[7-9]，诱导靶mRNA的裂解或抑制蛋白翻译来调控靶基因的表达[10-11]，也可以作为癌基因或抑癌基因参与恶性肿瘤的发生与演进[12-13]。miR-196是位于Hox基因家族上游的一类微小RNA，对Hox基因家族中多数成员的表达情况具有负向调控作用，且以对HoxB8的调控作用最为多见[3, 14-18]。研究发现miR-196在多种恶性肿瘤中表达升高：Bloomston等[19]发现，在胰腺癌患者组织中miR-196表达量较正常胰腺组织升高，且高表达miR-196时提示患者的预后差、生存期缩短；Liao等[20]利用qRT-PCR方法检测63例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中的miR-196表达，发现miR-196在胃癌组织中呈高表达，这一结果在Tsai等[21]的研究中也获得了认可；Schimanski等[3]在对结肠癌和正常结肠黏膜进行定量PCR测定后发现，在结肠癌组织中，miR-196的表达水平亦有上调，而在相应的正常结肠黏膜中表达较低。在笔者研究小组的前期研究[22]发现，在30例术前未接受化疗的结直肠癌患者切除的新鲜癌组织标本中miR-196的表达水平亦较正常黏膜中的表达水平升高（P＜0.05），与上述文献报道结果相符。有研究还发现，一些化疗药物如5-FU或奥沙利铂等可以改变大肠癌细胞中miRNAs分子表达水平，提示miRNA可能作为化疗药物作用的新型靶点，为新型抗癌药物的开发提供新的策略和思路：Meng等[23]发现，在化疗药物的干预下，miRNA的表达谱会发生变化，进而提出将miRNA作为化疗药物疗效的预测指标；Schimanski等[3]的研究也进一步指出，高浓度的miR-196可以使结直肠癌细胞对于铂类药物的化疗敏感性升高。本研究结果提示：结直肠癌患者miR-196的表达水平在接受Folfox4方案化疗后下降，且对化疗的不同反应程度其表达水平有差异，敏感组中miR-196的表达水平较不敏感组为高，提示高表达的miR-196可以使患者对于Folfox4方案的化疗敏感性提高，这在一定程度上与Schimanski等[3]的研究结果相吻合。
HoxB8是同源盒基因家族成员之一，位于人类第17号染色体，是一个序列特异性转录因子，其编码的产物为DNA结合蛋白，在细胞的分化、发育和器官形成中发挥重要作用[24-25]。且有研究[26]表明，其在结直肠癌组织中相较正常黏膜呈高水平表达。笔者研究小组在前期细胞实验中发现（待发表）：HoxB8的差异表达与Folfox4方案化疗敏感性相关，且通过RNAi抑制HoxB8基因表达，能够显著提高结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。由此笔者进一步对接受Folfox4方案化疗患者结直肠癌组织标本中HoxB8蛋白表达情况进行检测，结果发现，结直肠癌患者在接受Folfox4方案化疗干预后，HoxB8蛋白的表达阳性率降低，且对化疗的不同敏感度其表达阳性率也有差异，敏感组中HoxB8的表达阳性率低于不敏感组，这进一步表明了HoxB8的高表达可以降低Folfox4化疗的敏感性，与前期实验结果相吻合。
同时，本研究对miR-196和HoxB8表达水平的相关性进行了分析，发现无论是在直接手术组还是新辅助化疗组，miR-196和HoxB8的表达都存在负相关关系，进一步验证了两者之间具有调控关系，且在化疗药物干预后此调控作用依然存在。结合两者在化疗敏感组与不敏感组中的表达差异，笔者提出可以将miR-196和HoxB8在结直肠癌患者中的表达情况作为预测患者是否对Folfox4化疗方案敏感的指标，来预测化疗的反应性与毒性，通过检测这两个因子的表达水平来筛选能够从Folfox4化疗方案中获益的患者，开展个体化治疗；并且miR-196和HoxB8有望成为化疗药物作用的新型靶点，在药物研制上可以通过直接抑制HoxB8的表达来提高化疗药物的敏感性，或是对其上游的调控基因miR-196进行干预，间接改变HoxB8的表达来提高患者的化疗敏感性，为新型抗癌药物的研发提供新的策略和思路。由于本实验纳入的病例数有限，相关结果有待进一步的大宗病例的研究予以证实。
