引用本文： 高毅明, 赵春英. 人平衡型核苷载体在乳腺癌细胞中的表达情况及其对5-FU药效的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(5): 599-602. doi: 10.7507/1007-9424.20140144 复制
乳腺癌是危害全世界妇女健康的首要恶性肿瘤之一，在肺癌、结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌中每8例死亡病例中就有1例为乳腺癌[1]。目前治疗有手术、放化疗、靶向治疗等综合性治疗方法。乳腺癌新辅助化疗可使不可手术的局部晚期乳腺癌患者获得手术治疗的机会，同时化疗使肿瘤缩小后可提高保乳手术率[2]。但是，部分病例不能通过新辅助化疗达到病情缓解，化疗耐药是新辅助化疗目前所面临的主要问题[3]。新辅助化疗常用的吉西他滨、希罗达等药物发挥作用的终产物需要通过细胞膜上的核苷载体进入细胞发挥作用[4]，猜想核苷载体在乳腺癌细胞膜上的表达量及其活性将影响新辅助化疗的作用效果。迄今发现两类核苷载体，即人平衡型核苷载体（human equilibrative nucleoside transporters，hENTs）和Na+离子依赖的主动转运载体（human concentrative nucleoside transporters，hCNTs）[5-7]，而以hENTs的表达最多，其作用最大，可能是细胞膜上对核苷类药物转运的主要通道[8-10]。我们选取常用的核苷类化疗药物5-FU作为研究药物，观察4种乳腺癌细胞株的增殖情况，研究hENTs的表达是否与核苷类化疗药效有直接相关关系，为临床新辅助化疗选择敏感药物提供基础理论依据，避免因化疗药不敏感而延误病情。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及药物
四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Amresco公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，TRIzol试剂（批号：167022024）购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒（批号：DRR019A）为TaKaRa公司产品。5-FU（批号：1224）等标准品均由美国Sigma公司生产，5-FU用培养液配成储备液（250 g/L），pH调至7.2，过滤，4℃保存备用。
1.2 细胞培养
乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468由上海中医药大学基础医学院提供；SK-BR-3、MCF-7细胞株于上海研生生化试剂有限公司购买。乳腺癌细胞株培养用DMEM培养基。培养基中含10%灭活小牛血清、青霉素10×104 U/L、链霉素100 mg/L。细胞在湿度为95%、温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养。
1.3 RT-PCR半定量检测细胞株hENTs mRNA的表达
①取50 mL培养瓶中长满瓶壁80%以上的乳腺癌细胞进行实验，按TRIzol试剂一步法[5]提取总RNA，并用凝胶电泳检测RNA的完整性（28 s、18 s、5 s亚基条带清晰，28 s与18 s荧光强度之比为2:1，无降解杂带），测定RNA浓度并调整各细胞株RNA浓度基本一致。②根据基因库编码合成引物，其中hENT1及hENT2引物由上海生物工程有限公司设计并合成。hENT1、hENT2及β-actin的引物序列：hENT1上游引物为5′-AGCAGGCAAAGAGG-AATCTGGAGT-3′，下游引物为5′-GAAGGCAAAG-GCAGCCATGAAGAA-3′，扩增片段长度为436 bp；hENT2上游引物为5′-TCCCAGGCCCAAGCTCAG-GA-3′，下游引物为5′-GGAACCGCAGGCAGACC-AGC-3′，扩增片段长度为430 bp；β-actin上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGCT-3′，扩增片段长度为270 bp。将所合成的各核苷载体、β-actin上下游引物用0.1% DEPC水溶解。根据引物分子量的不同，计算加DEPC水的量，使其终浓度均为2 pmol/μL。③以1μg各个细胞株RNA为模板，按TaKaRa公司试剂盒所提供的方法进行RT-PCR，用β-actin作为内参。RT-PCR共同反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物即进行电泳。④反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离（电压100 V，时间40 min），Image-Master VDS扫描分析仪测定各显色带灰度，并计算其与内参的相对比值。上述实验重复3次。
