引用本文： 管小青, 郑向欣, 吴骥, 顾书成, 袁牧, 张旭旭, 邱兴, 陆柏林. 三阴性乳腺癌组织中MMP-3和VEGF表达的相关性及临床分析. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(5): 567-571. doi: 10.7507/1007-9424.20140137 复制
三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体-2（HER-2）表达阴性的一类乳腺癌。文献[1-3]报道，TNBC约占乳腺癌总数的15%～25%。由于缺乏治疗靶点，且常常发生在绝经前乳腺癌患者，年龄小，恶性程度高，有着较高的局部复发和远处转移率，临床上预后较差。有研究表明，在肿瘤的浸润转移过程中，基质金属蛋白酶（MMP）家族起重要作用[4]，而血管内皮细胞生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成过程中发挥着核心的作用[5-6]。本研究收集2008年1月至2013年1月期间我院收治的112例确诊为TNBC的患者，用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中MMP-3和VEGF的表达，分析两者在TNBC中表达的相关性及其对预后的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组资料来源于2008年1月至2013年1月期间徐州医学院附属宿迁医院/南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院收治的112例已经确诊为TNBC患者，年龄26～73岁，中位年龄41.3岁。均为女性患者和初次确诊的病例。绝经前患者78例，绝经后34例。病理类型：原位导管内癌10例，浸润性导管癌77例，原位小叶癌4例，浸润性小叶癌18例，硬癌3例。有腋窝淋巴结转移74例，无腋窝淋巴结转移38例。按2002年第6版AJCC乳腺癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者80例。另均衡随机法选择2008年1月至2013年1月期间徐州医学院附属宿迁医院/南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院收治的、其病理类型及病理分期相近的112例luminal型乳腺癌患者作为对照。
1.2 免疫组织化学方法
1.2.1 试剂
所有检测试剂均购于福州迈新生物技术有限公司，包括一抗、二抗、单抗试剂盒，兔抗人MMP-3多克隆抗体，兔抗人VEGF单克隆抗体，DAB底物显色剂。
1.2.2 操作方法
应用SP法检测ER、PR、Her-2、MMP-3和VEGF。实验步骤按试剂盒说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照，福州迈新生物技术有限公司提供的MMP-3和VEGF已知阳性的切片作为阳性对照。
1.2.3 结果判断
ER、PR和Her-2免疫组织化学SP检测法均为（－），纳入本组研究。任何ER或（和）PR被判断为（+/－）均视为阳性；对于Her-2检测的结果判断，如果SP法检测Her-2为（+）则直接判断为阴性，如果Her-2为（+++）则直接判断为阳性，如果Her-2为（++），则再进行Fish方法检测并进行验证是否为阴性，Fish方法提示Her-2也为阴性者，方可纳入TNBC组。MMP-3、VEGF以细胞浆或细胞膜出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，在镜下观察阳性细胞比例及阳性着色强度，参照Shimizu等[7]的评分标准进行半定量积分判断结果。着色强度判定：不着色为0分，弱着色为1分，中度着色为2分，强着色为3分；阳性细胞比例判定：阳性细胞占总细胞数小于10%为0分，10%～30%为1分，31%～70%为2分，＞70%为3分。最后，以阳性细胞的百分比得分与着色强度得分之积作为最终结果进行判定，≥3分为阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。运用方差分析、χ2检验、t检验等方法对数据进行统计学处理。以Spearman检验进行相关性分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MMP-3和VEGF在不同乳腺癌组织中的表达结果
MMP-3和VEGF在TNBC组织中的免疫组织化学染色结果见图 1。MMP-3在TNBC和luminal型乳腺癌中的表达阳性率分别为90.18%（101/112）和49.11%（55/112），VEGF在其中的表达阳性率分别为84.82%（95/112）和48.21%（54/112），二者在TNBC乳腺癌中均明显高于luminal型乳腺癌，差异有统计学意义（MMP-3：χ2=44.682，P=0.000；VEGF：χ2=33.695，P=0.000）。
图1
TNBC组织中MMP-3和VEGF表达结果，细胞浆呈棕黄色阳性表达（SP×400）。1A：MMP-3；1B：VEGF
Figure1.