目前，结直肠癌的发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的第3位[1]，国内的发病率和死亡率也呈上升趋势[2]。在肿瘤早期，多数结直肠癌可通过手术治疗治愈，但对局部进展及发生远处转移的患者，需联合化疗来治疗，目前，Folfox4方案是临床上针对进展期结直肠癌患者较常用的化疗方案之一。笔者的研究发现（待发表），HoxB8基因的差异表达与Folfox4化疗方案的敏感性相关，在结直肠癌细胞中通过RNAi方式抑制HoxB8基因表达，可显著提高结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。国外有研究[3]发现，HoxB8的上游调控基因miR-196的表达差异也可导致结直肠癌细胞对铂类化疗药物敏感性的不同。本研究拟通过检测结直肠癌患者新辅助化疗组与未行化疗组，以及化疗敏感组与不敏感组中miR-196及HoxB8表达的差异，以探讨两者表达水平与Folfox4化疗方案的相关性及其意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
选取2008年11月至2011年12月期间在福建医科大学协和医院结直肠外科手术切除的80例结直肠癌组织标本，所有患者均经术后病理检查确诊，其临床及病理资料完整，所有病例在接受治疗前均未行其他治疗。纳入研究的80例患者，根据其治疗方式的不同分为了新辅助化疗组（50例）和未化疗组（30例）。患者接受入选组的治疗计划并签署知情同意书。对于接受新辅助化疗（Folfox4≥3次）的患者，于化疗前后均常规行腹部及盆腔CT或MR扫描检查，并请影像学专家根据实体肿瘤评价标准（RECIST标准）[4]对化疗反应进行评估，将完全缓解（CR）和部分缓解（PR）者纳入敏感组（25例），而疾病稳定（SD）和疾病进展（PD）者则纳入不敏感组（25例）。3组患者的基本资料见表 1，由表 1可见，3组患者的基本资料相似，具有可比性。
表1
3组患者的基本资料
Table1.
The basic data of patients in 3 groups
1.2 治疗
1.2.1 新辅助化疗组
均采用Folfox4方案化疗，至少完成3个周期，即奥沙利铂（OXA）85 mg/m2（第1天）联合亚叶酸钙（LV）200 mg/m2（第1和第2天）静脉滴注2 h，序贯氟脲嘧啶（FU）400 mg/m2静脉推注以及1 200 mg/m2持续44 h静脉滴注，每2周为1个疗程，≥3疗程。患者于化疗前后行腹部及盆腔CT或MR检查，根据RECIST实体瘤评判标准对肿瘤化疗反应进行评估。于化疗结束后4～6周进行手术切除肿瘤。
1.2.2 未化疗组
纳入该组的患者经相关检查无明显手术禁忌证后行标准结直肠癌根治术。
所有纳入研究患者的手术切除标本离体后均迅速放入10%甲醛固定液中保存，并及时送笔者所在医院病理科行石蜡包埋保存，以尽量降低其RNA的降解。
1.3 方法
1.3.1 主要试剂与仪器
病理组织蜡块中总RNA提取试剂盒（miRNeasy FFPE Kit）购自德国QIAG-ENE公司；逆转录试剂盒（miScript Reverse Transc-ription Kit）及荧光定量PCR试剂盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均购自日本TAKARA公司；miR-196、 HoxB8及内参照U6引物委托商业公司（上海生工）合成（表 2）；HoxB8抗体（goat polyclonal IgG）购自美国santa cruz公司（产品代号：sc-82879），工作浓度为1︰200；SABC试剂盒（包含有二抗：SA1023-山羊IgG）购买自武汉博士德生物公司；酶标仪（DU-600型分光度计）为Beckman公司产品，real-time PCR仪ABI 7500 Fast为美国Ambion公司产品。
表2
real-time PCR的引物序列
Table2.
