引用本文： 王勇, 白洁, 匡立润, 刘金钢. Roux-en-Y胃旁路术对GK大鼠骨骼肌组织胰岛素抵抗影响的机制研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 162-167. doi: 10.7507/1007-9424.20140037 复制
肥胖和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐年递增，已成为现代公共卫生最大的威胁之一[1]。T2DM的主要病理、生理特征是胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗，后者是病态性肥胖患者T2DM以及其他很多并发病发生、发展过程中最为重要的促进因素[2]。胰岛素抵抗的靶器官主要为肝脏、骨骼肌和脂肪。脂肪是近年来的研究热点，但体质量指数（body mass index，BMI）较低的人也可存在胰岛素抵抗，所以脂肪学说并不能完全解释其机制。骨骼肌承担机体大部分葡萄糖的代谢，其细胞表面存在大量的胰岛素受体，而关于骨骼肌胰岛素抵抗的研究甚少。大型回顾性研究[3]显示，减重手术可降低98%的糖尿病患者的死亡率，其中胃旁路术是其最传统最常用的减重术式。目前临床及动物研究均证明，Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Ygastric bypass，RYGB）后早期体质量未发生明显改变时，研究对象的T2DM及胰岛素抵抗即得到显著改善[4-5]，多数观点认为这可能与术后胃肠激素改变相关[6-7]，其中ghrelin作为一种可以调节摄食的脑肠肽，其术后改变及作用颇具争议[8-9]。本研究拟通过检测RYGB术后Goto-Kakizaki大鼠（GK大鼠，一种自发性T2DM在生长早期即发育为T2DM）血浆ghrelin及骨骼肌组织胰岛素受体后信号通路关键因子的改变来探寻RYGB治疗T2DM的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
8周龄雄性GK大鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；同周龄雄性Wistar大鼠10只，购自中国医科大学盛京医院实验动物中心。所有实验动物适应性喂养7 d后开始实验。饲养环境：单笼饲养，标准大鼠饲料喂养，自然昼夜循环，室温（18±2）℃，湿度（50±2）%。GK大鼠30只空腹血糖均高于7.5 mmol/L，完全随机平均分为3组：GK-RYGB组、GK-假手术组和GK-对照组；10只Wistar大鼠作为正常对照组。
1.2 手术干预
①GK-RYGB组：GK大鼠10只，行RYGB。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹膜内注射麻醉，四肢固定于操作台。腹部碘伏消毒，取上腹部正中切口约4 cm入腹，保留胃底约20%处将胃横断，远端胃断端连续内翻缝合。距Treize韧带约10 cm处切断空肠，远端空肠袢经结肠前上提与残胃吻合，近端空肠袢在距胃空肠吻合口约10 cm处和远端空肠行端侧吻合。吻合均用6-0无损伤线。②GK-假手术组：GK大鼠10只，麻醉方法及切口同GK-RYGB组。手术方式为胃前壁切开再缝合、空肠相应位置切断后原位吻合，缝合方法同GK-RYGB组，手术未改变胃肠道正常解剖位置，控制手术时间与GK-RYGB组大致相等。③GK-对照组：GK大鼠10只，无特殊处理。④正常对照组：Wistar大鼠10只，无特殊处理。
1.3 围手术期处理
术前12 h禁食，2 h禁水。关腹前青霉素（8×104 U/100 g体质量）腹腔内注射，术后48 h内进流食（10%葡萄糖），48 h后随意进水及标准饲料。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血浆ghrelin浓度测定
术后28 d时处死所有实验动物，立即下腔静脉采血，加入到已肝素化的离心管抗凝后于4℃3 000 r/min（r=15 cm）离心10 min，取血浆于-80℃冰箱冻存，采用ELISA法（R & D公司，美国）测定血浆ghrelin浓度。
1.4.2 Western blot法检测骨骼肌组织中磷酸化（p）-PI3Kp85α、总（t）-PI3Kp85α、p-Akt/PKB、t-Akt/PKB、膜（m）-GLUT4及t-GLUT4蛋白表达
