引用本文： 韩建平, 陈钟. 骨髓间充质干细胞经脾移植治疗大鼠急性肝功能衰竭的实验研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(6): 669-674. doi: 10.7507/1007-9424.20140162 复制
我国是肝病大国，肝功能衰竭是各种肝病患者的死亡原因之一。肝细胞移植（HTx）是治疗暴发性肝功能衰竭（FHF）的一种有效的方法。肝移植动物模型及临床应用均取得了一定的效果[1]，但其存在供体短缺、移植肝细胞增殖困难等问题。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）强大的增殖能力及分化潜能为解决上述难题开辟了新的途径，具有简便易行、对受体影响小、应用灵活、价格相对低廉等优点。有关骨髓干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究[2]已取得了可喜的成果，但骨髓MSCs的移植部位、移植后是否进入肝实质、是否可分化为肝细胞、移植后受体肝功能的恢复等问题目前仍有争议。本实验通过成功分离、鉴定大鼠骨髓MSCs后，进行急性肝功能衰竭（ALF）大鼠模型的脾内移植，于移植后检测肝功能指标以研究移植细胞是否发挥肝细胞功能，并取受体大鼠肝脏检测是否有移植细胞迁移，以为更好地利用骨髓MSCs治疗肝功能衰竭奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
选用6周龄健康雄性清洁级SD大鼠1只（体质量150 g）用于获取骨髓MSCs；另选用8周龄健康雌性清洁级SD大鼠24只，体质量150～200 g，用于制备ALF模型。实验动物均由南通大学实验动物中心提供。主要试剂：胎牛血清购自杭州四季青公司，CD44、CD29及CD34兔抗大鼠购自武汉博士德公司，DMEM培养液为美国GIBCO公司产品，实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，PV-9000即用型二步法（非生物素）检测试剂盒购自北京海诚远宏科技有限公司，丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（速率法）、白蛋白（ALB）测定试剂盒（溴甲酚绿法）及总胆红素（TBIL）测定试剂盒（钡酸盐法）均购自中生北控生物科技股份有限公司。主要实验仪器：2323-2 CO2培养箱（美国Shel Lab公司），ckx41倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），7500fast型qPCR仪（美国Applied biosystems公司），日立7180型全自动生化分析仪（美国应用生物系统中国公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓MSCs的获取、培养和传代
采用颈椎脱臼法处死1只雄性大鼠，在无菌条件下剥离出胫骨及股骨，剪去两端，以DMEM基础培养液冲出骨髓，以5.0 mL注射器反复抽吸获得的骨髓，经200目筛网过滤制成单细胞悬液（此处密度可大可小，悬起细胞即可）。将单细胞悬液置水平离心机中离心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），弃上清液。MSCs的培养方法参照赵瑛[3]的方法并适当改进。将细胞悬液以4×105个/cm2的密度接种于DMEM完全培养液中（含有青霉素0.1 U/L，链霉素0.1 μg/L，10%胎牛血清），置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱中培养。3 d后全量换液，以后每2天或3天全量换液1次。换液前后在倒置相差显微镜下观察细胞的形态及生长情况。当细胞铺满细胞培养瓶底、达80%～90%融合时，倾弃旧培养液，以DMEM基础培养液或PBS液洗涤2次，每次30 s。加入0.25%胰蛋白酶+0.02%二乙胺四乙酸（EDTA）混合液1.0 mL （体积比为1︰1），于37 ℃条件下孵育2～3 min，待细胞收缩变圆、部分开始悬浮时，以10%胎牛血清终止胰蛋白酶的作用。用吸管反复吹打后收集细胞悬液并离心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），弃去上清液。用含10%胎牛血清的完全培养液重悬，调整细胞密度至1×106个/mL，接种于培养瓶中，进行传代培养，以用于细胞移植。
1.2.2 大鼠骨髓MSCs的表面抗原鉴定