Primer sequence of real-time PCR
1.3.2 石蜡包埋组织的总RNA提取切取10 μm
厚石蜡组织块2片，放入经焦碳酸二乙酯（DEPC）水及高压处理后的1.5 mL EP管中，加1 mL二甲苯常规脱蜡2次，尽可能清除石蜡，经100%乙醇洗涤2次后离心（14 000 r/min，r=8 cm，2 min），除去乙醇，室温晾干15 min使剩余乙醇完全挥发。参照德国QIAGENE公司miRNeasy FFPE Kit试剂盒说明书中的方法，提取蜡块组织中的总RNA（包括mRNA和microRNA），将所提取的总RNA溶于15～20 μL的去核糖核酸酶（Rnase-free）水中，用酶标仪测定所提取的总RNA溶液浓度以及波长260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），选取总RNA浓度大于100 ng/μL及A260 /A280比值介于1.8～2.1之间者用于后续实验。
1.3.3 miR-196和HoxB8的逆转录反应
参照日本TAKARA公司逆转录试剂盒产品说明书配制逆转录反应混合液（2×miRNA逆转录缓冲液10 μL；0.1%BSA 2 μL；miRNA逆转录酶混合液2 μL；RNA定量至0.5 μg，加Rnase-free水至总反应液量达20 μL），反应条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 s，得到的cDNA于-20 ℃保存。
1.3.4 SYBR Green荧光定量PCR
参照日本TAK-ARA公司的荧光定量PCR试剂盒说明书分别配制miR-196和HoxB8的反应混合液（SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL；F-Primer 0.8 μL；R-Primer 0.8 μL；校正染料（ROX Reference Dye Ⅱ）0.4 μL；RNase-free水6 μL；cDNA 2 μL），反应条件参照说明书如下：预变性95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃，3 s；60 ℃，30 s，共40个循环，均以U6为内参照，重复3个复孔，取所得Ct均值；采用2-ΔΔct法分析。
1.3.5 HoxB8蛋白表达检测
采用免疫组化SABC法检测化疗敏感组及不敏感组中HoxB8蛋白的表达情况。参照说明书进行实验，以PBS代替一抗作阴性对照，阳性对照图片由试剂公司提供。结果判定标准：按每张切片中的阳性细胞的百分比和着色深浅计分，行半定量分析[5-6]。在高倍镜视野下（400倍）随机选取5个视野（上中下及左右），根据其着色强度评分：0分为无着色；1分为淡黄色；2分为棕黄色；3分为棕褐色；并根据阳性细胞百分比评分：阳性细胞所占百分比＜5%为0分，5%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，＞75%为4分。分别计算其均值，最后将两项评分的乘积作为总评分，总分为0分判为阴性（−），1～3分判为弱阳性（＋），4～7分判为阳性（＋＋），8～12分判为强阳性（＋＋＋）。以上结果判断均在双盲法下进行。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件包进行数据分析。计量资料数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 新辅助化疗组与未化疗组中miR-196和HoxB8 mRNA表达检测结果
新辅助化疗组中miR-196和HoxB8 mRNA的相对表达量分别为0.646 8±0.683 9和0.607 6±0.418 9，其表达水平均低于未化疗组的1.000 0±0.000 0和1.000 0±0.000 0（均P＜0.01）。
2.2 化疗敏感组与不敏感组中miR-196和HoxB8 mRNA表达检测结果
2.2.1 PCR结果
miR-196在化疗敏感组与不敏感组中的表达相对量分别为0.948 9±0.691 0和0.344 7±0.536 1，化疗敏感组的miR-196表达水平明显高于不敏感组，Mann-Whitney检验提示2组间的差异有统计学意义（Z=-3.172，P＜0.01）。HoxB8 mRNA在化疗敏感组与不敏感组中的表达相对量分别为0.489 9±0.371 5和0.725 3±0.437 5，化疗敏感组的HoxB8 mRNA表达水平低于不敏感组，Mann-Whitney检验提示2组间的差异有统计学意义（Z=-2.222，P＜0.05）。
2.2.2 免疫组化染色结果
结果见图 1和表 3。由图 1和表 3可见，HoxB8蛋白在结直肠癌组织中主要表达于细胞质；在化疗敏感组其HoxB8蛋白表达阳性率低于不敏感组，经Mann-Whitney检验其差异有统计学意义（Z=-2.396，P=0.017）。
图1
示HoxB8蛋白在结直肠癌组织中的表达（SABC ×400）。1A：敏感组；1B：不敏感组
Figure1.
Expression of HoxB8 protein in colorectal carcinoma tissues (SABC ×400). 1A:Sensitive group; 1B:Insensitive group
表3
化疗敏感组与不敏感组HoxB8蛋白表达检测结果〔例（%）〕
Table3.
