引用本文： 张梦泽, 葛春林, 张雨京. MyD88在重症急性胰腺炎胰腺组织中表达及意义的实验研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(3): 345-348. doi: 10.7507/1007-9424.20140080 复制
Toll样受体（TLR）在胰腺炎发病机理中的作用已被承认[1]，但其下游蛋白即髓样细胞分化蛋白88（MyD88）对胰腺炎的作用尚不明确。Koike等[2]发现，无论是否诱导或诱导方法是什么，在小鼠胰腺组织中都有MyD88的表达。本实验通过构建重症急性胰腺炎（SAP）小鼠模型，检测其血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[3]等的浓度，同时检测胰腺组织中MyD88和核因子-κB（NF-κB）mRNA的表达水平，以探讨MyD88在SAP发病机理中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要试剂和设备
SPF级Bal b/c小鼠48只，雌雄各24只，6～8周龄，体质量22～26 g，由中国医科大学动物部提供。L-精氨酸（国药集团化学试剂有限公司），EILSA试剂盒（武汉博士德生物公司），逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（南京金斯瑞生物科技公司提供），酶标仪（SUNRISE，瑞士Tecan公司），TP800 RT-PCR仪（日本Takara公司）。
1.2 动物分组及模型制备
将48只小鼠按雌雄1︰1分开后，分别按随机数字表法随机分为SAP组（32只）与正常对照组（16只）；再将2组小鼠随机（随机数字表）分为6、12、24及48 h组，SAP组每个亚组8只，正常对照组每个亚组4只。SAP组小鼠采用腹腔注射20% L-精氨酸的方法构建SAP模型，剂量为3.5 mg/g，分2次注射，首次注射为实验当天上午8时，间隔1 h后注射第2次。正常对照组小鼠腹腔注射相等体积量的生理盐水。
1.3 标本取材
在相应时点以1.5%戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉成功后以腹主动脉取血方法[4]处死小鼠。常规消毒后沿腹正中线剖开腹腔，轻柔操作并暴露腹主动脉，术者右手持1 mL注射器，针尖斜面向下25°～30°于向心端刺入，缓慢抽吸腹主动脉血1 mL，离心（3 500 r/min，r=9.85 cm，8 min）后取血清分装，于-80℃条件下冻存。抽血后，SAP组于相应时点快速切取胰腺组织（约1 g）；正常对照组由于无明显变化，仅于建模后6 h取胰腺组织（约0.5 g），组织均于-80℃条件下冻存。
1.4 观察指标及检测方法
①采用ELISA方法检测外周血中的白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）及TNF-α浓度，操作均按试剂盒说明书进行。②采用RT-PCR技术检测胰腺组织中MyD88和NF-κB mRNA的表达。先采用Trizol一步法抽提组织中的总RNA，再用紫外分光光度仪测定A260 /A280（1.76～1.97），以琼脂糖凝胶电泳法检测28 s/18 s（1.69～1.96），结果基本符合要求。其他步骤严格按照试剂盒说明书进行。目的基因MyD88基因、NF-κB基因及内参β-actin基因的引物序列见表 1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用相对定量法，利用内参基因β-actin为参照计算目的基因的相对表达量。③胰腺组织以甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，3～4μm厚切片，行HE染色，在显微镜下（400倍）观察胰腺组织的病理学改变。
表1
RT-PCR的引物序列
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组小鼠胰腺组织的病理学改变
SAP组小鼠建模后，因小鼠体质较弱，于24 h时死亡1只，48 h时死亡1只。SAP各亚组小鼠处死后，大体可见腹腔脏器改变随时间推移由轻向重过渡，6 h时仅比正常对照组小鼠的胰腺略有增大；而发展至24 h后腹腔内可见大量淡红色液体，胰腺水肿坏死严重。显微镜下观察正常对照组小鼠的胰腺组织结构清晰，无炎症细胞浸润。SAP-6 h组小鼠的胰腺腺泡结构尚完整，小叶间隔清晰，与正常对照组比较差异不明显；12 h时表现为胰腺水肿、充血及炎症细胞浸润，小叶间隙略有增宽但结构完好；24 h时见胰腺小叶结构紊乱、水肿，周围脂肪组织明显充血、炎症细胞浸润；48 h时见腺泡肿胀，胰腺大片坏死，坏死区炎症细胞浸润，小叶缺失，部分腺泡呈孤岛状（图 1）。