术后28 d时处死实验动物后取双侧腓肠肌组织于-80℃冰箱冻存。取100 mg骨骼肌组织置于培养皿中，剪切成约1 mm×1 mm的碎片，采用RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司，中国）予以提取全蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。后经跨膜蛋白抽提试剂（Merck公司，美国）提取膜蛋白，10% SDS凝胶分离蛋白并转膜至PVDF膜（碧云天生物技术有限公司，中国），10%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入1：200一抗稀释液（Santa Cruz公司，美国）：羊抗兔p-PI3Kp85α抗体、羊抗兔PI3Kp85α抗体、兔抗羊p-Akt/PKB抗体、兔抗羊Akt/PKB抗体、兔抗羊m-GLUT4抗体、兔抗羊GLUT4抗体孵育过夜。再加入1：5 000二抗稀释液（Santa Cruz公司，美国）：辣根酶标记的羊抗兔IgG抗体、兔抗羊IgG抗体孵育2 h，ECL显色，用Quantity One软件（FUJI film公司，美国）对条带进行灰度分析，将磷酸化蛋白或膜蛋白条带与同一指标的总蛋白条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。
1.4.3 实时定量PCR法测骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达
采用iQ5 Real-Time PCR分析系统（Bio-Rad公司，美国）检测骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达。取总RNA反转录模板1μg用以逆转录合成cDNA，反应条件：37℃15 min，85℃5 s。PI3Kp85α上游引物为5′-AGATGCTTTCAAACGCTA-T-3′，下游引物为5′-TGGCTGTCGCTCACTC-3′，片段长度为361 bp；Akt/PKB上游引物为5′-TTTATT-GGCTACAAGGAACG-3′，下游引物为5′-GTCTGA-ATGGCGGTGGT-3′，片段长度为212 bp；GLUT4上游引物为5′-ACCCTCACTACCCTTTGG-3′，下游引物为5′-GAGGAACCGTCCGAGAA-3′，片段长度为207 bp；β-actin上游引物为5′-ACCAACTGGGAC-G-3′，下游引物为5' -AGGCATACAGGGAC-3′，片段长度为205 bp。扩增反应条件：预变性50℃2 min，95℃2 min，然后95℃15 s，55℃30 s，60℃30 s，40个循环。以β-actin基因mRNA表达为内参照，按公式△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。以实验组目的基因表达相对于正常对照组及GK-对照组的变化倍数为结果。
1.5 统计学方法
使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组血浆ghrelin浓度检测结果
血浆ghrelin浓度在GK-对照组为（7.65±0.68）μg/L，GK-假手术组为（6.57±0.88）μg/L，GK-RYGB组为（17.61±1.45）μg/L，正常对照组为（16.55±0.68）μg/L。血浆ghrelin浓度在正常对照组明显高于GK-对照组（P < 0.01）和GK-假手术组（P < 0.01）；GK-RYGB组也明显高于GK-对照组（P < 0.01）及GK-假手术组（P < 0.01），但与正常对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4的蛋白相对表达量
各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表达的定性结果见图 1A。
图1
各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表达结果。1A：定性结果；1B：p-/t-PI3Kp85α的定量结果；1C：p-/t-Akt/PKB的定量结果；1D：m-/t-GLUT4的定量结果。1：正常对照组；2：GK-对照组；3：GK-假手术组；4：GK-RYGB组。与GK-对照组、GK-假手术组比较，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure1.