Results of MMP-3 and VEGF expressions in TNBC tissues, strongly positive expression with buffy in cytoplasm (SP×400).1A:MMP-3;1B:VEGF
2.2 MMP-3和VEGF在TNBC中的阳性表达与其临床病理特征的关系
TNBC中MMP-3和VEGF阳性表达均与患者发病年龄、月经情况、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、病理类型、p53表达情况和TNM分期有关（P < 0.05）。见表 1。
表1
MMP-3和VEGF在TNBC中的表达与其临床病理特征的关系
Table1.
Expressions of MMP-3 and VEGF in TNBC tissues and its relationship to clinicopathologic characteristics
2.3 MMP-3和VEGF表达的相关性
TNBC乳腺癌中MMP-3阳性表达101例患者中，VEGF阳性表达92例，阴性表达9例；MMP-3阴性表达的11例患者中，VEGF阳性表达3例，阴性表达8例，二者表达呈正相关（rs=0.771，P < 0.01）。
2.4 随访结果
通过电话、患者复诊或复治随访，随访时间1～5年（平均2.8年），随访率为89.29%（100/112）。有11例MMP-3阳性表达的患者失访，自失访之日起作为死亡计算。112例TNBC乳腺癌患者1年生存率为96.43%（108/112）。有4例分别于术后5、7、9、11个月死亡，其中1例死于化疗严重并发症，3例为脑、肺、肝、骨等多脏器转移，此4例患者其MMP-3、VEGF均双阳性；100例TNBC获得随访的患者3年内脏器复发转移82例，3年内复发转移率为73.21%；5年生存率（含带瘤生存）为36.61%。
3 讨论
TNBC作为乳腺癌中的一种特殊类型，其病理组织学、分子生物学方面有别于其他类型乳腺癌，表达不同的细胞因子，如CK5/6、CK14、CK17等[8]，复发和转移率高，尤其内脏转移和软组织复发发生率高，严重影响此类患者的生存期[9]。我院近5年来共收治653例乳腺癌，其中TNBC 112例，约占同期乳腺癌的17.15%，与文献[10-11]报道的结果基本一致。TNBC除了与其他类型乳腺癌有不同细胞因子表达之外，尤其是与luminal型相比，还有p53、MMP-3、VEGF呈现高表达[12-15]。本研究中，VEGF和MMP-3在TNBC组织中均呈现高表达，且二者表达呈正相关，并且VEGF和MMP-3在TNBC中的表达明显高于luminal型乳腺癌（P < 0.05），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌恶性生物学行为中可能有内在联系，可能共同促进乳腺癌的血管形成和向远处侵袭、转移，可作为判断TNBC侵袭和转移能力的有价值的指标。
VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原，可特异性地促进内皮细胞生长及血管生成，并能提高血管渗透性，为血管内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供基质[16]。VEGF是目前已知作用最强的、肿瘤细胞分泌的促脉管形成因子之一，肿瘤生长较快部位的缺血缺氧可刺激VEGF表达增强，诱导脉管生成，促进肿瘤细胞发生淋巴结和肺转移[17]。MMP是锌依赖性的蛋白酶超家族，其家族成员能够降解生理和病理状况下细胞外基质中所有的蛋白成分和基底膜[18-19]。MMP在肿瘤或间质细胞中的过表达与癌症的演变进展之间存在一定的因果关系。MMP-3作为MMP家族的一员，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ型胶原纤维以及黏蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和原纤维蛋白，在多种恶性肿瘤中表达，如结直肠癌、皮肤癌、乳腺癌、基底细胞癌等，并且与肿瘤的生物学行为和预后有关[20-22]。本研究中发现，TNBC中MMP-3和VEGF表达与患者发病年龄、绝经情况、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移和临床分期均有关。