取第4代MSCs制成单细胞悬液（密度为1×106个/mL），接种到铺有纤维连接蛋白包被的盖玻片的6孔板中，隔日换液1次。至第5天时取出盖玻片，将细胞爬片冲洗干净后，室温下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS液冲洗3次，每次2 min；加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），室温下静置10 min，再用PBS液冲洗3次，每次2 min；滴加10%封闭羊血清（液体覆盖盖玻片即可），37 ℃下孵育30 min；分别滴加CD44、CD29及CD34抗体（稀释浓度均为1︰100），同时用PBS液作为一抗设置阴性对照（未设阳性对照），37 ℃条件下孵育1 h；加非生物素二抗，37 ℃孵育60 min；以PBS溶液冲洗3次，每次2 min。最后行DAB显色、冲洗及封片后镜检。
1.2.3 ALF模型的建立及骨髓MSCs移植
取24只健康的8周龄雌性SD大鼠，按900 mg/kg D-氨基半乳糖行腹腔注射，同时按10 μg/kg于尾静脉注入肿瘤坏死因子-α （TNF-α），再随机（抽签法）分成2组，即实验组及空白对照组，每组12只。实验组大鼠于建模24 h后在无菌条件下开腹，于脾脏实质植入0.5 mL （2×107个/mL）雄性MSCs悬液。空白对照组大鼠于脾内注射0.5 mL生理盐水，其余操作同实验组。于移植前后观察大鼠的一般情况，至处死大鼠时结束观察。
1.2.4 实时定量PCR法检测肝脏Y性别决定区基因（SRY基因）的表达
移植后4周处死2组存活大鼠，采用实时定量PCR法检测大鼠肝脏中SRY基因的表达。RNA抽提采用Trizol法提取，操作按Trizol试剂说明书进行。测定RNA的浓度和纯度，要求吸光度（A）值达到A260/A280≥1.80。将RNA逆转录为cDNA，步骤按逆转录试剂盒说明书进行。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物见表 1。PCR扩增采用20.0 μL体系：超纯水13.0 μL、10×pcr buffer 2.0 μL，Mg2+ 2.0 μL （25 mmol/L），脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.5 μL （25 mmol/L），上下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），Taqman探针0.3 μL（20 μmol/L），Taq酶0.2 μL （5 U/mL），cDNA模板1.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后终止反应。SRY基因的表达水平采用2-△△Ct法计算，其中Ct为循环阈值。本实验重复测量了3次。
表1
PCR过程中所使用的引物
Table1.
PCR primers which were used in the process
1.2.5 肝脏组织病理学检查
将造模48 h后刚死亡的大鼠及移植后4周存活大鼠的肝脏取下，均于肝最大右叶相同部位取一小块肝组织，约1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大，以10%中性缓冲甲醛液固定7～48 h，石蜡包埋，4 μm厚切片，行HE染色。
1.2.6 移植前后检测肝功能
2组大鼠均于移植前，移植后72 h、1周及2周用毛细管沿眼底静脉丛采血约2.0 mL，离心（3 500 r/min，r=19.0 cm，10 min），取血清0.1 mL。在全自动生化分析检测仪上检测ALT、TBIL及ALB水平。
1.3 统计学方法
计量数据采用均数±标准差（
2 结果
2.1 骨髓MSCs的培养情况
骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，镜下可见细胞呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁，呈圆形，少部分伸出伪足而呈多角形。72 h换液后，可见少量梭形、星形及多角形细胞分散贴壁生长，呈逗号状或短棒状（图 1A）；6～7 d左右可见放射状排列的细胞集落，集落大小不一，细胞核较大、核仁清晰可见。12～14 d时细胞呈80%～90%融合，细胞的突起变长，排列呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁，逐步伸展为三角形及多角形，其增殖迅速，呈均匀分布生长，6～7 d时可铺满培养皿形成单层（图 1B）。
图1
示骨髓MSCs的培养结果（倒置相差显微镜 ×100）。1A：原代培养3 d；2：第1代培养1 d 图 2 示第4代骨髓MSCs表面抗原的免疫组化染色鉴定结果（SP ×100）。2A：CD29呈阳性表达；2B：CD44呈阳性表达；2C：CD34呈阴性表达；2D：阴性对照组未见着色 图 3 示大鼠肝脏的病理学观察结果（HE ×100）。3A：空白对照组移植后48 h；3B：实验组移植后4周；3C和3D：空白对照组移植后4周
Figure1.