Expessions of p-/t-PI3Kp85α, p-/t-Akt/PKB, and m-/t-GLUT4 in skeletal muscle tissue of each group rats. 1A:Qualitative result; 1B:Quantitative result of p-/t-PI3Kp85α; 1C:Quantitative result of p-/t-Akt/PKB; 1D:Quantitative result of m-/t-GLUT4. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.2.1 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α蛋白
相对表达量 正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.699倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.584倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的2.500倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.393倍（P < 0.01）。见图 1B。
2.2.2 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-Akt/AKB蛋白相对表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.683倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.606倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的1.617倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.543倍（P < 0.05）。见图 1C。
2.2.3 各组大鼠骨骼肌组织中m-/t-GLUT4蛋白相对表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.983倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.739倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的2.860倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.626倍（P < 0.01）。见图 1D。
2.3 各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB、GLU-T4 mRNA的表达结果
2.3.1 各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85αmRNA达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.618倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.494倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别为GK-对照组的2.445倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.329倍（P < 0.01）。见图 2A。
图2
各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达结果。2A：PI3Kp85αmRNA；2B：Akt/PKB mRNA；2C：GLUT4 mRNA。1：正常对照组；2：GK-对照组；3：GK-假手术组；4：GK-RYGB组。与GK-对照组、GK-假手术组比较，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure2.
mRNA expessions of PI3Kp85α, Akt/PKB, and GLUT4 in skeletal muscle tissues of each group rats. 2A:PI3Kp85αmRNA; 2B:Akt/PKB mRNA; 2C:GLUT4 mRNA. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.3.2 各组大鼠骨骼肌组织中Akt/PKB mRNA表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.727倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.689倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组亦明显上升，分别为GK-对照组的1.601倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.566倍（P < 0.05）。见图 2B。
2.3.3 各组大鼠骨骼肌组织中GLUT4 mRNA表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.567倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.545倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的1.436倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.416倍（P < 0.05）。见图 2C。
3 讨论