VEGF和MMP-3在淋巴结转移组和Ⅲ～Ⅳ期的表达水平明显高于淋巴结无转移组和Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05），提示VEGF的表达与TNBC的侵袭和转移能力有关，其机制可能是通过诱导血管的形成，为肿瘤的生长提供充足的营养，从而促进肿瘤体积增大，这与Nathanson [17]报道相符；MMP-3在TNBC的浸润转移中扮演重要角色，它的表达情况也可以作为判定TNBC进展情况的指标，其在TNBC中更高的表达率提示了TNBC更差的预后[23]。在p53呈高表达的患者中，MMP-3、VEGF的表达率也较高，这一结果为临床选择对其治疗的方案提供依据，并且在TNBC中MMP-3和VEGF的表达呈正相关（rs=0.771，P < 0.01），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌恶性生物学行为中可能有内在联系，可能共同促进乳腺癌的血管形成和向远处侵袭、转移。
TNBC患者的3年内复发转移率、5年生存率明显低于luminal型乳腺癌患者，此已成定论。而TNBC的预后最差[24]，复发危险多发生在治疗后的1～3年内，多数患者在5年内死亡。本组资料显示，在获得随访的100例TNBC中，3年内复发转移率为73.21%，5年生存率（含带瘤生存）仅为36.61%，而且均发生在MMP-3和VEGF均呈阳性表达的TNBC患者，说明TNBC患者其MMP-3和VEGF均呈阳性表达的预后更差。本组3年内复发转移率高，5年生存率低，与Tischkowitz等[25]报道的基本相似。但是3年内转移率高于蔡欣等[26]报道的57.14%，远低于57.10%的5年生存率。分析本组3年内转移率高、生存率低的原因可能是本组患者病期晚病理分级差，MMP-3和VEGF均呈阳性表达，没有进行其他分子靶向治疗的经济条件，拒绝后续强化治疗等。
TNBC由于缺乏激素受体及Her-2的表达，故对内分泌治疗及曲妥珠单抗靶向治疗无效。术后易复发，局部放疗的效果也不佳[27]，故化疗是其主要的治疗手段。抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗单一药物应用在乳腺癌治疗中并未表现出抗肿瘤活性，但在TNBC中也许能提高化疗疗效，因为TNBC大多高表达VEGF。Ⅱ期临床试验[28-29]结果提示，西妥昔单抗联合化疗治疗VEGF过表达TNBC可提高客观有效率。因此，对TNBC进行MMP-3、VEGF检测，以便了解MMP-3、VEGF高表达的TNBC患者的预后，并通过对上述因子表达的干预，抑制肿瘤细胞降解基质及脉管形成，从而阻断癌细胞转移，为临床上对TNBC的治疗提供新的思路。
三阴性乳腺癌（TNBC）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人类表皮生长因子受体-2（HER-2）表达阴性的一类乳腺癌。文献[1-3]报道，TNBC约占乳腺癌总数的15%～25%。由于缺乏治疗靶点，且常常发生在绝经前乳腺癌患者，年龄小，恶性程度高，有着较高的局部复发和远处转移率，临床上预后较差。有研究表明，在肿瘤的浸润转移过程中，基质金属蛋白酶（MMP）家族起重要作用[4]，而血管内皮细胞生长因子（VEGF）在肿瘤血管生成过程中发挥着核心的作用[5-6]。本研究收集2008年1月至2013年1月期间我院收治的112例确诊为TNBC的患者，用免疫组织化学方法检测乳腺癌组织中MMP-3和VEGF的表达，分析两者在TNBC中表达的相关性及其对预后的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
本组资料来源于2008年1月至2013年1月期间徐州医学院附属宿迁医院/南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院收治的112例已经确诊为TNBC患者，年龄26～73岁，中位年龄41.3岁。均为女性患者和初次确诊的病例。绝经前患者78例，绝经后34例。病理类型：原位导管内癌10例，浸润性导管癌77例，原位小叶癌4例，浸润性小叶癌18例，硬癌3例。有腋窝淋巴结转移74例，无腋窝淋巴结转移38例。按2002年第6版AJCC乳腺癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期患者32例，Ⅲ～Ⅳ期患者80例。另均衡随机法选择2008年1月至2013年1月期间徐州医学院附属宿迁医院/南京鼓楼医院集团宿迁市人民医院收治的、其病理类型及病理分期相近的112例luminal型乳腺癌患者作为对照。
1.2 免疫组织化学方法
1.2.1 试剂
