引用本文： 徐兴伟, 丁博文, 朱传荣, 郑鹏, 冯涛, 嵇武. miRNA-155/PU.1信号通路阻滞对大鼠骨髓来源树突状细胞成熟及移植免疫的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(2): 168-172. doi: 10.7507/1007-9424.20140039 复制
树突状细胞（DCs）作为主要抗原提呈细胞，刺激初始T淋巴细胞增殖，在调节适应性免疫反应中扮演重要的角色。研究[1]表明，DCs诱导或抑制免疫反应与细胞成熟度和细胞表面亚型的表达有关。未成熟DCs提呈抗原能力较弱，在于其低表达主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ类分子和共刺激分子，如CD80、CD86和CD40。DCs在成熟和发挥作用过程中，受到多种microRNA的调控，而其中miR-155对DCs的免疫反应有深远的影响，miR-155可以抑制DCs主要分子的表达，如抗原提呈、T淋巴细胞活化及组成T淋巴细胞介导的免疫应答抑制性通路。最近的研究[2]认为，PU.1是DCs的主要调控子，虽然大量的转录因子参与了特异DCs的分化，但已经证实PU.1是所有DCs亚群都必需的单个核心转录因子。因此在本研究中，我们使用小干扰RNA（siRNA）沉默miRNA-155/PU.1信号通路的关键转录因子PU.1表达，抑制大鼠骨髓DCs的成熟，得到一种相对稳定的半成熟DCs，探索它们的免疫耐受功能及对大鼠小肠移植的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
F344大鼠和Wistar大鼠，雄性，体质量180～220 g，均购自维通利华公司（北京，中国）。饲养在南京军区南京总医院比较医学科SPF环境。动物实验经南京军区南京总医院伦理委员会批准及监管。
1.2 主要材料与仪器
细胞培养基RPMI1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自北京全式金生物技术公司；重组粒-巨细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）及重组白细胞介素（IL）-4（rrIL-4）购自Peprotech公司；藻红蛋白（PE）标记的抗大鼠CD86、抗大鼠CD80和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗MHC-Ⅱ类购自eBioscience公司；Western blotting抗体（HRP标记的羊抗鼠和兔抗羊抗体）购自美国Santa Cruz公司；大鼠IL-12（IL-12p70）及IL-10购自RD公司；37 kBq [3H]胸腺嘧啶购自Woodbridge公司；S-3400N扫描电子显微镜（日立公司，日本）；FACSVantage流式细胞仪（Becton-Dickinson公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 骨髓来源未成熟DCs的体外培养
根据Lutz等[3]和Yang等[4]的方法进行改进，将处死的F344大鼠的股骨和胫骨在无菌条件下取出，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗骨髓腔3次得到骨髓细胞液。1 000×g离心5 min，用0.15 mol/L的NH4Cl洗涤2次去除红细胞。将收获的细胞按密度4×106个/mL培养在6孔板中，并加入含5 ng/mL rmGM-CSF、5 ng/mL rrIL-4和10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液。培养4 h后，除去非贴壁细胞继续培养。从第3 d起，隔天半换液。在第7 d，收获非贴壁和疏松附着的细胞即为未成熟DCs用于细胞转染。上清液用于后续细胞因子的鉴定。
1.3.2 脂质体法转染细胞
收获上述细胞，由上海吉玛公司设计含有特定目标的正义、反义序列的PU.1 siRNA。转染使用美国Invitrogen公司lipo2000瞬时转染24 h。筛选得到的高沉默效率PU.1特定的siRNA序列如下：正义链为5′-AGCGAUCACU-AUUGGGAUUTT-3′，反义链为5′-AAUCCCAAUA-GUGAUCGCUTT-3′；阴性对照siRNA序列如下：正义链为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染完成后将不同DCs与10μg/mL的LPS等密度共培养48 h。收集细胞和上清液备用。将DCs分为3组：PU.1沉默-LPS-DCs组（简称PU.1沉默组）、阴性对照-LPS-DCs组（简称阴性对照组）和未成熟即没有转染或其他处理DCs（简称对照组）。
1.3.3 Western blotting法检测转染效率