Culture results of MSCs （Inverted phase contrast microscope ×100）. 1A：The third day during primary culture；1B：The first day during the first generation Figure 2 The identification of surface antigen of MSCs in the fourth generation by immumohistochemical staining （SP ×100）.2A：Positive expression of CD29 was observed in MSCs of rat；2B：Positive expression of CD44 was observed in MSCs of rat；2C：Negative expression of CD34 was observed in MSCs of rat；2D：No positive expression was found in negative control group Figure 3 HE staining results of liver tissues of rats （HE ×100）. 3A：48 hours after model establishment of blank control group；3B：4 weeks after transplantation in experimental group；3C and 3D：4 weeks after transplantation in blank control group
2.2 骨髓MSCs表面抗原的鉴定
免疫组化染色结果显示，第4代骨髓MSCs中CD29和CD44呈阳性表达，阳性细胞表现为胞浆呈棕色至棕褐色，在细胞核周围最明显；而CD34未见阳性表达。阴性对照均未见着色（图 2）。
2.3 骨髓MSCs移植前后大鼠的一般情况观察
2组大鼠在注射药物后均出现中毒性肝损害，于注射药物24 h开始表现为精神萎靡、食欲减退及尿色变黄。注射药物后48 h出现活动减少、嗜睡、少饮少食及尿色深黄。移植前2组大鼠均未出现死亡，移植后72 h内2组均出现死亡，其中实验组死亡7只，空白对照组死亡9只。ALF大鼠在注射药物后若能够存活过3 d，一般不会再发生死亡。3 d后2组大鼠的活动逐渐增加，进食量增多，小便颜色变淡。实验组和空白对照组在移植72 h及以后分别存活5只和3只大鼠，存活率分别为41.7%和25.0%，2组比较差异有统计学意义（χ2=48.00，P<0.05），实验组较高。
2.4 2组大鼠肝脏SRY基因的表达结果
移植4周后，实验组大鼠肝脏中能够检测到SRY雄性基因的表达 〔（3.36±1.16）×10-6〕；而在空白对照组大鼠肝脏中未能够检测到SRY雄性基因的表达。
2.5 肝脏组织学病理HE染色
空白对照组造模48 h时，大部分肝小叶结构消失，肝组织呈大片状坏死伴出血，网状支架塌陷，大量的中性粒细胞浸润（图 3A）。移植后4周，实验组的肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦结构较规整，肝细胞核呈圆形（图 3B）；空白对照组的肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列不明显，肝细胞体积增大，肝窦结构不规整，肝组织结构紊乱，纤维化组织明显，呈假小叶形成倾向（图 3C和图 3D）。
2.6 骨髓MSCs移植前后大鼠肝功能的变化
2组大鼠骨髓MSCs移植前后的ALT、TBIL及ALB水平检测结果见表 2。由表 2可见，2组大鼠移植前的ALT、TBIL及ALB水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。移植后与空白对照组比较，实验组各时点的ALT和TBIL水平均较低（P<0.05）；移植后1周和2周，实验组的ALB水平均高于空白对照组（P<0.05），而移植后72 h的差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
2组大鼠骨髓MSCs移植前后ALT、TBIL及ALB水平检测结果（3 讨论