1.4 MTT法检测5-FU对各乳腺癌细胞株的细胞毒性
①将进入对数生长期的4种乳腺癌细胞接种于96孔板中，按细胞5 000个/孔待细胞贴壁后（24 h）进行细胞毒性实验。②根据预实验结果，本实验5-FU浓度序列为0 ng/L、1.28×104 ng/L、6.40×104 ng/L、3.20×105 ng/L、1.60×106 ng/L、8.00×106 ng/L、4.00×107 ng/L、2.00×108 ng/L。为减除背景，每组均另设空白对照孔和正常对照孔。每个5-FU浓度设3个复孔。按上述浓度分别加入含相应浓度药物的培养液培养48 h，然后每孔加入MTT液20μL（5 mg/mL），继续培养4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，终止反应，将96孔板移入平板振荡器，水平振荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，用DG-3022A型酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定每孔吸光度（A）值。细胞增殖率=（A实验孔-A空白对照）/（A正常对照-A空白对照）。上述实验均重复3次。绘制细胞生长曲线，5-FU的半数抑制浓度（IC50）用GraphPad Prism 4 Demo软件（Version 6.01）计算。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 11.0对数据进行分析，采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RNA电泳检测完整性
所抽提的RNA经检测其A260/A280值均在1.7～1.9之间，纯度较好，将RNA浓度调整至1.0µg/µL。RNA电泳可见3条带，分别为28 s、18 s、5 s亚基，28 s与18 s荧光强度之比为2:1，说明RNA完整。
2.2 乳腺癌细胞株中hENTs mRNA的表达水平
结果见表 1。从表 1可见，hENT1 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中表达量相近，差异无统计学意义（P > 0.05）；但其在这三者中的表达明显高于其在MCF-7细胞中的表达，分别为MCF-7细胞的2.3、2.0及2.1倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）。hENT2 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中有表达，但三者之间差异无统计学意义（P > 0.05），而在MCF-7中未见表达。各细胞株中hENT1的表达量明高于hENT2的表达量，差异有统计学意义（P < 0.05）。
表1
hENTs mRNA在4种细胞株中的表达量（n=3，2.3 5-FU抑制乳腺癌细胞株增殖的MTT结果
4种乳腺癌细胞株对5-FU的细胞毒性反应不一，MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7细胞的IC50分别为（863±22.6）×103 ng/L、（973±30.1）×103 ng/L、（899±24.5）×103 ng/L、（1 236±20.6）×103 ng/L。前3种细胞之间差异无统计学意义（P > 0.05），但均分别明显低于MCF-7细胞，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 4种乳腺癌细胞株中hENTs mRNA的表达与5-FU毒性的关系
结合RT-PCR结果，在5-FU IC50较低的3个细胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3）中，hENT1高表达（与MCF-7中比较，差异有统计学意义，P < 0.05），hENT2有表达（MCF-7中未见表达）；IC50较高的MCF-7细胞株则低表达hENT1，hENT2未见表达，提示hENTs的表达高低影响5-FU的细胞毒性。