上述3组细胞在RIPA裂解缓冲液匀浆后用于蛋白质印迹检测。等量的蛋白提取物与SDS-缓冲液共煮沸5 min，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜。牛血清白蛋白室温下封闭1 h后，一抗4℃孵育过夜。第2 d继续羊抗兔二抗（1：2 000稀释）孵育。洗膜后使用ECL信号检测试剂盒（Amersham公司，美国）检测目的蛋白，与内参照进行灰度比较以半定量分析。
1.3.4 用流式细胞学方法检测DCs表面特异标志分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ
经过7 d培养制备的3组细胞，调整细胞浓度为2×106个/mL，加入1μg的MHC-Ⅱ、CD86及CD80分别染色，遮光4℃孵育30 min，洗涤后加入PBS，样品上机进行表型分析。观察各组细胞表面分子的表达情况。
1.3.5 混合淋巴细胞反应
参照文献[5]，密度梯度离心法得到大鼠同种异体脾脏T淋巴细胞（2×105个/孔）分别与3种实验细胞（2×104个/孔）按不同比率接种于96孔板。细胞培养3 d，最后18 h加入37 kBq [3H]胸腺嘧啶。随后将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，用液体闪烁计数器进行放射性定量。结果以[3H]胸腺嘧啶吸收量描述曲线。
1.3.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子IL-12p70和IL-10
取各组的细胞培养上清液测量细胞因子IL-12p70和IL-10，按试剂盒说明书操作。通过标准曲线计算各细胞因子浓度。
1.3.7 大鼠异位小肠移植模型建立和实验干预
健康F344和Wistar大鼠各18只分别作为供体和受体，SPF级雌雄不限，体质量220～280 g，平均248.4 g，6～7周龄，由南京军区南京总医院医学实验动物中心提供。用随机数字表法随机分为3组，每组6对行异位小肠移植。分别在小肠移植术前7 d经受体尾静脉注射3组细胞（PU.1沉默组、阴性对照组及对照组）。手术采用动脉吻合加静脉套管法进行大鼠异位小肠移植。术后5 d取近端空肠5 cm进行HE染色，并观察形态学变化。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计处理。计量数据采用均数±标准差表示，组内分析采用单向方差分析（ANOVA），检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PU.1沉默DCs的特性
阴性对照组CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达分别为（74.0±9.4）%、（76.5±8.7）%及（87.8±11.3）%，符合成熟DCs高表达特征[3]；对照组CD80、CD86及MHC-Ⅱ表达分别为（6.7±0.6）%、（7.4±1.8）%及（6.8±1.0）%，符合未成熟DCs的低表达特征；PU.1沉默组CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达分别为（27.0±5.6）%、（23.6±4.8）%及（36.8±6.8）%，均明显低于阴性对照组（P < 0.05）。
2.2 PU.1沉默DCs混合淋巴细胞反应结果
PU.1沉默组在刺激增殖T淋巴细胞的混合淋巴细胞反应中较阴性对照组明显降低（P < 0.05），与对照组类似，表明PU.1沉默DCs刺激T细胞增殖的能力受损，基本不具有这样的特性，见图 1。
图1
3组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力
Figure1.
Ability of DCs in each group suppress allogeneic T cell proli-feration
2.3 PU.1沉默DCs细胞因子的表达结果
3组DCs的细胞培养上清液中IL-12p70和IL-10的表达见表 1。作为对DCs成熟发挥重要功能的细胞因子IL-12p70促进DC成熟而IL-10则起抑制作用。代表成熟抑制的PU.1沉默组分泌IL-10较代表成熟的阴性对照组明显升高（P < 0.05），IL-12p70则明显降低（P < 0.05）。对照组细胞虽和PU.1沉默组相比未达到统计学差异，也表现出轻度成熟抑制。说明细胞表面分子表达的差异决定了其功能的不同。
表1
3组细胞因子的表达（ng/L，2.4 PU.1沉默的DCs延长移植物功能
3组细胞注入待小肠移植的受体后，受体存活时间阴性对照组为（7.8±1.5）d，对照组为（8.0±2.5）d，PU.1沉默组为（14.3±3.3）d，PU.1沉默组的生存时间明显长于阴性对照组（P < 0.05）和对照组（P < 0.05）。移植小肠的HE染色结果显示，PU.1沉默组术后5 d时移植物病理显示移植肠组织轻度淋巴细胞浸润和绒毛水肿（图 2A），而阴性对照组和对照组未成熟DCs均有炎症细胞浸润，少部分绒毛融合、脱落及缺损（图 2B、2C）。
图2
各组受体大鼠移植小肠病理表现（HE ×100）。2A：PU.1沉默组；2B：阴性对照组；2C：对照组
Figure2.