在细胞移植治疗ALF中，MSCs已显示出强大的优势，主要表现在以下4个方面：①MSCs具备增殖和分化的潜能，能够分化为肝样细胞[4-8]；②一般成年个体均具备MSCs的利用条件；③MSCs的免疫原性较弱；④MSCs来源广泛，收集容易，体外可大量增殖，在临床上具有巨大的应用潜能[9-10]。MSCs的移植部位选择争议较大，主要有肝实质、脾实质、门静脉、周围静脉等。肝脏是较理想的移植部位，但会加重肝脏的继发性损伤。脾脏属于门静脉系统，选择脾实质进行移植，既可避免经门静脉注射可能造成的血管栓塞，又可避免经外周静脉注射发生向肝脏定植率不高的状况。在本实验中，笔者的亲身体会是脾脏组织的韧性适宜，移植部位不会发生出血，也不会发生移植液溢出，是较合适的移植场所。
有效的标记细胞是进一步研究骨髓MSCs治疗效果和探讨其治疗机理的基础所在。目前常用的标记方法主要有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记法、BrdU标记法、染色体标记法、特定基因标记法等[10-18]。本实验将雄性大鼠的骨髓MSCs移植到雌性大鼠模型体内，采用实时定量PCR法检测雌性大鼠肝脏内SRY基因的表达。此方法使骨髓MSCs在移植前无需体外特殊标记，细胞活力未受影响。本实验从雌性大鼠肝脏中检测到了SRY基因的表达，表明采用SRY基因作为示踪是可行的，且是安全有效的。本实验结果表明，MSCs在脾内移植后，受体肝脏内检测到了SRY基因的表达，表明骨髓MSCs经脾移植后，能够迁徙并定居于受损的肝脏内，从而可能进一步参与受损肝脏功能的修复。骨髓MSCs这一迁徙和附着的机理是什么呢?目前这一系列过程鲜为人知，可能是因为损伤的肝脏分泌某种细胞因子或通过其他机理促使骨髓MSCs向肝脏迁徙并定居，进而可能在ALF大鼠肝脏中转化为有功能的肝细胞，促进了肝功能的恢复。Hatch等[19]研究循环骨髓细胞肝脏种植的机理时发现，当肝脏严重受损时，存活的肝细胞分泌间质衍生因子1 （SDF1），而进入肝脏的骨髓细胞表达此因子的受体即趋化因子受体4 （CXCR4），推测此因子在骨髓细胞迁徙并定居于肝脏的过程中起重要作用。研究[20-21]表明，受损的肝脏能释放一些化学物质来招募骨髓MSCs向肝脏迁徙并定居。众所周知，肝功能衰竭发生时，体内的免疫环境也发生了变化。洪冬玲等[22]在研究异体MSCs在小鼠体内的踪迹时发现，肝脏等免疫器官在受到致敏影响时，其对迁徙的骨髓MSCs具有一定的吸附作用，从而阻止了正常状态下MSCs向骨髓的归巢。
本实验结果显示，在肝功能衰竭的情况下，将骨髓MSCs移植于脾内，实验组的病理学改变轻于空白对照组，而且该组血清生化指标较空白对照组有明显改善，ALB水平在移植后1周明显增加，表明骨髓MSCs移植对ALF有明显的治疗作用。其可能的机理是：①移植的的骨髓MSCs在ALF内环境作用下，逐渐向肝样细胞分化，发挥了部分肝细胞的功能。②骨髓MSCs可能分泌某些细胞因子参与受损肝脏内环境的调节，刺激肝细胞再生[23-24]。研究[25-27]发现，肝脏功能在受到损害时能够使骨髓MSCs产生多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）等，促使血管再生及肝功能损伤的修复。其中HGF是生物活性最广泛的生长因子之一[28-29]。它最早是于1984年由日本的中村敏一教授从大鼠血浆中分离得到的，其结构实质是含728个氨基酸的肝素结合糖蛋白[30]。它能够启动肝再生，刺激肝细胞进行有丝分裂，在肝组织损伤修复中发挥着重要作用[31]。
综上所述，骨髓MSCs移植治疗ALF是一个非常复杂而有序的过程，对其在临床应用方面的研究也仅处于起步阶段。随着人们对骨髓MSCs的不断认识，以及对肝再生机理的进一步深入研究，骨髓MSCs治疗ALF有望取得突破性的进展。