所有检测试剂均购于福州迈新生物技术有限公司，包括一抗、二抗、单抗试剂盒，兔抗人MMP-3多克隆抗体，兔抗人VEGF单克隆抗体，DAB底物显色剂。
1.2.2 操作方法
应用SP法检测ER、PR、Her-2、MMP-3和VEGF。实验步骤按试剂盒说明书进行，PBS代替一抗作阴性对照，福州迈新生物技术有限公司提供的MMP-3和VEGF已知阳性的切片作为阳性对照。
1.2.3 结果判断
ER、PR和Her-2免疫组织化学SP检测法均为（－），纳入本组研究。任何ER或（和）PR被判断为（+/－）均视为阳性；对于Her-2检测的结果判断，如果SP法检测Her-2为（+）则直接判断为阴性，如果Her-2为（+++）则直接判断为阳性，如果Her-2为（++），则再进行Fish方法检测并进行验证是否为阴性，Fish方法提示Her-2也为阴性者，方可纳入TNBC组。MMP-3、VEGF以细胞浆或细胞膜出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，在镜下观察阳性细胞比例及阳性着色强度，参照Shimizu等[7]的评分标准进行半定量积分判断结果。着色强度判定：不着色为0分，弱着色为1分，中度着色为2分，强着色为3分；阳性细胞比例判定：阳性细胞占总细胞数小于10%为0分，10%～30%为1分，31%～70%为2分，＞70%为3分。最后，以阳性细胞的百分比得分与着色强度得分之积作为最终结果进行判定，≥3分为阳性。
1.3 统计学方法
采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。运用方差分析、χ2检验、t检验等方法对数据进行统计学处理。以Spearman检验进行相关性分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MMP-3和VEGF在不同乳腺癌组织中的表达结果
MMP-3和VEGF在TNBC组织中的免疫组织化学染色结果见图 1。MMP-3在TNBC和luminal型乳腺癌中的表达阳性率分别为90.18%（101/112）和49.11%（55/112），VEGF在其中的表达阳性率分别为84.82%（95/112）和48.21%（54/112），二者在TNBC乳腺癌中均明显高于luminal型乳腺癌，差异有统计学意义（MMP-3：χ2=44.682，P=0.000；VEGF：χ2=33.695，P=0.000）。
图1
TNBC组织中MMP-3和VEGF表达结果，细胞浆呈棕黄色阳性表达（SP×400）。1A：MMP-3；1B：VEGF
Figure1.
Results of MMP-3 and VEGF expressions in TNBC tissues, strongly positive expression with buffy in cytoplasm (SP×400).1A:MMP-3;1B:VEGF
2.2 MMP-3和VEGF在TNBC中的阳性表达与其临床病理特征的关系
TNBC中MMP-3和VEGF阳性表达均与患者发病年龄、月经情况、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、病理类型、p53表达情况和TNM分期有关（P < 0.05）。见表 1。
表1
MMP-3和VEGF在TNBC中的表达与其临床病理特征的关系
Table1.
Expressions of MMP-3 and VEGF in TNBC tissues and its relationship to clinicopathologic characteristics
2.3 MMP-3和VEGF表达的相关性
TNBC乳腺癌中MMP-3阳性表达101例患者中，VEGF阳性表达92例，阴性表达9例；MMP-3阴性表达的11例患者中，VEGF阳性表达3例，阴性表达8例，二者表达呈正相关（rs=0.771，P < 0.01）。
2.4 随访结果
通过电话、患者复诊或复治随访，随访时间1～5年（平均2.8年），随访率为89.29%（100/112）。有11例MMP-3阳性表达的患者失访，自失访之日起作为死亡计算。112例TNBC乳腺癌患者1年生存率为96.43%（108/112）。有4例分别于术后5、7、9、11个月死亡，其中1例死于化疗严重并发症，3例为脑、肺、肝、骨等多脏器转移，此4例患者其MMP-3、VEGF均双阳性；100例TNBC获得随访的患者3年内脏器复发转移82例，3年内复发转移率为73.21%；5年生存率（含带瘤生存）为36.61%。
3 讨论