图1
示SAP组和正常对照组小鼠胰腺组织的病理学检查结果（HE ×400）。1A：正常对照组；1B：SAP-12 h组；1C：SAP-48 h组
2.2 2组小鼠的血清IL-1β、IL-10及TNF-α浓度和胰腺组织MyD88及NF-κB mRNA的表达结果
各时点SAP组小鼠的IL-1β、IL-10及TNF-α浓度均高于正常对照组（P＜0.05）。各时点SAP组与正常对照组（6 h组）相比较，其胰腺组织中MyD88 mRNA及NF-κB mRNA的表达水平均较高（P＜0.05）。通过对6 h组和12 h组、12 h组和24 h组、24 h组和48 h组的比较发现：①正常对照组的IL-1β、IL-10及TNF-α浓度各时点均基本稳定，变化不大（P＞0.05）。②SAP各亚组的IL-1β和IL-10水平除12 h组与24 h组比较差异均有统计学意义外（P＜0.05），余均无明显差异（P＞0.05）；6 h组和12 h组、24 h组和48 h组的TNF-α浓度比较差异均有统计学意义（P＜0.05），12 h组与24 h组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3对组间比较，MyD88 mRNA表达水平的差异均有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表达水平除6 h组与12 h组比较差异有统计学意义外（P＜0.05），余均无明显差异（P＞0.05）。见表 2。
表2
2组小鼠各时点检测指标比较结果（2.3 MyD88 mRNA表达与其他指标的关系
将SAP组各亚组MyD88 mRNA的表达水平与IL-1β、IL-10、TNF-α的浓度以及NF-κB mRNA的表达水平进行相关性分析，结果发现，MyD88 mRNA的表达水平同其他指标均呈一致性同步变化，具有良好的相关性（P＜0.01）。见表 3。
表3
SAP组小鼠各时点MyD88 mRNA的表达水平与其他指标的相关性分析结果
3 讨论
近年来的研究[5-7]表明，抑制IL-1β、TNF-α、IL-10等炎症细胞因子的表达可以减轻胰腺炎的严重程度。国外研究[8-11]显示，TLR通路在急性胰腺炎的发病机理中发挥作用，与野生型小鼠相比，几乎所有的TLR缺陷小鼠，尤其是TLR4缺陷的小鼠，其胰腺炎的严重程度都明显减轻。TLR通路激活信号通过MyD88的传导，最终导致促炎细胞因子表达上调和多种机体防御蛋白的转录，如IL-1β、TNF-α等[12-13]。而作为TLR通路整体结构的“瓶颈”[14]——MyD88，对其在TLR通路中发挥的作用的具体研究较少。
本实验在总结了以往研究的基础上，检测了胰腺组织中MyD88 mRNA与NF-κB mRNA的表达水平及血清相关炎症因子的浓度，同时分析了MyD88 mRNA的表达水平与相关炎症因子在急性胰腺炎发展中的相关性。结果显示，在SAP组，12～24 h时IL-1β浓度增高（P＜0.05）；IL-10浓度在12 h时略微下降，24 h升高（P＜0.05）；TNF-α浓度在6～12 h以及24～48 h两个时段改变明显（P＜0.05）；MyD88 mRNA的表达水平在前3个时点随时间的增加而增高（P＜0.05），而在48 h有所下降（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表达水平在6～12 h时增高（P＜0.05），12 h后变动不明显，在24～48 h呈现一个平台期。病理学检查结果提示，前3个时点的病理损伤逐渐加重，在时间上，这与MyD88 mRNA的表达水平逐步升高基本一致。而由于病理损伤是一个渐变的过程，在48 h后由于损伤因素仍然存在，所以病理学改变会继续进展。MyD88 mRNA与NF-κB mRNA的表达水平及血清炎症因子（IL-1β、TNF-α及IL-10）的浓度在各个时点上都存在相关性（P＜0.01），提示MyD88 mRNA的表达水平高低可能影响了与胰腺炎炎症相关因子（NF-κB、IL-1β、TNF-α及IL-10）的表达与浓度，而这些因素的表达与浓度正是急性胰腺炎严重程度的决定因素。Neuhöfer等[15]的实验研究表明，对正常和抑制了NF-κB表达的小鼠分别建立L-精氨酸诱导的急性胰腺炎模型后，抑制了NF-κB表达的小鼠比正常小鼠其炎症因子（如IL-1β、TNF-α等）的表达水平低，这也间接证实了MyD88的作用。MyD88的变化影响了这些决定胰腺炎炎症发生和发展的因素，从而对胰腺炎的发生和发展发挥一定的作用。因此，在急性胰腺炎的治疗中可以以此为突破点，以控制炎症的进展。但本实验的观察时间尚较短，在48 h之后的情况需要进一步研究。