我国是肝病大国，肝功能衰竭是各种肝病患者的死亡原因之一。肝细胞移植（HTx）是治疗暴发性肝功能衰竭（FHF）的一种有效的方法。肝移植动物模型及临床应用均取得了一定的效果[1]，但其存在供体短缺、移植肝细胞增殖困难等问题。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）强大的增殖能力及分化潜能为解决上述难题开辟了新的途径，具有简便易行、对受体影响小、应用灵活、价格相对低廉等优点。有关骨髓干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究[2]已取得了可喜的成果，但骨髓MSCs的移植部位、移植后是否进入肝实质、是否可分化为肝细胞、移植后受体肝功能的恢复等问题目前仍有争议。本实验通过成功分离、鉴定大鼠骨髓MSCs后，进行急性肝功能衰竭（ALF）大鼠模型的脾内移植，于移植后检测肝功能指标以研究移植细胞是否发挥肝细胞功能，并取受体大鼠肝脏检测是否有移植细胞迁移，以为更好地利用骨髓MSCs治疗肝功能衰竭奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
选用6周龄健康雄性清洁级SD大鼠1只（体质量150 g）用于获取骨髓MSCs；另选用8周龄健康雌性清洁级SD大鼠24只，体质量150～200 g，用于制备ALF模型。实验动物均由南通大学实验动物中心提供。主要试剂：胎牛血清购自杭州四季青公司，CD44、CD29及CD34兔抗大鼠购自武汉博士德公司，DMEM培养液为美国GIBCO公司产品，实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，PV-9000即用型二步法（非生物素）检测试剂盒购自北京海诚远宏科技有限公司，丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒（速率法）、白蛋白（ALB）测定试剂盒（溴甲酚绿法）及总胆红素（TBIL）测定试剂盒（钡酸盐法）均购自中生北控生物科技股份有限公司。主要实验仪器：2323-2 CO2培养箱（美国Shel Lab公司），ckx41倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），7500fast型qPCR仪（美国Applied biosystems公司），日立7180型全自动生化分析仪（美国应用生物系统中国公司）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠骨髓MSCs的获取、培养和传代
采用颈椎脱臼法处死1只雄性大鼠，在无菌条件下剥离出胫骨及股骨，剪去两端，以DMEM基础培养液冲出骨髓，以5.0 mL注射器反复抽吸获得的骨髓，经200目筛网过滤制成单细胞悬液（此处密度可大可小，悬起细胞即可）。将单细胞悬液置水平离心机中离心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），弃上清液。MSCs的培养方法参照赵瑛[3]的方法并适当改进。将细胞悬液以4×105个/cm2的密度接种于DMEM完全培养液中（含有青霉素0.1 U/L，链霉素0.1 μg/L，10%胎牛血清），置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱中培养。3 d后全量换液，以后每2天或3天全量换液1次。换液前后在倒置相差显微镜下观察细胞的形态及生长情况。当细胞铺满细胞培养瓶底、达80%～90%融合时，倾弃旧培养液，以DMEM基础培养液或PBS液洗涤2次，每次30 s。加入0.25%胰蛋白酶+0.02%二乙胺四乙酸（EDTA）混合液1.0 mL （体积比为1︰1），于37 ℃条件下孵育2～3 min，待细胞收缩变圆、部分开始悬浮时，以10%胎牛血清终止胰蛋白酶的作用。用吸管反复吹打后收集细胞悬液并离心（1 000 r/min，r=10.7 cm，5 min），弃去上清液。用含10%胎牛血清的完全培养液重悬，调整细胞密度至1×106个/mL，接种于培养瓶中，进行传代培养，以用于细胞移植。
1.2.2 大鼠骨髓MSCs的表面抗原鉴定
取第4代MSCs制成单细胞悬液（密度为1×106个/mL），接种到铺有纤维连接蛋白包被的盖玻片的6孔板中，隔日换液1次。至第5天时取出盖玻片，将细胞爬片冲洗干净后，室温下用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS液冲洗3次，每次2 min；加入0.3%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100），室温下静置10 min，再用PBS液冲洗3次，每次2 min；滴加10%封闭羊血清（液体覆盖盖玻片即可），37 ℃下孵育30 min；分别滴加CD44、CD29及CD34抗体（稀释浓度均为1︰100），同时用PBS液作为一抗设置阴性对照（未设阳性对照），37 ℃条件下孵育1 h；加非生物素二抗，37 ℃孵育60 min；以PBS溶液冲洗3次，每次2 min。最后行DAB显色、冲洗及封片后镜检。