3 讨论
目前乳腺癌的治疗包括手术、放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗在内的综合性治疗[11-12]。化疗在综合性治疗中有不可替代的作用，化疗敏感药物的正确选择可以明显改善预后[13-15]，因此，寻找预测药物是否敏感的生物分子将为临床用药提供指导。乳腺癌化疗中常用的希罗达、吉西他滨等核苷类化疗药物需在人体内代谢成核苷类似物，经肿瘤细胞膜表面的核苷载体进入细胞发挥作用[16-17]。所以细胞膜表面核苷载体可能是预测核苷类化疗药物是否敏感的生物分子。
hENTs在正常细胞及肿瘤细胞表达有明显差异[18]，且在同组织肿瘤细胞的不同分化类型之间有差异[19-21]。本研究中选取4种乳腺癌细胞株进行研究，通过测量hENTs的mRNA量间接反映hENTs的表达情况，在细胞分子水平上证实乳腺癌细胞膜表达hENTs，且在4种细胞株中hENTs表达有差异，特别在MCF-7细胞中表达较少。在4种细胞株中，hENT1的表达量明显高于hENT2，提示hENT1为主要通道，可能起主要作用，与相关文献[10, 22]报道相符。
5-FU作为经典的核苷类化疗药物，临床上仍在广为应用。5-FU借助细胞膜核苷载体的转运进入肿瘤细胞[23]，被代谢成一磷酸脱氧氟尿嘧啶核苷和三磷酸氟尿嘧啶核苷，前者抑制胸苷酸合成酶的活性，后者以伪代谢物的形式掺入到RNA中，产生细胞毒性。本研究中证实5-FU对乳腺癌细胞株有毒性作用，且在4种细胞株之间毒性反应不一，其IC50各组之间有差异。主要表现在MCF-7细胞株中，5-FU的IC50较高，可能与MCF-7细胞株细胞膜上hENTs表达量少于另3种细胞株有关。因此细胞膜hENTs表达量及其活性可能影响5-FU的疗效。
已有针对胰腺癌病理组织测定hENT1来预测吉西他滨疗效的报道[24]，但胰腺癌为腹腔内器官，术前较难获得病理分型，乳腺癌为体表实体肿瘤，较其他肿瘤容易获取术前肿瘤的病理类型及免疫组织化学分型。若在术前检测肿瘤组织hENTs的表达情况，可指导临床新辅助化疗能否选取核苷类化疗药物，避免因化疗不敏感而延误病情，也可根据术后病理结果，选择敏感的核苷类化疗药物行辅助化疗。
本实验为进一步在乳腺癌组织中检测hENTs提供细胞学基础，对临床指导核苷类化疗药物的选择有重要的意义。
乳腺癌是危害全世界妇女健康的首要恶性肿瘤之一，在肺癌、结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌中每8例死亡病例中就有1例为乳腺癌[1]。目前治疗有手术、放化疗、靶向治疗等综合性治疗方法。乳腺癌新辅助化疗可使不可手术的局部晚期乳腺癌患者获得手术治疗的机会，同时化疗使肿瘤缩小后可提高保乳手术率[2]。但是，部分病例不能通过新辅助化疗达到病情缓解，化疗耐药是新辅助化疗目前所面临的主要问题[3]。新辅助化疗常用的吉西他滨、希罗达等药物发挥作用的终产物需要通过细胞膜上的核苷载体进入细胞发挥作用[4]，猜想核苷载体在乳腺癌细胞膜上的表达量及其活性将影响新辅助化疗的作用效果。迄今发现两类核苷载体，即人平衡型核苷载体（human equilibrative nucleoside transporters，hENTs）和Na+离子依赖的主动转运载体（human concentrative nucleoside transporters，hCNTs）[5-7]，而以hENTs的表达最多，其作用最大，可能是细胞膜上对核苷类药物转运的主要通道[8-10]。我们选取常用的核苷类化疗药物5-FU作为研究药物，观察4种乳腺癌细胞株的增殖情况，研究hENTs的表达是否与核苷类化疗药效有直接相关关系，为临床新辅助化疗选择敏感药物提供基础理论依据，避免因化疗药不敏感而延误病情。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及药物
四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Amresco公司，二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，TRIzol试剂（批号：167022024）购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒（批号：DRR019A）为TaKaRa公司产品。5-FU（批号：1224）等标准品均由美国Sigma公司生产，5-FU用培养液配成储备液（250 g/L），pH调至7.2，过滤，4℃保存备用。