临床研究[10]证明，RYGB术后3 d血糖和胰岛素水平显著下降，同时胰岛素抵抗得到改善，多数患者无需再服用抗糖尿病药物血糖即可维持于正常水平，而此时体重并未发生明显下降[4, 11]，说明在此阶段体重下降并不是胰岛素抵抗改善的主要原因。
饮食摄入的葡萄糖主要由骨骼肌代谢，所以骨骼肌胰岛素抵抗对于整个机体胰岛素抵抗的发生、发展必然具有十分重要的作用。目前普遍认为，RYGB术后早期胰岛素抵抗得到改善与胃肠道激素的改变关系密切[12-13]，其中之一ghrelin主要由胃分泌，在小肠、下丘脑、胰岛细胞等多种组织中均有表达。最初对ghrelin的研究[14]认为，它能够增加食物摄入并导致肥胖，但是在转基因[15]和敲除模型[16]中ghrelin关于摄食和体质量的数据却相反，这使得内源性ghrelin的作用还难以界定。最近的研究[17-18]证明，ghrelin有广泛的生理作用，对肿瘤、炎症等病理过程的发生、发展产生积极影响。在炎症早期，ghrelin浓度呈反应性升高[19]，并且ghrelin能够抑制炎症反应[20]及致炎因子的释放[21]。研究[22]证明，机体ghrelin浓度在胰岛素抵抗状态下显著降低。本研究中同样发现患T2DM大鼠的血浆ghrelin浓度较低，在RYGB术后血浆ghrelin浓度显著升高甚至基本达到正常水平，这和我们前期实验所观察到的术后血糖等T2DM相关指标、胰岛素抵抗的改善呈同一趋势。因此，我们认为ghrelin的抗炎症作用可能对术后胰岛素抵抗的改善起至关重要的作用。
PI3K-Akt/PKB通路是胰岛素抵抗时主要受影响的信号通路[23]。PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110组成，一般检测磷酸化的p85α来反映其活性程度，Akt/PKB在PI3K的刺激下发生磷酸化，随后具有活性的p-Akt/PKB释放入细胞浆，在细胞内引起一系列级联反应最终将信号传导给葡萄糖转运的靶分子GLUT4 [24]，PI3K和Akt/PKB缺失均可导致不同程度的胰岛素抵抗，所以胰岛素抵抗也可以视为胰岛素信号通路传导障碍。GLUT4是骨骼肌主要的葡萄糖转运蛋白，无刺激时主要位于细胞内的储存囊泡内，当GLUT4接收到上述通路传导的信号刺激后转位至细胞膜，与葡萄糖结合，将葡萄糖转运至细胞内，胰岛素抵抗时GLUT4在骨骼肌细胞的转位减少、活性降低[25]。本研究结果发现，GK-假手术组及GK-对照组T2DM大鼠骨骼肌组织的p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白相对表达量及以上3个指标的mRNA的表达均显著低于正常大鼠及接受胃转流手术后大鼠，验证了T2DM所引起的胰岛素抵抗确实降低PI3K-Akt/PKB通路信号和GLUT4的活性以及减少GLUT4向细胞膜的转位，从而减少骨骼肌对葡萄糖的代谢；RYGB术后p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白及PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达较GK-对照组及GK-假手术组均显著上升，说明RYGB通过增加以上分子的转录和表达改善了胰岛素信号通路及GLUT4的转位和活性，这可能是RYGB改善骨骼肌胰岛素抵抗的主要机制之一。
综上所述，本研究结果初步认为，RYGB对T2DM是一种有效的治疗方式，能够改善机体的胰岛素抵抗状态，其具体机制可能是手术通过提升血浆ghrelin浓度抑制了机体的炎症反应，从而上调了主要靶器官骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB和GLUT4的转录和表达，并增加GLUT4向细胞膜转位及其总活性，最终引起骨骼肌组织摄取葡萄糖增加，机体血糖恢复正常，但该机制仍需要后续的细胞学实验来进一步验证。
肥胖和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的发病率逐年递增，已成为现代公共卫生最大的威胁之一[1]。T2DM的主要病理、生理特征是胰岛β细胞功能受损和胰岛素抵抗，后者是病态性肥胖患者T2DM以及其他很多并发病发生、发展过程中最为重要的促进因素[2]。胰岛素抵抗的靶器官主要为肝脏、骨骼肌和脂肪。脂肪是近年来的研究热点，但体质量指数（body mass index，BMI）较低的人也可存在胰岛素抵抗，所以脂肪学说并不能完全解释其机制。骨骼肌承担机体大部分葡萄糖的代谢，其细胞表面存在大量的胰岛素受体，而关于骨骼肌胰岛素抵抗的研究甚少。大型回顾性研究[3]显示，减重手术可降低98%的糖尿病患者的死亡率，其中胃旁路术是其最传统最常用的减重术式。目前临床及动物研究均证明，Roux-en-Y胃旁路术（Roux-en-Ygastric bypass，RYGB）后早期体质量未发生明显改变时，研究对象的T2DM及胰岛素抵抗即得到显著改善[4-5]，多数观点认为这可能与术后胃肠激素改变相关[6-7]，其中ghrelin作为一种可以调节摄食的脑肠肽，其术后改变及作用颇具争议[8-9]。本研究拟通过检测RYGB术后Goto-Kakizaki大鼠（GK大鼠，一种自发性T2DM在生长早期即发育为T2DM）血浆ghrelin及骨骼肌组织胰岛素受体后信号通路关键因子的改变来探寻RYGB治疗T2DM的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
8周龄雄性GK大鼠30只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司；同周龄雄性Wistar大鼠10只，购自中国医科大学盛京医院实验动物中心。所有实验动物适应性喂养7 d后开始实验。饲养环境：单笼饲养，标准大鼠饲料喂养，自然昼夜循环，室温（18±2）℃，湿度（50±2）%。GK大鼠30只空腹血糖均高于7.5 mmol/L，完全随机平均分为3组：GK-RYGB组、GK-假手术组和GK-对照组；10只Wistar大鼠作为正常对照组。
1.2 手术干预