1.2.3 ALF模型的建立及骨髓MSCs移植
取24只健康的8周龄雌性SD大鼠，按900 mg/kg D-氨基半乳糖行腹腔注射，同时按10 μg/kg于尾静脉注入肿瘤坏死因子-α （TNF-α），再随机（抽签法）分成2组，即实验组及空白对照组，每组12只。实验组大鼠于建模24 h后在无菌条件下开腹，于脾脏实质植入0.5 mL （2×107个/mL）雄性MSCs悬液。空白对照组大鼠于脾内注射0.5 mL生理盐水，其余操作同实验组。于移植前后观察大鼠的一般情况，至处死大鼠时结束观察。
1.2.4 实时定量PCR法检测肝脏Y性别决定区基因（SRY基因）的表达
移植后4周处死2组存活大鼠，采用实时定量PCR法检测大鼠肝脏中SRY基因的表达。RNA抽提采用Trizol法提取，操作按Trizol试剂说明书进行。测定RNA的浓度和纯度，要求吸光度（A）值达到A260/A280≥1.80。将RNA逆转录为cDNA，步骤按逆转录试剂盒说明书进行。以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物见表 1。PCR扩增采用20.0 μL体系：超纯水13.0 μL、10×pcr buffer 2.0 μL，Mg2+ 2.0 μL （25 mmol/L），脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.5 μL （25 mmol/L），上下游引物各0.5 μL （10 μmol/L），Taqman探针0.3 μL（20 μmol/L），Taq酶0.2 μL （5 U/mL），cDNA模板1.0 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后终止反应。SRY基因的表达水平采用2-△△Ct法计算，其中Ct为循环阈值。本实验重复测量了3次。
表1
PCR过程中所使用的引物
Table1.
PCR primers which were used in the process
1.2.5 肝脏组织病理学检查
将造模48 h后刚死亡的大鼠及移植后4周存活大鼠的肝脏取下，均于肝最大右叶相同部位取一小块肝组织，约1.5 cm×1.5 cm×0.4 cm大，以10%中性缓冲甲醛液固定7～48 h，石蜡包埋，4 μm厚切片，行HE染色。
1.2.6 移植前后检测肝功能
2组大鼠均于移植前，移植后72 h、1周及2周用毛细管沿眼底静脉丛采血约2.0 mL，离心（3 500 r/min，r=19.0 cm，10 min），取血清0.1 mL。在全自动生化分析检测仪上检测ALT、TBIL及ALB水平。
1.3 统计学方法
计量数据采用均数±标准差（
2 结果
2.1 骨髓MSCs的培养情况
骨髓单个核细胞接种于培养瓶后，镜下可见细胞呈圆形，大小不一，悬浮于培养液中。24 h后部分细胞开始贴壁，呈圆形，少部分伸出伪足而呈多角形。72 h换液后，可见少量梭形、星形及多角形细胞分散贴壁生长，呈逗号状或短棒状（图 1A）；6～7 d左右可见放射状排列的细胞集落，集落大小不一，细胞核较大、核仁清晰可见。12～14 d时细胞呈80%～90%融合，细胞的突起变长，排列呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁，逐步伸展为三角形及多角形，其增殖迅速，呈均匀分布生长，6～7 d时可铺满培养皿形成单层（图 1B）。
图1
示骨髓MSCs的培养结果（倒置相差显微镜 ×100）。1A：原代培养3 d；2：第1代培养1 d 图 2 示第4代骨髓MSCs表面抗原的免疫组化染色鉴定结果（SP ×100）。2A：CD29呈阳性表达；2B：CD44呈阳性表达；2C：CD34呈阴性表达；2D：阴性对照组未见着色 图 3 示大鼠肝脏的病理学观察结果（HE ×100）。3A：空白对照组移植后48 h；3B：实验组移植后4周；3C和3D：空白对照组移植后4周
Figure1.
