引用本文： 尚献会, 李建国, 范振海, 兑丹华. MCP-1在SAP大鼠胰腺及肠黏膜组织中的表达. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(7): 822-826. doi: 10.7507/1007-9424.20140196 复制
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的病理生理机理复杂，其发病机理尚未完全阐明。目前普遍认为可能是多因素共同作用的结果，如胰腺的微循环障碍、白细胞过度活化-炎性因子级联瀑布效应、胰腺腺泡细胞“钙超载”、细胞凋亡、肠道细菌移位等[1]。近年的研究[2]发现，SAP的发病机理主要与始发的胰腺细胞内事件、炎症反应等密切相关，而细胞因子和炎症反应失平衡在SAP的发病机理中的重要地位已得到了公认[3]。在SAP时，炎症细胞既能产生促炎因子，也能产生抗炎因子。众多的炎症介质如NO、IL-10、趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、核因子-κB、TNF-α、血小板活化因子（PAF）等均参与了疾病的发生与发展，其中趋化因子起着重要的作用。趋化因子中的MCP-1不仅是一种趋化物，亦是一种调节几种单核细胞功能参数的细胞因子[4]，可以趋化单核细胞、诱导单核细胞液中游离Ca2+浓度的增加和呼吸爆发（respiratory burst），也能诱导CD11c、CD11b、IL-1及IL-2的表达。Rau等[5]的临床研究发现，有局部并发症或远处器官衰竭的SAP患者其血浆MCP-1浓度明显升高，且MCP-1升高的程度与远处器官衰竭的严重程度密切相关。本研究通过复制SAP模型，检测SAP大鼠胰腺和肠黏膜组织中MCP-1 mRNA表达情况，旨在为SAP的诊断治疗提供一个新的靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
清洁级SD大鼠24只，由第三军医大学野战外科研究所动物室提供，动物质量合格证号SCXK-（军）2007017；PCR反应试剂购于宝生物工程（大连）有限公司；大鼠IL-10 ELISA试剂盒及大鼠MCP-1 ELISA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxydase，DAO）试剂盒购于南京建成科技有限公司；牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）。
1.2 动物分组及SAP模型制备
将24只SD大鼠按随机数字表法随机分为对照组（n=12）和SAP模型组（n=12）2组。参照Aho等[6]的方法并加以改进制作SAP大鼠模型：实验大鼠术前12 h禁食不禁水，应用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉动物，取上腹正中切口入腹，显露胆胰管，于肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胆管；然后用胰岛素注射针由十二指肠前壁斜行进针，经乳头部插入胆胰管，再以0.1 mL/min的速度匀速向胆胰管内注入3%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g），注射完毕后拔出针头，用小动脉夹夹闭胆胰管进入十二指肠的开口2 min，然后关腹，术毕；术后大鼠自由饮水、禁食。对照组大鼠开腹后仅翻动肠管后关腹，未作其他处理。2组分别在制模后12及24 h分别随机选取6只大鼠采血样及胰腺组织和回肠组织标本备检。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 血清MCP-1、IL-10、淀粉酶（AMY）和DAO水平检测
模型制备后12及24 h应用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉动物，于下腔静脉取血5 mL，离心（3 000r/min，r=5 cm）10 min后留置血清样本，采用ELISA法检测血清中MCP-1及IL-10水平；采用比色法测定血清中AMY水平及DAO水平。
1.3.2 胰腺组织及回肠组织的病理学改变观察
分别取1.0 cm×0.3 cm×0.2 cm大的胰腺组织和1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大的回肠组织，用10%甲醛液固定、石蜡包埋，4μm厚切片，HE染色，于光镜下观察胰腺组织及回肠组织的病理学改变，并以Schimidt评分标准[7]对胰腺组织的病理学改变进行评分。
1.3.3 胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA表达的检测
切取1.0 cm×0.3 cm×0.2 cm大胰腺组织及1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大回肠组织，标本于-80℃低温保存，采用real-time PCR（RT-PCR）法检测胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA的表达（参照试剂盒说明书操作），用参照基因的△Ct法相对定量分析，以Bio-rad公司提供的基因表达分析软件Genex xls进行数据处理。RT-PCR的引物见表 1。
表1
RT-PCR的引物对
Table1.
Primer sequences used in RT-PCR
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0分析统计软件包进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组大鼠血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平检测结果
SAP组12及24 h血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平均明显高于对照组（P＜0.01），见表 2。
表2
2组大鼠血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平检测结果（2.2 2组大鼠胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA表达检测结果
12及24 h SAP组大鼠胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA的表达均明显高于对照组（P＜0.01），12 h时分别上调了8倍和6倍，24 h时则分别上调了10倍和12倍；且MCP-1 mRNA在胰腺组织中的表达要高于回肠组织（P＜0.01）。见表 3。
表3
2组大鼠胰腺组织及回肠组织中MCP-1 mRNA表达的变化（pg/mL，2.3 2组大鼠回肠及胰腺组织的病理学改变
对照组大鼠12及24 h均未见腹水；SAP组大鼠12及24 h腹水量分别为（7.1±1.5）mL和（9.2±1.5）mL。①回肠组织病理形态学改变：对照组回肠黏膜结构完整，可见较多淋巴滤泡反应性增生；SAP组回肠黏膜腺体分泌明显增多，部分被覆上皮脱落，淋巴滤泡反应性增生，回肠外膜层间质血管扩张充血伴小状灶出血，可见少量中性粒细胞浸润。②胰腺组织病理形态学改变：对照组胰腺结构完整，间质内可见极少量淋巴细胞浸润；SAP组胰腺小叶结构欠清，可见小灶状腺泡结构破坏，细胞液化、坏死，间质血管扩张充血伴较多中性粒细胞浸润。具体见图 1及图 2。胰腺组织的病理学评分对照组12及24 h均为0分，而SAP组12 h为（9.2±1.6）分，24 h为（11.6±2.2）分，明显高于对照组（P＜0.01）。
图1
示2组大鼠回肠组织的病理学检查结果（HE×400）。1A：12 h对照组；1B：12 h SAP组；1C：24 h对照组；1D：24 h SAP组 图 2 示2组大鼠胰腺组织的病理学检查结果（HE×400）。2A：12 h对照组；2B：12 h SAP组；2C：24 h对照组；2D：24 h SAP组
Figure1.