Toll样受体（TLR）在胰腺炎发病机理中的作用已被承认[1]，但其下游蛋白即髓样细胞分化蛋白88（MyD88）对胰腺炎的作用尚不明确。Koike等[2]发现，无论是否诱导或诱导方法是什么，在小鼠胰腺组织中都有MyD88的表达。本实验通过构建重症急性胰腺炎（SAP）小鼠模型，检测其血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）[3]等的浓度，同时检测胰腺组织中MyD88和核因子-κB（NF-κB）mRNA的表达水平，以探讨MyD88在SAP发病机理中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要试剂和设备
SPF级Bal b/c小鼠48只，雌雄各24只，6～8周龄，体质量22～26 g，由中国医科大学动物部提供。L-精氨酸（国药集团化学试剂有限公司），EILSA试剂盒（武汉博士德生物公司），逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（南京金斯瑞生物科技公司提供），酶标仪（SUNRISE，瑞士Tecan公司），TP800 RT-PCR仪（日本Takara公司）。
1.2 动物分组及模型制备
将48只小鼠按雌雄1︰1分开后，分别按随机数字表法随机分为SAP组（32只）与正常对照组（16只）；再将2组小鼠随机（随机数字表）分为6、12、24及48 h组，SAP组每个亚组8只，正常对照组每个亚组4只。SAP组小鼠采用腹腔注射20% L-精氨酸的方法构建SAP模型，剂量为3.5 mg/g，分2次注射，首次注射为实验当天上午8时，间隔1 h后注射第2次。正常对照组小鼠腹腔注射相等体积量的生理盐水。
1.3 标本取材
在相应时点以1.5%戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，麻醉成功后以腹主动脉取血方法[4]处死小鼠。常规消毒后沿腹正中线剖开腹腔，轻柔操作并暴露腹主动脉，术者右手持1 mL注射器，针尖斜面向下25°～30°于向心端刺入，缓慢抽吸腹主动脉血1 mL，离心（3 500 r/min，r=9.85 cm，8 min）后取血清分装，于-80℃条件下冻存。抽血后，SAP组于相应时点快速切取胰腺组织（约1 g）；正常对照组由于无明显变化，仅于建模后6 h取胰腺组织（约0.5 g），组织均于-80℃条件下冻存。
1.4 观察指标及检测方法
①采用ELISA方法检测外周血中的白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）及TNF-α浓度，操作均按试剂盒说明书进行。②采用RT-PCR技术检测胰腺组织中MyD88和NF-κB mRNA的表达。先采用Trizol一步法抽提组织中的总RNA，再用紫外分光光度仪测定A260 /A280（1.76～1.97），以琼脂糖凝胶电泳法检测28 s/18 s（1.69～1.96），结果基本符合要求。其他步骤严格按照试剂盒说明书进行。目的基因MyD88基因、NF-κB基因及内参β-actin基因的引物序列见表 1，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用相对定量法，利用内参基因β-actin为参照计算目的基因的相对表达量。③胰腺组织以甲醛固定24 h，脱水，石蜡包埋，3～4μm厚切片，行HE染色，在显微镜下（400倍）观察胰腺组织的病理学改变。
表1
RT-PCR的引物序列
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组小鼠胰腺组织的病理学改变
SAP组小鼠建模后，因小鼠体质较弱，于24 h时死亡1只，48 h时死亡1只。SAP各亚组小鼠处死后，大体可见腹腔脏器改变随时间推移由轻向重过渡，6 h时仅比正常对照组小鼠的胰腺略有增大；而发展至24 h后腹腔内可见大量淡红色液体，胰腺水肿坏死严重。显微镜下观察正常对照组小鼠的胰腺组织结构清晰，无炎症细胞浸润。SAP-6 h组小鼠的胰腺腺泡结构尚完整，小叶间隔清晰，与正常对照组比较差异不明显；12 h时表现为胰腺水肿、充血及炎症细胞浸润，小叶间隙略有增宽但结构完好；24 h时见胰腺小叶结构紊乱、水肿，周围脂肪组织明显充血、炎症细胞浸润；48 h时见腺泡肿胀，胰腺大片坏死，坏死区炎症细胞浸润，小叶缺失，部分腺泡呈孤岛状（图 1）。