Culture results of MSCs （Inverted phase contrast microscope ×100）. 1A：The third day during primary culture；1B：The first day during the first generation Figure 2 The identification of surface antigen of MSCs in the fourth generation by immumohistochemical staining （SP ×100）.2A：Positive expression of CD29 was observed in MSCs of rat；2B：Positive expression of CD44 was observed in MSCs of rat；2C：Negative expression of CD34 was observed in MSCs of rat；2D：No positive expression was found in negative control group Figure 3 HE staining results of liver tissues of rats （HE ×100）. 3A：48 hours after model establishment of blank control group；3B：4 weeks after transplantation in experimental group；3C and 3D：4 weeks after transplantation in blank control group
2.2 骨髓MSCs表面抗原的鉴定
免疫组化染色结果显示，第4代骨髓MSCs中CD29和CD44呈阳性表达，阳性细胞表现为胞浆呈棕色至棕褐色，在细胞核周围最明显；而CD34未见阳性表达。阴性对照均未见着色（图 2）。
2.3 骨髓MSCs移植前后大鼠的一般情况观察
2组大鼠在注射药物后均出现中毒性肝损害，于注射药物24 h开始表现为精神萎靡、食欲减退及尿色变黄。注射药物后48 h出现活动减少、嗜睡、少饮少食及尿色深黄。移植前2组大鼠均未出现死亡，移植后72 h内2组均出现死亡，其中实验组死亡7只，空白对照组死亡9只。ALF大鼠在注射药物后若能够存活过3 d，一般不会再发生死亡。3 d后2组大鼠的活动逐渐增加，进食量增多，小便颜色变淡。实验组和空白对照组在移植72 h及以后分别存活5只和3只大鼠，存活率分别为41.7%和25.0%，2组比较差异有统计学意义（χ2=48.00，P<0.05），实验组较高。
2.4 2组大鼠肝脏SRY基因的表达结果
移植4周后，实验组大鼠肝脏中能够检测到SRY雄性基因的表达 〔（3.36±1.16）×10-6〕；而在空白对照组大鼠肝脏中未能够检测到SRY雄性基因的表达。
2.5 肝脏组织学病理HE染色
空白对照组造模48 h时，大部分肝小叶结构消失，肝组织呈大片状坏死伴出血，网状支架塌陷，大量的中性粒细胞浸润（图 3A）。移植后4周，实验组的肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦结构较规整，肝细胞核呈圆形（图 3B）；空白对照组的肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列不明显，肝细胞体积增大，肝窦结构不规整，肝组织结构紊乱，纤维化组织明显，呈假小叶形成倾向（图 3C和图 3D）。
2.6 骨髓MSCs移植前后大鼠肝功能的变化
2组大鼠骨髓MSCs移植前后的ALT、TBIL及ALB水平检测结果见表 2。由表 2可见，2组大鼠移植前的ALT、TBIL及ALB水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。移植后与空白对照组比较，实验组各时点的ALT和TBIL水平均较低（P<0.05）；移植后1周和2周，实验组的ALB水平均高于空白对照组（P<0.05），而移植后72 h的差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