1.2 细胞培养
乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-468由上海中医药大学基础医学院提供；SK-BR-3、MCF-7细胞株于上海研生生化试剂有限公司购买。乳腺癌细胞株培养用DMEM培养基。培养基中含10%灭活小牛血清、青霉素10×104 U/L、链霉素100 mg/L。细胞在湿度为95%、温度为37℃、CO2浓度为5%的培养箱内培养。
1.3 RT-PCR半定量检测细胞株hENTs mRNA的表达
①取50 mL培养瓶中长满瓶壁80%以上的乳腺癌细胞进行实验，按TRIzol试剂一步法[5]提取总RNA，并用凝胶电泳检测RNA的完整性（28 s、18 s、5 s亚基条带清晰，28 s与18 s荧光强度之比为2:1，无降解杂带），测定RNA浓度并调整各细胞株RNA浓度基本一致。②根据基因库编码合成引物，其中hENT1及hENT2引物由上海生物工程有限公司设计并合成。hENT1、hENT2及β-actin的引物序列：hENT1上游引物为5′-AGCAGGCAAAGAGG-AATCTGGAGT-3′，下游引物为5′-GAAGGCAAAG-GCAGCCATGAAGAA-3′，扩增片段长度为436 bp；hENT2上游引物为5′-TCCCAGGCCCAAGCTCAG-GA-3′，下游引物为5′-GGAACCGCAGGCAGACC-AGC-3′，扩增片段长度为430 bp；β-actin上游引物为5′-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物为5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGCT-3′，扩增片段长度为270 bp。将所合成的各核苷载体、β-actin上下游引物用0.1% DEPC水溶解。根据引物分子量的不同，计算加DEPC水的量，使其终浓度均为2 pmol/μL。③以1μg各个细胞株RNA为模板，按TaKaRa公司试剂盒所提供的方法进行RT-PCR，用β-actin作为内参。RT-PCR共同反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸7 min。PCR产物即进行电泳。④反应产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离（电压100 V，时间40 min），Image-Master VDS扫描分析仪测定各显色带灰度，并计算其与内参的相对比值。上述实验重复3次。
1.4 MTT法检测5-FU对各乳腺癌细胞株的细胞毒性
①将进入对数生长期的4种乳腺癌细胞接种于96孔板中，按细胞5 000个/孔待细胞贴壁后（24 h）进行细胞毒性实验。②根据预实验结果，本实验5-FU浓度序列为0 ng/L、1.28×104 ng/L、6.40×104 ng/L、3.20×105 ng/L、1.60×106 ng/L、8.00×106 ng/L、4.00×107 ng/L、2.00×108 ng/L。为减除背景，每组均另设空白对照孔和正常对照孔。每个5-FU浓度设3个复孔。按上述浓度分别加入含相应浓度药物的培养液培养48 h，然后每孔加入MTT液20μL（5 mg/mL），继续培养4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 200μL，终止反应，将96孔板移入平板振荡器，水平振荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，用DG-3022A型酶联免疫检测仪于570 nm波长处测定每孔吸光度（A）值。细胞增殖率=（A实验孔-A空白对照）/（A正常对照-A空白对照）。上述实验均重复3次。绘制细胞生长曲线，5-FU的半数抑制浓度（IC50）用GraphPad Prism 4 Demo软件（Version 6.01）计算。
1.5 统计学方法
采用统计软件SPSS 11.0对数据进行分析，采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 RNA电泳检测完整性