图1
示SAP组和正常对照组小鼠胰腺组织的病理学检查结果（HE ×400）。1A：正常对照组；1B：SAP-12 h组；1C：SAP-48 h组
2.2 2组小鼠的血清IL-1β、IL-10及TNF-α浓度和胰腺组织MyD88及NF-κB mRNA的表达结果
各时点SAP组小鼠的IL-1β、IL-10及TNF-α浓度均高于正常对照组（P＜0.05）。各时点SAP组与正常对照组（6 h组）相比较，其胰腺组织中MyD88 mRNA及NF-κB mRNA的表达水平均较高（P＜0.05）。通过对6 h组和12 h组、12 h组和24 h组、24 h组和48 h组的比较发现：①正常对照组的IL-1β、IL-10及TNF-α浓度各时点均基本稳定，变化不大（P＞0.05）。②SAP各亚组的IL-1β和IL-10水平除12 h组与24 h组比较差异均有统计学意义外（P＜0.05），余均无明显差异（P＞0.05）；6 h组和12 h组、24 h组和48 h组的TNF-α浓度比较差异均有统计学意义（P＜0.05），12 h组与24 h组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；3对组间比较，MyD88 mRNA表达水平的差异均有统计学意义（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表达水平除6 h组与12 h组比较差异有统计学意义外（P＜0.05），余均无明显差异（P＞0.05）。见表 2。
表2
2组小鼠各时点检测指标比较结果（2.3 MyD88 mRNA表达与其他指标的关系
将SAP组各亚组MyD88 mRNA的表达水平与IL-1β、IL-10、TNF-α的浓度以及NF-κB mRNA的表达水平进行相关性分析，结果发现，MyD88 mRNA的表达水平同其他指标均呈一致性同步变化，具有良好的相关性（P＜0.01）。见表 3。
表3
SAP组小鼠各时点MyD88 mRNA的表达水平与其他指标的相关性分析结果
3 讨论
近年来的研究[5-7]表明，抑制IL-1β、TNF-α、IL-10等炎症细胞因子的表达可以减轻胰腺炎的严重程度。国外研究[8-11]显示，TLR通路在急性胰腺炎的发病机理中发挥作用，与野生型小鼠相比，几乎所有的TLR缺陷小鼠，尤其是TLR4缺陷的小鼠，其胰腺炎的严重程度都明显减轻。TLR通路激活信号通过MyD88的传导，最终导致促炎细胞因子表达上调和多种机体防御蛋白的转录，如IL-1β、TNF-α等[12-13]。而作为TLR通路整体结构的“瓶颈”[14]——MyD88，对其在TLR通路中发挥的作用的具体研究较少。
本实验在总结了以往研究的基础上，检测了胰腺组织中MyD88 mRNA与NF-κB mRNA的表达水平及血清相关炎症因子的浓度，同时分析了MyD88 mRNA的表达水平与相关炎症因子在急性胰腺炎发展中的相关性。结果显示，在SAP组，12～24 h时IL-1β浓度增高（P＜0.05）；IL-10浓度在12 h时略微下降，24 h升高（P＜0.05）；TNF-α浓度在6～12 h以及24～48 h两个时段改变明显（P＜0.05）；MyD88 mRNA的表达水平在前3个时点随时间的增加而增高（P＜0.05），而在48 h有所下降（P＜0.05）；NF-κB mRNA的表达水平在6～12 h时增高（P＜0.05），12 h后变动不明显，在24～48 h呈现一个平台期。病理学检查结果提示，前3个时点的病理损伤逐渐加重，在时间上，这与MyD88 mRNA的表达水平逐步升高基本一致。而由于病理损伤是一个渐变的过程，在48 h后由于损伤因素仍然存在，所以病理学改变会继续进展。MyD88 mRNA与NF-κB mRNA的表达水平及血清炎症因子（IL-1β、TNF-α及IL-10）的浓度在各个时点上都存在相关性（P＜0.01），提示MyD88 mRNA的表达水平高低可能影响了与胰腺炎炎症相关因子（NF-κB、IL-1β、TNF-α及IL-10）的表达与浓度，而这些因素的表达与浓度正是急性胰腺炎严重程度的决定因素。Neuhöfer等[15]的实验研究表明，对正常和抑制了NF-κB表达的小鼠分别建立L-精氨酸诱导的急性胰腺炎模型后，抑制了NF-κB表达的小鼠比正常小鼠其炎症因子（如IL-1β、TNF-α等）的表达水平低，这也间接证实了MyD88的作用。MyD88的变化影响了这些决定胰腺炎炎症发生和发展的因素，从而对胰腺炎的发生和发展发挥一定的作用。因此，在急性胰腺炎的治疗中可以以此为突破点，以控制炎症的进展。但本实验的观察时间尚较短，在48 h之后的情况需要进一步研究。