Histopathology of intestinal allograft from recipient rats in each group (HE ×100). 2A:PU.1 silent group; 2B:Negative control group; 2C:Control group
3 讨论
近年来，越来越多的研究关注器官移植中固有免疫系统对适应性免疫的作用。已有研究表明，输注供者未成熟DCs可以延长移植物存活时间[6]，主要在于它们能通过诱导T淋巴细胞无反应性或凋亡介导免疫耐受[7-8]。器官移植后，最常见的急性排斥反应主要由T淋巴细胞介导，而它们需要抗原提呈细胞提呈第一、第二活化信号才能激活，从而发挥免疫作用。未成熟DCs低表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子，阻断幼稚T淋巴细胞的信号提呈，导致调节适应性免疫不能激活。然而他们并不稳定，可以通过多条信号通路很容易地转变成成熟DCs，因此限制了这类细胞的保存和利用[9]。Yang等[4]发现，通过沉默核因子（NF）-κB信号通路中的MyD88，可以有效干扰未成熟DCs的成熟，增加免疫抑制型细胞因子IL-10的分泌，并降低IL-12p70。本实验经检测，代表成熟抑制的PU.1沉默组DCs较阴性对照组中成熟的DCs分泌IL-10明显升高，表明PU.1基因的沉默阻止了DCs的成熟路径。IL-10又称细胞因子分泌抑制因子，是体内重要的免疫负调控分子，可通过下调主要组织相容性抗原、共刺激分子、抑制多种炎性细胞因子的分泌而诱导DCs耐受及诱导调节性T淋巴细胞的生成，直接或间接抑制异基因淋巴细胞的活化[9]。而IL-12p70是活化T淋巴细胞的重要信号，也是T淋巴细胞活化的标志。NF-κB信号通路在DCs成熟中起关键的作用，IL-10可以表达协同刺激分子B7-H，下调一系列炎性细胞因子的合成，并抑制同种异体T淋巴细胞增殖。因此，这些研究提示我们，沉默DCs成熟信号通路中的关键因子可能有助于获得期待的免疫抑制功能和更好的稳定性。
miRNA-155在免疫反应中是一个重要的调节因子[10]。miRNA-155基因敲除的小鼠表现出异常的免疫功能，包括有缺陷的B和T淋巴细胞功能、免疫异常的抗原提呈细胞以及高亲和力的IgG1抗体的生成缺陷[11-12]，这些都与作用于3′-非编码区的转录因子PU.1有关[13-14]。PU.1在cDC和pDC谱系都是必不可少的调节因子，它可以调节髓系和淋巴系的大多数基因[15]。最近的研究[16-17]还表明，PU.1部分调控细胞因子受体FLT3，并能通过DC-SIGN的调节参与DCs的成熟。因此，PU.1在DCs成熟中是一个关键调控因子[16, 18]，选择该基因作为目的沉默基因可能使细胞成熟抑制[19]。我们通过siRNA沉默基因，并与LPS共培养后，得到的这种DCs具有体内外免疫抑制的效果。这类半成熟DCs更稳定，能更大程度减少小肠移植后的炎症反应和免疫反应。
在本实验中，受体小肠移植大鼠的术后存活时间和移植肠的病理学变化作为测试PU.1沉默的DCs体内免疫抑制功能指标，与另两组相比，PU.1沉默组大鼠移植小肠的排斥反应有明显缓解，且整体生存时间延长和生存质量提高，这些结果和前期体外实验表现一致：增加IL-10和减少IL-12p70的分泌，表面分子CD86、CD80低表达和抑制T淋巴细胞增殖，表明体内实验延续了DCs成熟抑制的表现，克服了对照组DCs在体内易于受刺激而诱导成熟的缺点。IL-10的增加在未成熟DCs的功能表现中发挥核心作用[20]。既往研究[4]发现，未成熟DCs注入受体后血清中促炎症因子IL-2和干扰素-γ的水平明显降低，IL-10增高，减轻了受体对移植物的排斥反应，从而诱导免疫耐受。本实验中PU.1沉默的DCs在将细胞注入受体体内后，PU.1沉默的DCs具有明显的稳定性，得到更高的IL-10水平，继续保持其免疫抑制，而未成熟DCs则极易受刺激诱导，失去其原有特性。
本实验证实了PU.1基因沉默的DCs成熟度和诱导免疫功能均减弱，并延长了大鼠小肠移植受体的生存时间，改善了移植物的功能，这为移植免疫的研究提供了新思路。