TNBC作为乳腺癌中的一种特殊类型，其病理组织学、分子生物学方面有别于其他类型乳腺癌，表达不同的细胞因子，如CK5/6、CK14、CK17等[8]，复发和转移率高，尤其内脏转移和软组织复发发生率高，严重影响此类患者的生存期[9]。我院近5年来共收治653例乳腺癌，其中TNBC 112例，约占同期乳腺癌的17.15%，与文献[10-11]报道的结果基本一致。TNBC除了与其他类型乳腺癌有不同细胞因子表达之外，尤其是与luminal型相比，还有p53、MMP-3、VEGF呈现高表达[12-15]。本研究中，VEGF和MMP-3在TNBC组织中均呈现高表达，且二者表达呈正相关，并且VEGF和MMP-3在TNBC中的表达明显高于luminal型乳腺癌（P < 0.05），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌恶性生物学行为中可能有内在联系，可能共同促进乳腺癌的血管形成和向远处侵袭、转移，可作为判断TNBC侵袭和转移能力的有价值的指标。
VEGF是内皮细胞特异性的有丝分裂原，可特异性地促进内皮细胞生长及血管生成，并能提高血管渗透性，为血管内皮细胞的迁移和肿瘤细胞的转移提供基质[16]。VEGF是目前已知作用最强的、肿瘤细胞分泌的促脉管形成因子之一，肿瘤生长较快部位的缺血缺氧可刺激VEGF表达增强，诱导脉管生成，促进肿瘤细胞发生淋巴结和肺转移[17]。MMP是锌依赖性的蛋白酶超家族，其家族成员能够降解生理和病理状况下细胞外基质中所有的蛋白成分和基底膜[18-19]。MMP在肿瘤或间质细胞中的过表达与癌症的演变进展之间存在一定的因果关系。MMP-3作为MMP家族的一员，主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ型胶原纤维以及黏蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和原纤维蛋白，在多种恶性肿瘤中表达，如结直肠癌、皮肤癌、乳腺癌、基底细胞癌等，并且与肿瘤的生物学行为和预后有关[20-22]。本研究中发现，TNBC中MMP-3和VEGF表达与患者发病年龄、绝经情况、肿瘤大小、腋窝淋巴结转移和临床分期均有关。VEGF和MMP-3在淋巴结转移组和Ⅲ～Ⅳ期的表达水平明显高于淋巴结无转移组和Ⅰ～Ⅱ期（P < 0.05），提示VEGF的表达与TNBC的侵袭和转移能力有关，其机制可能是通过诱导血管的形成，为肿瘤的生长提供充足的营养，从而促进肿瘤体积增大，这与Nathanson [17]报道相符；MMP-3在TNBC的浸润转移中扮演重要角色，它的表达情况也可以作为判定TNBC进展情况的指标，其在TNBC中更高的表达率提示了TNBC更差的预后[23]。在p53呈高表达的患者中，MMP-3、VEGF的表达率也较高，这一结果为临床选择对其治疗的方案提供依据，并且在TNBC中MMP-3和VEGF的表达呈正相关（rs=0.771，P < 0.01），提示MMP-3和VEGF在乳腺癌恶性生物学行为中可能有内在联系，可能共同促进乳腺癌的血管形成和向远处侵袭、转移。
TNBC患者的3年内复发转移率、5年生存率明显低于luminal型乳腺癌患者，此已成定论。而TNBC的预后最差[24]，复发危险多发生在治疗后的1～3年内，多数患者在5年内死亡。本组资料显示，在获得随访的100例TNBC中，3年内复发转移率为73.21%，5年生存率（含带瘤生存）仅为36.61%，而且均发生在MMP-3和VEGF均呈阳性表达的TNBC患者，说明TNBC患者其MMP-3和VEGF均呈阳性表达的预后更差。本组3年内复发转移率高，5年生存率低，与Tischkowitz等[25]报道的基本相似。但是3年内转移率高于蔡欣等[26]报道的57.14%，远低于57.10%的5年生存率。分析本组3年内转移率高、生存率低的原因可能是本组患者病期晚病理分级差，MMP-3和VEGF均呈阳性表达，没有进行其他分子靶向治疗的经济条件，拒绝后续强化治疗等。
TNBC由于缺乏激素受体及Her-2的表达，故对内分泌治疗及曲妥珠单抗靶向治疗无效。术后易复发，局部放疗的效果也不佳[27]，故化疗是其主要的治疗手段。抗VEGF的单克隆抗体贝伐单抗单一药物应用在乳腺癌治疗中并未表现出抗肿瘤活性，但在TNBC中也许能提高化疗疗效，因为TNBC大多高表达VEGF。Ⅱ期临床试验[28-29]结果提示，西妥昔单抗联合化疗治疗VEGF过表达TNBC可提高客观有效率。因此，对TNBC进行MMP-3、VEGF检测，以便了解MMP-3、VEGF高表达的TNBC患者的预后，并通过对上述因子表达的干预，抑制肿瘤细胞降解基质及脉管形成，从而阻断癌细胞转移，为临床上对TNBC的治疗提供新的思路。