①GK-RYGB组：GK大鼠10只，行RYGB。10%水合氯醛（300 mg/kg）腹膜内注射麻醉，四肢固定于操作台。腹部碘伏消毒，取上腹部正中切口约4 cm入腹，保留胃底约20%处将胃横断，远端胃断端连续内翻缝合。距Treize韧带约10 cm处切断空肠，远端空肠袢经结肠前上提与残胃吻合，近端空肠袢在距胃空肠吻合口约10 cm处和远端空肠行端侧吻合。吻合均用6-0无损伤线。②GK-假手术组：GK大鼠10只，麻醉方法及切口同GK-RYGB组。手术方式为胃前壁切开再缝合、空肠相应位置切断后原位吻合，缝合方法同GK-RYGB组，手术未改变胃肠道正常解剖位置，控制手术时间与GK-RYGB组大致相等。③GK-对照组：GK大鼠10只，无特殊处理。④正常对照组：Wistar大鼠10只，无特殊处理。
1.3 围手术期处理
术前12 h禁食，2 h禁水。关腹前青霉素（8×104 U/100 g体质量）腹腔内注射，术后48 h内进流食（10%葡萄糖），48 h后随意进水及标准饲料。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血浆ghrelin浓度测定
术后28 d时处死所有实验动物，立即下腔静脉采血，加入到已肝素化的离心管抗凝后于4℃3 000 r/min（r=15 cm）离心10 min，取血浆于-80℃冰箱冻存，采用ELISA法（R & D公司，美国）测定血浆ghrelin浓度。
1.4.2 Western blot法检测骨骼肌组织中磷酸化（p）-PI3Kp85α、总（t）-PI3Kp85α、p-Akt/PKB、t-Akt/PKB、膜（m）-GLUT4及t-GLUT4蛋白表达
术后28 d时处死实验动物后取双侧腓肠肌组织于-80℃冰箱冻存。取100 mg骨骼肌组织置于培养皿中，剪切成约1 mm×1 mm的碎片，采用RIPA裂解液（碧云天生物技术有限公司，中国）予以提取全蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。后经跨膜蛋白抽提试剂（Merck公司，美国）提取膜蛋白，10% SDS凝胶分离蛋白并转膜至PVDF膜（碧云天生物技术有限公司，中国），10%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入1：200一抗稀释液（Santa Cruz公司，美国）：羊抗兔p-PI3Kp85α抗体、羊抗兔PI3Kp85α抗体、兔抗羊p-Akt/PKB抗体、兔抗羊Akt/PKB抗体、兔抗羊m-GLUT4抗体、兔抗羊GLUT4抗体孵育过夜。再加入1：5 000二抗稀释液（Santa Cruz公司，美国）：辣根酶标记的羊抗兔IgG抗体、兔抗羊IgG抗体孵育2 h，ECL显色，用Quantity One软件（FUJI film公司，美国）对条带进行灰度分析，将磷酸化蛋白或膜蛋白条带与同一指标的总蛋白条带的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。
1.4.3 实时定量PCR法测骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达
采用iQ5 Real-Time PCR分析系统（Bio-Rad公司，美国）检测骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达。取总RNA反转录模板1μg用以逆转录合成cDNA，反应条件：37℃15 min，85℃5 s。PI3Kp85α上游引物为5′-AGATGCTTTCAAACGCTA-T-3′，下游引物为5′-TGGCTGTCGCTCACTC-3′，片段长度为361 bp；Akt/PKB上游引物为5′-TTTATT-GGCTACAAGGAACG-3′，下游引物为5′-GTCTGA-ATGGCGGTGGT-3′，片段长度为212 bp；GLUT4上游引物为5′-ACCCTCACTACCCTTTGG-3′，下游引物为5′-GAGGAACCGTCCGAGAA-3′，片段长度为207 bp；β-actin上游引物为5′-ACCAACTGGGAC-G-3′，下游引物为5' -AGGCATACAGGGAC-3′，片段长度为205 bp。扩增反应条件：预变性50℃2 min，95℃2 min，然后95℃15 s，55℃30 s，60℃30 s，40个循环。以β-actin基因mRNA表达为内参照，按公式△Ct=Ct目的基因-Ct内参基因。以实验组目的基因表达相对于正常对照组及GK-对照组的变化倍数为结果。
1.5 统计学方法
使用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组血浆ghrelin浓度检测结果
血浆ghrelin浓度在GK-对照组为（7.65±0.68）μg/L，GK-假手术组为（6.57±0.88）μg/L，GK-RYGB组为（17.61±1.45）μg/L，正常对照组为（16.55±0.68）μg/L。血浆ghrelin浓度在正常对照组明显高于GK-对照组（P < 0.01）和GK-假手术组（P < 0.01）；GK-RYGB组也明显高于GK-对照组（P < 0.01）及GK-假手术组（P < 0.01），但与正常对照组相比差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.2 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4的蛋白相对表达量
各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表达的定性结果见图 1A。
图1
各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白表达结果。1A：定性结果；1B：p-/t-PI3Kp85α的定量结果；1C：p-/t-Akt/PKB的定量结果；1D：m-/t-GLUT4的定量结果。1：正常对照组；2：GK-对照组；3：GK-假手术组；4：GK-RYGB组。与GK-对照组、GK-假手术组比较，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure1.