树突状细胞（DCs）作为主要抗原提呈细胞，刺激初始T淋巴细胞增殖，在调节适应性免疫反应中扮演重要的角色。研究[1]表明，DCs诱导或抑制免疫反应与细胞成熟度和细胞表面亚型的表达有关。未成熟DCs提呈抗原能力较弱，在于其低表达主要组织相容性复合体（MHC）-Ⅱ类分子和共刺激分子，如CD80、CD86和CD40。DCs在成熟和发挥作用过程中，受到多种microRNA的调控，而其中miR-155对DCs的免疫反应有深远的影响，miR-155可以抑制DCs主要分子的表达，如抗原提呈、T淋巴细胞活化及组成T淋巴细胞介导的免疫应答抑制性通路。最近的研究[2]认为，PU.1是DCs的主要调控子，虽然大量的转录因子参与了特异DCs的分化，但已经证实PU.1是所有DCs亚群都必需的单个核心转录因子。因此在本研究中，我们使用小干扰RNA（siRNA）沉默miRNA-155/PU.1信号通路的关键转录因子PU.1表达，抑制大鼠骨髓DCs的成熟，得到一种相对稳定的半成熟DCs，探索它们的免疫耐受功能及对大鼠小肠移植的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
F344大鼠和Wistar大鼠，雄性，体质量180～220 g，均购自维通利华公司（北京，中国）。饲养在南京军区南京总医院比较医学科SPF环境。动物实验经南京军区南京总医院伦理委员会批准及监管。
1.2 主要材料与仪器
细胞培养基RPMI1640购自美国Gibco公司；胎牛血清购自北京全式金生物技术公司；重组粒-巨细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）及重组白细胞介素（IL）-4（rrIL-4）购自Peprotech公司；藻红蛋白（PE）标记的抗大鼠CD86、抗大鼠CD80和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗MHC-Ⅱ类购自eBioscience公司；Western blotting抗体（HRP标记的羊抗鼠和兔抗羊抗体）购自美国Santa Cruz公司；大鼠IL-12（IL-12p70）及IL-10购自RD公司；37 kBq [3H]胸腺嘧啶购自Woodbridge公司；S-3400N扫描电子显微镜（日立公司，日本）；FACSVantage流式细胞仪（Becton-Dickinson公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 骨髓来源未成熟DCs的体外培养
根据Lutz等[3]和Yang等[4]的方法进行改进，将处死的F344大鼠的股骨和胫骨在无菌条件下取出，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗骨髓腔3次得到骨髓细胞液。1 000×g离心5 min，用0.15 mol/L的NH4Cl洗涤2次去除红细胞。将收获的细胞按密度4×106个/mL培养在6孔板中，并加入含5 ng/mL rmGM-CSF、5 ng/mL rrIL-4和10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液。培养4 h后，除去非贴壁细胞继续培养。从第3 d起，隔天半换液。在第7 d，收获非贴壁和疏松附着的细胞即为未成熟DCs用于细胞转染。上清液用于后续细胞因子的鉴定。
1.3.2 脂质体法转染细胞
收获上述细胞，由上海吉玛公司设计含有特定目标的正义、反义序列的PU.1 siRNA。转染使用美国Invitrogen公司lipo2000瞬时转染24 h。筛选得到的高沉默效率PU.1特定的siRNA序列如下：正义链为5′-AGCGAUCACU-AUUGGGAUUTT-3′，反义链为5′-AAUCCCAAUA-GUGAUCGCUTT-3′；阴性对照siRNA序列如下：正义链为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染完成后将不同DCs与10μg/mL的LPS等密度共培养48 h。收集细胞和上清液备用。将DCs分为3组：PU.1沉默-LPS-DCs组（简称PU.1沉默组）、阴性对照-LPS-DCs组（简称阴性对照组）和未成熟即没有转染或其他处理DCs（简称对照组）。
1.3.3 Western blotting法检测转染效率
上述3组细胞在RIPA裂解缓冲液匀浆后用于蛋白质印迹检测。等量的蛋白提取物与SDS-缓冲液共煮沸5 min，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到硝酸纤维素膜。牛血清白蛋白室温下封闭1 h后，一抗4℃孵育过夜。第2 d继续羊抗兔二抗（1：2 000稀释）孵育。洗膜后使用ECL信号检测试剂盒（Amersham公司，美国）检测目的蛋白，与内参照进行灰度比较以半定量分析。