2组大鼠骨髓MSCs移植前后ALT、TBIL及ALB水平检测结果（3 讨论
在细胞移植治疗ALF中，MSCs已显示出强大的优势，主要表现在以下4个方面：①MSCs具备增殖和分化的潜能，能够分化为肝样细胞[4-8]；②一般成年个体均具备MSCs的利用条件；③MSCs的免疫原性较弱；④MSCs来源广泛，收集容易，体外可大量增殖，在临床上具有巨大的应用潜能[9-10]。MSCs的移植部位选择争议较大，主要有肝实质、脾实质、门静脉、周围静脉等。肝脏是较理想的移植部位，但会加重肝脏的继发性损伤。脾脏属于门静脉系统，选择脾实质进行移植，既可避免经门静脉注射可能造成的血管栓塞，又可避免经外周静脉注射发生向肝脏定植率不高的状况。在本实验中，笔者的亲身体会是脾脏组织的韧性适宜，移植部位不会发生出血，也不会发生移植液溢出，是较合适的移植场所。
有效的标记细胞是进一步研究骨髓MSCs治疗效果和探讨其治疗机理的基础所在。目前常用的标记方法主要有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记法、BrdU标记法、染色体标记法、特定基因标记法等[10-18]。本实验将雄性大鼠的骨髓MSCs移植到雌性大鼠模型体内，采用实时定量PCR法检测雌性大鼠肝脏内SRY基因的表达。此方法使骨髓MSCs在移植前无需体外特殊标记，细胞活力未受影响。本实验从雌性大鼠肝脏中检测到了SRY基因的表达，表明采用SRY基因作为示踪是可行的，且是安全有效的。本实验结果表明，MSCs在脾内移植后，受体肝脏内检测到了SRY基因的表达，表明骨髓MSCs经脾移植后，能够迁徙并定居于受损的肝脏内，从而可能进一步参与受损肝脏功能的修复。骨髓MSCs这一迁徙和附着的机理是什么呢?目前这一系列过程鲜为人知，可能是因为损伤的肝脏分泌某种细胞因子或通过其他机理促使骨髓MSCs向肝脏迁徙并定居，进而可能在ALF大鼠肝脏中转化为有功能的肝细胞，促进了肝功能的恢复。Hatch等[19]研究循环骨髓细胞肝脏种植的机理时发现，当肝脏严重受损时，存活的肝细胞分泌间质衍生因子1 （SDF1），而进入肝脏的骨髓细胞表达此因子的受体即趋化因子受体4 （CXCR4），推测此因子在骨髓细胞迁徙并定居于肝脏的过程中起重要作用。研究[20-21]表明，受损的肝脏能释放一些化学物质来招募骨髓MSCs向肝脏迁徙并定居。众所周知，肝功能衰竭发生时，体内的免疫环境也发生了变化。洪冬玲等[22]在研究异体MSCs在小鼠体内的踪迹时发现，肝脏等免疫器官在受到致敏影响时，其对迁徙的骨髓MSCs具有一定的吸附作用，从而阻止了正常状态下MSCs向骨髓的归巢。
本实验结果显示，在肝功能衰竭的情况下，将骨髓MSCs移植于脾内，实验组的病理学改变轻于空白对照组，而且该组血清生化指标较空白对照组有明显改善，ALB水平在移植后1周明显增加，表明骨髓MSCs移植对ALF有明显的治疗作用。其可能的机理是：①移植的的骨髓MSCs在ALF内环境作用下，逐渐向肝样细胞分化，发挥了部分肝细胞的功能。②骨髓MSCs可能分泌某些细胞因子参与受损肝脏内环境的调节，刺激肝细胞再生[23-24]。研究[25-27]发现，肝脏功能在受到损害时能够使骨髓MSCs产生多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）等，促使血管再生及肝功能损伤的修复。其中HGF是生物活性最广泛的生长因子之一[28-29]。它最早是于1984年由日本的中村敏一教授从大鼠血浆中分离得到的，其结构实质是含728个氨基酸的肝素结合糖蛋白[30]。它能够启动肝再生，刺激肝细胞进行有丝分裂，在肝组织损伤修复中发挥着重要作用[31]。
综上所述，骨髓MSCs移植治疗ALF是一个非常复杂而有序的过程，对其在临床应用方面的研究也仅处于起步阶段。随着人们对骨髓MSCs的不断认识，以及对肝再生机理的进一步深入研究，骨髓MSCs治疗ALF有望取得突破性的进展。