Expessions of p-/t-PI3Kp85α, p-/t-Akt/PKB, and m-/t-GLUT4 in skeletal muscle tissue of each group rats. 1A:Qualitative result; 1B:Quantitative result of p-/t-PI3Kp85α; 1C:Quantitative result of p-/t-Akt/PKB; 1D:Quantitative result of m-/t-GLUT4. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.2.1 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-PI3Kp85α蛋白
相对表达量 正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.699倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.584倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的2.500倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.393倍（P < 0.01）。见图 1B。
2.2.2 各组大鼠骨骼肌组织中p-/t-Akt/AKB蛋白相对表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.683倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.606倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的1.617倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.543倍（P < 0.05）。见图 1C。
2.2.3 各组大鼠骨骼肌组织中m-/t-GLUT4蛋白相对表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.983倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.739倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的2.860倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.626倍（P < 0.01）。见图 1D。
2.3 各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB、GLU-T4 mRNA的表达结果
2.3.1 各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85αmRNA达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的2.618倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.494倍（P < 0.01）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别为GK-对照组的2.445倍（P < 0.01）、GK-假手术组的2.329倍（P < 0.01）。见图 2A。
图2
各组大鼠骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达结果。2A：PI3Kp85αmRNA；2B：Akt/PKB mRNA；2C：GLUT4 mRNA。1：正常对照组；2：GK-对照组；3：GK-假手术组；4：GK-RYGB组。与GK-对照组、GK-假手术组比较，* P < 0.05，** P < 0.01
Figure2.
mRNA expessions of PI3Kp85α, Akt/PKB, and GLUT4 in skeletal muscle tissues of each group rats. 2A:PI3Kp85αmRNA; 2B:Akt/PKB mRNA; 2C:GLUT4 mRNA. 1:Normal control group; 2:GK-control group; 3:GK-SO group; 4:GK-RYGB group. Compared with GK-control group and GK-SO group, * P < 0.05, ** P < 0.01