1.3.4 用流式细胞学方法检测DCs表面特异标志分子CD80、CD86和MHC-Ⅱ
经过7 d培养制备的3组细胞，调整细胞浓度为2×106个/mL，加入1μg的MHC-Ⅱ、CD86及CD80分别染色，遮光4℃孵育30 min，洗涤后加入PBS，样品上机进行表型分析。观察各组细胞表面分子的表达情况。
1.3.5 混合淋巴细胞反应
参照文献[5]，密度梯度离心法得到大鼠同种异体脾脏T淋巴细胞（2×105个/孔）分别与3种实验细胞（2×104个/孔）按不同比率接种于96孔板。细胞培养3 d，最后18 h加入37 kBq [3H]胸腺嘧啶。随后将细胞收获到玻璃纤维滤膜上，用液体闪烁计数器进行放射性定量。结果以[3H]胸腺嘧啶吸收量描述曲线。
1.3.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子IL-12p70和IL-10
取各组的细胞培养上清液测量细胞因子IL-12p70和IL-10，按试剂盒说明书操作。通过标准曲线计算各细胞因子浓度。
1.3.7 大鼠异位小肠移植模型建立和实验干预
健康F344和Wistar大鼠各18只分别作为供体和受体，SPF级雌雄不限，体质量220～280 g，平均248.4 g，6～7周龄，由南京军区南京总医院医学实验动物中心提供。用随机数字表法随机分为3组，每组6对行异位小肠移植。分别在小肠移植术前7 d经受体尾静脉注射3组细胞（PU.1沉默组、阴性对照组及对照组）。手术采用动脉吻合加静脉套管法进行大鼠异位小肠移植。术后5 d取近端空肠5 cm进行HE染色，并观察形态学变化。
1.4 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件对数据进行统计处理。计量数据采用均数±标准差表示，组内分析采用单向方差分析（ANOVA），检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 PU.1沉默DCs的特性
阴性对照组CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达分别为（74.0±9.4）%、（76.5±8.7）%及（87.8±11.3）%，符合成熟DCs高表达特征[3]；对照组CD80、CD86及MHC-Ⅱ表达分别为（6.7±0.6）%、（7.4±1.8）%及（6.8±1.0）%，符合未成熟DCs的低表达特征；PU.1沉默组CD80、CD86和MHC-Ⅱ表达分别为（27.0±5.6）%、（23.6±4.8）%及（36.8±6.8）%，均明显低于阴性对照组（P < 0.05）。
2.2 PU.1沉默DCs混合淋巴细胞反应结果
PU.1沉默组在刺激增殖T淋巴细胞的混合淋巴细胞反应中较阴性对照组明显降低（P < 0.05），与对照组类似，表明PU.1沉默DCs刺激T细胞增殖的能力受损，基本不具有这样的特性，见图 1。
图1
3组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力
Figure1.
Ability of DCs in each group suppress allogeneic T cell proli-feration
2.3 PU.1沉默DCs细胞因子的表达结果
3组DCs的细胞培养上清液中IL-12p70和IL-10的表达见表 1。作为对DCs成熟发挥重要功能的细胞因子IL-12p70促进DC成熟而IL-10则起抑制作用。代表成熟抑制的PU.1沉默组分泌IL-10较代表成熟的阴性对照组明显升高（P < 0.05），IL-12p70则明显降低（P < 0.05）。对照组细胞虽和PU.1沉默组相比未达到统计学差异，也表现出轻度成熟抑制。说明细胞表面分子表达的差异决定了其功能的不同。
表1
3组细胞因子的表达（ng/L，2.4 PU.1沉默的DCs延长移植物功能
3组细胞注入待小肠移植的受体后，受体存活时间阴性对照组为（7.8±1.5）d，对照组为（8.0±2.5）d，PU.1沉默组为（14.3±3.3）d，PU.1沉默组的生存时间明显长于阴性对照组（P < 0.05）和对照组（P < 0.05）。移植小肠的HE染色结果显示，PU.1沉默组术后5 d时移植物病理显示移植肠组织轻度淋巴细胞浸润和绒毛水肿（图 2A），而阴性对照组和对照组未成熟DCs均有炎症细胞浸润，少部分绒毛融合、脱落及缺损（图 2B、2C）。
图2
各组受体大鼠移植小肠病理表现（HE ×100）。2A：PU.1沉默组；2B：阴性对照组；2C：对照组
Figure2.