所抽提的RNA经检测其A260/A280值均在1.7～1.9之间，纯度较好，将RNA浓度调整至1.0µg/µL。RNA电泳可见3条带，分别为28 s、18 s、5 s亚基，28 s与18 s荧光强度之比为2:1，说明RNA完整。
2.2 乳腺癌细胞株中hENTs mRNA的表达水平
结果见表 1。从表 1可见，hENT1 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中表达量相近，差异无统计学意义（P > 0.05）；但其在这三者中的表达明显高于其在MCF-7细胞中的表达，分别为MCF-7细胞的2.3、2.0及2.1倍，差异均有统计学意义（P < 0.05）。hENT2 mRNA在MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3细胞中有表达，但三者之间差异无统计学意义（P > 0.05），而在MCF-7中未见表达。各细胞株中hENT1的表达量明高于hENT2的表达量，差异有统计学意义（P < 0.05）。
表1
hENTs mRNA在4种细胞株中的表达量（n=3，2.3 5-FU抑制乳腺癌细胞株增殖的MTT结果
4种乳腺癌细胞株对5-FU的细胞毒性反应不一，MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3、MCF-7细胞的IC50分别为（863±22.6）×103 ng/L、（973±30.1）×103 ng/L、（899±24.5）×103 ng/L、（1 236±20.6）×103 ng/L。前3种细胞之间差异无统计学意义（P > 0.05），但均分别明显低于MCF-7细胞，差异有统计学意义（P < 0.05）。
2.4 4种乳腺癌细胞株中hENTs mRNA的表达与5-FU毒性的关系
结合RT-PCR结果，在5-FU IC50较低的3个细胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-468、SK-BR-3）中，hENT1高表达（与MCF-7中比较，差异有统计学意义，P < 0.05），hENT2有表达（MCF-7中未见表达）；IC50较高的MCF-7细胞株则低表达hENT1，hENT2未见表达，提示hENTs的表达高低影响5-FU的细胞毒性。
3 讨论
目前乳腺癌的治疗包括手术、放化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗在内的综合性治疗[11-12]。化疗在综合性治疗中有不可替代的作用，化疗敏感药物的正确选择可以明显改善预后[13-15]，因此，寻找预测药物是否敏感的生物分子将为临床用药提供指导。乳腺癌化疗中常用的希罗达、吉西他滨等核苷类化疗药物需在人体内代谢成核苷类似物，经肿瘤细胞膜表面的核苷载体进入细胞发挥作用[16-17]。所以细胞膜表面核苷载体可能是预测核苷类化疗药物是否敏感的生物分子。
hENTs在正常细胞及肿瘤细胞表达有明显差异[18]，且在同组织肿瘤细胞的不同分化类型之间有差异[19-21]。本研究中选取4种乳腺癌细胞株进行研究，通过测量hENTs的mRNA量间接反映hENTs的表达情况，在细胞分子水平上证实乳腺癌细胞膜表达hENTs，且在4种细胞株中hENTs表达有差异，特别在MCF-7细胞中表达较少。在4种细胞株中，hENT1的表达量明显高于hENT2，提示hENT1为主要通道，可能起主要作用，与相关文献[10, 22]报道相符。
5-FU作为经典的核苷类化疗药物，临床上仍在广为应用。5-FU借助细胞膜核苷载体的转运进入肿瘤细胞[23]，被代谢成一磷酸脱氧氟尿嘧啶核苷和三磷酸氟尿嘧啶核苷，前者抑制胸苷酸合成酶的活性，后者以伪代谢物的形式掺入到RNA中，产生细胞毒性。本研究中证实5-FU对乳腺癌细胞株有毒性作用，且在4种细胞株之间毒性反应不一，其IC50各组之间有差异。主要表现在MCF-7细胞株中，5-FU的IC50较高，可能与MCF-7细胞株细胞膜上hENTs表达量少于另3种细胞株有关。因此细胞膜hENTs表达量及其活性可能影响5-FU的疗效。
已有针对胰腺癌病理组织测定hENT1来预测吉西他滨疗效的报道[24]，但胰腺癌为腹腔内器官，术前较难获得病理分型，乳腺癌为体表实体肿瘤，较其他肿瘤容易获取术前肿瘤的病理类型及免疫组织化学分型。若在术前检测肿瘤组织hENTs的表达情况，可指导临床新辅助化疗能否选取核苷类化疗药物，避免因化疗不敏感而延误病情，也可根据术后病理结果，选择敏感的核苷类化疗药物行辅助化疗。
本实验为进一步在乳腺癌组织中检测hENTs提供细胞学基础，对临床指导核苷类化疗药物的选择有重要的意义。