2.3.2 各组大鼠骨骼肌组织中Akt/PKB mRNA表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.727倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.689倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组亦明显上升，分别为GK-对照组的1.601倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.566倍（P < 0.05）。见图 2B。
2.3.3 各组大鼠骨骼肌组织中GLUT4 mRNA表达量
正常对照组较GK-对照组和GK-假手术组明显上升，分别是GK-对照组的1.567倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.545倍（P < 0.05）；GK-RYGB组较GK-对照组和GK-假手术组也明显上升，分别是GK-对照组的1.436倍（P < 0.05）、GK-假手术组的1.416倍（P < 0.05）。见图 2C。
3 讨论
临床研究[10]证明，RYGB术后3 d血糖和胰岛素水平显著下降，同时胰岛素抵抗得到改善，多数患者无需再服用抗糖尿病药物血糖即可维持于正常水平，而此时体重并未发生明显下降[4, 11]，说明在此阶段体重下降并不是胰岛素抵抗改善的主要原因。
饮食摄入的葡萄糖主要由骨骼肌代谢，所以骨骼肌胰岛素抵抗对于整个机体胰岛素抵抗的发生、发展必然具有十分重要的作用。目前普遍认为，RYGB术后早期胰岛素抵抗得到改善与胃肠道激素的改变关系密切[12-13]，其中之一ghrelin主要由胃分泌，在小肠、下丘脑、胰岛细胞等多种组织中均有表达。最初对ghrelin的研究[14]认为，它能够增加食物摄入并导致肥胖，但是在转基因[15]和敲除模型[16]中ghrelin关于摄食和体质量的数据却相反，这使得内源性ghrelin的作用还难以界定。最近的研究[17-18]证明，ghrelin有广泛的生理作用，对肿瘤、炎症等病理过程的发生、发展产生积极影响。在炎症早期，ghrelin浓度呈反应性升高[19]，并且ghrelin能够抑制炎症反应[20]及致炎因子的释放[21]。研究[22]证明，机体ghrelin浓度在胰岛素抵抗状态下显著降低。本研究中同样发现患T2DM大鼠的血浆ghrelin浓度较低，在RYGB术后血浆ghrelin浓度显著升高甚至基本达到正常水平，这和我们前期实验所观察到的术后血糖等T2DM相关指标、胰岛素抵抗的改善呈同一趋势。因此，我们认为ghrelin的抗炎症作用可能对术后胰岛素抵抗的改善起至关重要的作用。
PI3K-Akt/PKB通路是胰岛素抵抗时主要受影响的信号通路[23]。PI3K由调节亚基p85和催化亚基p110组成，一般检测磷酸化的p85α来反映其活性程度，Akt/PKB在PI3K的刺激下发生磷酸化，随后具有活性的p-Akt/PKB释放入细胞浆，在细胞内引起一系列级联反应最终将信号传导给葡萄糖转运的靶分子GLUT4 [24]，PI3K和Akt/PKB缺失均可导致不同程度的胰岛素抵抗，所以胰岛素抵抗也可以视为胰岛素信号通路传导障碍。GLUT4是骨骼肌主要的葡萄糖转运蛋白，无刺激时主要位于细胞内的储存囊泡内，当GLUT4接收到上述通路传导的信号刺激后转位至细胞膜，与葡萄糖结合，将葡萄糖转运至细胞内，胰岛素抵抗时GLUT4在骨骼肌细胞的转位减少、活性降低[25]。本研究结果发现，GK-假手术组及GK-对照组T2DM大鼠骨骼肌组织的p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白相对表达量及以上3个指标的mRNA的表达均显著低于正常大鼠及接受胃转流手术后大鼠，验证了T2DM所引起的胰岛素抵抗确实降低PI3K-Akt/PKB通路信号和GLUT4的活性以及减少GLUT4向细胞膜的转位，从而减少骨骼肌对葡萄糖的代谢；RYGB术后p-/t-PI3Kp85α、p-/t-Akt/PKB及m-/t-GLUT4蛋白及PI3Kp85α、Akt/PKB及GLUT4 mRNA的表达较GK-对照组及GK-假手术组均显著上升，说明RYGB通过增加以上分子的转录和表达改善了胰岛素信号通路及GLUT4的转位和活性，这可能是RYGB改善骨骼肌胰岛素抵抗的主要机制之一。
综上所述，本研究结果初步认为，RYGB对T2DM是一种有效的治疗方式，能够改善机体的胰岛素抵抗状态，其具体机制可能是手术通过提升血浆ghrelin浓度抑制了机体的炎症反应，从而上调了主要靶器官骨骼肌组织中PI3Kp85α、Akt/PKB和GLUT4的转录和表达，并增加GLUT4向细胞膜转位及其总活性，最终引起骨骼肌组织摄取葡萄糖增加，机体血糖恢复正常，但该机制仍需要后续的细胞学实验来进一步验证。