Histopathology of intestinal allograft from recipient rats in each group (HE ×100). 2A:PU.1 silent group; 2B:Negative control group; 2C:Control group
3 讨论
近年来，越来越多的研究关注器官移植中固有免疫系统对适应性免疫的作用。已有研究表明，输注供者未成熟DCs可以延长移植物存活时间[6]，主要在于它们能通过诱导T淋巴细胞无反应性或凋亡介导免疫耐受[7-8]。器官移植后，最常见的急性排斥反应主要由T淋巴细胞介导，而它们需要抗原提呈细胞提呈第一、第二活化信号才能激活，从而发挥免疫作用。未成熟DCs低表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子，阻断幼稚T淋巴细胞的信号提呈，导致调节适应性免疫不能激活。然而他们并不稳定，可以通过多条信号通路很容易地转变成成熟DCs，因此限制了这类细胞的保存和利用[9]。Yang等[4]发现，通过沉默核因子（NF）-κB信号通路中的MyD88，可以有效干扰未成熟DCs的成熟，增加免疫抑制型细胞因子IL-10的分泌，并降低IL-12p70。本实验经检测，代表成熟抑制的PU.1沉默组DCs较阴性对照组中成熟的DCs分泌IL-10明显升高，表明PU.1基因的沉默阻止了DCs的成熟路径。IL-10又称细胞因子分泌抑制因子，是体内重要的免疫负调控分子，可通过下调主要组织相容性抗原、共刺激分子、抑制多种炎性细胞因子的分泌而诱导DCs耐受及诱导调节性T淋巴细胞的生成，直接或间接抑制异基因淋巴细胞的活化[9]。而IL-12p70是活化T淋巴细胞的重要信号，也是T淋巴细胞活化的标志。NF-κB信号通路在DCs成熟中起关键的作用，IL-10可以表达协同刺激分子B7-H，下调一系列炎性细胞因子的合成，并抑制同种异体T淋巴细胞增殖。因此，这些研究提示我们，沉默DCs成熟信号通路中的关键因子可能有助于获得期待的免疫抑制功能和更好的稳定性。
miRNA-155在免疫反应中是一个重要的调节因子[10]。miRNA-155基因敲除的小鼠表现出异常的免疫功能，包括有缺陷的B和T淋巴细胞功能、免疫异常的抗原提呈细胞以及高亲和力的IgG1抗体的生成缺陷[11-12]，这些都与作用于3′-非编码区的转录因子PU.1有关[13-14]。PU.1在cDC和pDC谱系都是必不可少的调节因子，它可以调节髓系和淋巴系的大多数基因[15]。最近的研究[16-17]还表明，PU.1部分调控细胞因子受体FLT3，并能通过DC-SIGN的调节参与DCs的成熟。因此，PU.1在DCs成熟中是一个关键调控因子[16, 18]，选择该基因作为目的沉默基因可能使细胞成熟抑制[19]。我们通过siRNA沉默基因，并与LPS共培养后，得到的这种DCs具有体内外免疫抑制的效果。这类半成熟DCs更稳定，能更大程度减少小肠移植后的炎症反应和免疫反应。
在本实验中，受体小肠移植大鼠的术后存活时间和移植肠的病理学变化作为测试PU.1沉默的DCs体内免疫抑制功能指标，与另两组相比，PU.1沉默组大鼠移植小肠的排斥反应有明显缓解，且整体生存时间延长和生存质量提高，这些结果和前期体外实验表现一致：增加IL-10和减少IL-12p70的分泌，表面分子CD86、CD80低表达和抑制T淋巴细胞增殖，表明体内实验延续了DCs成熟抑制的表现，克服了对照组DCs在体内易于受刺激而诱导成熟的缺点。IL-10的增加在未成熟DCs的功能表现中发挥核心作用[20]。既往研究[4]发现，未成熟DCs注入受体后血清中促炎症因子IL-2和干扰素-γ的水平明显降低，IL-10增高，减轻了受体对移植物的排斥反应，从而诱导免疫耐受。本实验中PU.1沉默的DCs在将细胞注入受体体内后，PU.1沉默的DCs具有明显的稳定性，得到更高的IL-10水平，继续保持其免疫抑制，而未成熟DCs则极易受刺激诱导，失去其原有特性。
本实验证实了PU.1基因沉默的DCs成熟度和诱导免疫功能均减弱，并延长了大鼠小肠移植受体的生存时间，改善了移植物的功能，这为移植免疫的研究提供了新思路。