Results of HoxB8 protein expression between the sensitive group and insensitive group for chemotherapy〔case(%)〕
2.3 miR-196和HoxB8 mRNA表达的相关性分析结果
在未化疗组的30例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表达存在负相关关系，其Spearman相关系数r=-0.435，P=0.016。在新辅助化疗组的50例患者中，miR-196和HoxB8 mRNA表达也存在负相关关系，其Spearman相关系数r=-0.595，P＜0.01。
3 讨论
微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种由内源基因编码的小分子单链非编码RNA，长约21～25个核苷酸，可以通过形成RNA诱导沉默复合体（RISC）与靶基因完全或不完全互补结合[7-9]，诱导靶mRNA的裂解或抑制蛋白翻译来调控靶基因的表达[10-11]，也可以作为癌基因或抑癌基因参与恶性肿瘤的发生与演进[12-13]。miR-196是位于Hox基因家族上游的一类微小RNA，对Hox基因家族中多数成员的表达情况具有负向调控作用，且以对HoxB8的调控作用最为多见[3, 14-18]。研究发现miR-196在多种恶性肿瘤中表达升高：Bloomston等[19]发现，在胰腺癌患者组织中miR-196表达量较正常胰腺组织升高，且高表达miR-196时提示患者的预后差、生存期缩短；Liao等[20]利用qRT-PCR方法检测63例胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中的miR-196表达，发现miR-196在胃癌组织中呈高表达，这一结果在Tsai等[21]的研究中也获得了认可；Schimanski等[3]在对结肠癌和正常结肠黏膜进行定量PCR测定后发现，在结肠癌组织中，miR-196的表达水平亦有上调，而在相应的正常结肠黏膜中表达较低。在笔者研究小组的前期研究[22]发现，在30例术前未接受化疗的结直肠癌患者切除的新鲜癌组织标本中miR-196的表达水平亦较正常黏膜中的表达水平升高（P＜0.05），与上述文献报道结果相符。有研究还发现，一些化疗药物如5-FU或奥沙利铂等可以改变大肠癌细胞中miRNAs分子表达水平，提示miRNA可能作为化疗药物作用的新型靶点，为新型抗癌药物的开发提供新的策略和思路：Meng等[23]发现，在化疗药物的干预下，miRNA的表达谱会发生变化，进而提出将miRNA作为化疗药物疗效的预测指标；Schimanski等[3]的研究也进一步指出，高浓度的miR-196可以使结直肠癌细胞对于铂类药物的化疗敏感性升高。本研究结果提示：结直肠癌患者miR-196的表达水平在接受Folfox4方案化疗后下降，且对化疗的不同反应程度其表达水平有差异，敏感组中miR-196的表达水平较不敏感组为高，提示高表达的miR-196可以使患者对于Folfox4方案的化疗敏感性提高，这在一定程度上与Schimanski等[3]的研究结果相吻合。
HoxB8是同源盒基因家族成员之一，位于人类第17号染色体，是一个序列特异性转录因子，其编码的产物为DNA结合蛋白，在细胞的分化、发育和器官形成中发挥重要作用[24-25]。且有研究[26]表明，其在结直肠癌组织中相较正常黏膜呈高水平表达。笔者研究小组在前期细胞实验中发现（待发表）：HoxB8的差异表达与Folfox4方案化疗敏感性相关，且通过RNAi抑制HoxB8基因表达，能够显著提高结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性。由此笔者进一步对接受Folfox4方案化疗患者结直肠癌组织标本中HoxB8蛋白表达情况进行检测，结果发现，结直肠癌患者在接受Folfox4方案化疗干预后，HoxB8蛋白的表达阳性率降低，且对化疗的不同敏感度其表达阳性率也有差异，敏感组中HoxB8的表达阳性率低于不敏感组，这进一步表明了HoxB8的高表达可以降低Folfox4化疗的敏感性，与前期实验结果相吻合。
同时，本研究对miR-196和HoxB8表达水平的相关性进行了分析，发现无论是在直接手术组还是新辅助化疗组，miR-196和HoxB8的表达都存在负相关关系，进一步验证了两者之间具有调控关系，且在化疗药物干预后此调控作用依然存在。结合两者在化疗敏感组与不敏感组中的表达差异，笔者提出可以将miR-196和HoxB8在结直肠癌患者中的表达情况作为预测患者是否对Folfox4化疗方案敏感的指标，来预测化疗的反应性与毒性，通过检测这两个因子的表达水平来筛选能够从Folfox4化疗方案中获益的患者，开展个体化治疗；并且miR-196和HoxB8有望成为化疗药物作用的新型靶点，在药物研制上可以通过直接抑制HoxB8的表达来提高化疗药物的敏感性，或是对其上游的调控基因miR-196进行干预，间接改变HoxB8的表达来提高患者的化疗敏感性，为新型抗癌药物的研发提供新的策略和思路。由于本实验纳入的病例数有限，相关结果有待进一步的大宗病例的研究予以证实。