Pathological results of ileum tissues of rats in 2 groups(HE×400). 1A: 12 h control group; 1B: 12 h SAP group; 1C: 24 h control group; 1D: 24 h SAP group Figure 2 Pathological results of pancreas tissues of rats in 2 groups(HE×400). 2A: 12 h control group; 2B: 12 h SAP group; 2C: 24 h control group; 2D: 24 h SAP group
3 讨论
SAP不仅是胰腺的局部炎症病变，而且是涉及胰外多个脏器的全身性疾病，可引起全身炎症反应综合征（SIRS）、多器官功能障碍综合征（MODS）、弥散性血管内凝血（DIC）、休克等，甚至是死亡，病死率可高达20%～30% [8-9]。肠屏障功能障碍（intestine barrier functional disturbance，IBFD）是导致SAP死亡率居高不下的主要原因之一[10]。临床上常见的SAP发病是由于胆道疾病、胰管梗塞、十二指肠乳头临近部病变以及暴饮暴食等 ，导致SAP产生。一方面，胰酶激活，胰腺组织消化以及胰腺微循环改变均可导致白细胞过度激活而释放TNF-α、IL-1、IL-6等炎症介质，继而导致炎症失控；另一方面，多种细胞因子和炎症介质的释放是造成肠黏膜屏障损伤、肠道通透性增加和肠源性感染的原因[11-14]。进一步激发SIRS的发生，而发展为MODS。通过检测外周血中DAO水平可以反映肠上皮细胞的成熟度和完整性，其变化可反映肠黏膜屏障的功能状态[15]。DAO是肠道上皮细胞的标志酶，大部分存在于哺乳动物小肠黏膜绒毛上皮层，当肠上皮细胞受损后则释放入血，使血中DAO升高。因此DAO是反映肠上皮细胞完整性的血浆标志物，也是反映小肠结构功能较为理想的指标[16]。吴承堂等[17]对狗急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）模型研究发现，肠黏膜绒毛顶端上皮破损，肠黏膜通透性升高，外周血DAO水平发生显著变化，提示肠黏膜上皮完整性的破坏。血浆DAO水平的升高和降低，与病理检验证实的肠黏膜结构的破坏与恢复是一致的[18]。本实验结果表明：SAP组胰腺损伤严重，同时伴有回肠组织损伤，测血清DAO的水平明显高于对照组（P＜0.01）。因此，保护肠黏膜屏障、减少肠道细菌易位，在SAP的治疗中就显得十分重要[19]。
在SAP时，趋化因子的合成与释放对于炎性介质的局部损伤及全身播散起重要作用[20-21]，Rau等[5]的临床研究发现，有局部并发症或远处器官衰竭的SAP患者其血浆趋化因子MCP-1浓度明显升高；在腺泡细胞中的产生也增加[22]；而MCP-1在正常胰腺组织中的表达无明显变化[23]。MCP-1升高的程度与远处器官衰竭的严重程度密切相关，提示MCP-1在SAP的局部并发症和远处脏器损伤的发生机理中扮演着重要角色。在SAP时，炎性细胞除产生促炎因子外，也能产生抗炎因子如IL-10，IL-10是以抑制辅助性T细胞1（Th1）克隆细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子，IL-10对炎性细胞因子网络具有负调节作用[24]，从而改善胰腺相关性微循环障碍[25]。本实验结果表明：SAP模型组12及24 h血清MCP-1及IL-10水平均较对照组升高（P＜0.01），同时还发现SAP模型组的MCP-1 mRNA在胰腺及回肠组织中的表达均上调，明显高于对照组（P＜0.01），且在胰腺组织中的表达高于回肠组织，这可能与其组织的结构和功能有关。
胰腺坏死和胰外器官衰竭是SAP的两大重要标志[26]。本研究发现，SAP时胰腺及回肠组织均存在损伤。光镜下见对照组大鼠胰腺结构完整，间质内可见极少量淋巴细胞浸润；回肠黏膜结构完整，可见较多淋巴滤波反应性增生。而SAP组大鼠胰腺小叶结构欠清，可见小灶状腺泡结构破坏，细胞液化、坏死，间质血管扩张充血伴较多中性粒细胞浸润；回肠黏膜腺体分泌明显增多，部分被覆上皮脱落，淋巴滤泡反应性增生，回肠外膜层间质血管扩张充血伴小灶状出血，可见少量中性粒细胞浸润。其结果表明：SAP组胰腺损伤严重，同时伴有回肠组织的损伤。
综上所述，本研究结果发现：①SAP组胰腺和回肠组织中MCP-1 mRNA的表达水平较对照组明显增高（P＜0.01）；②血清AMY、DAO、MCP-1及IL-10水平也较对照组明显升高（P＜0.01）；③SAP组胰腺及回肠组织细胞损害严重。上述研究结果表明，促炎因子MCP-1在胰腺及回肠组织中的表达上调，可加重胰腺和肠道组织损伤，加重病情；抑炎因子IL-10的水平也随病情加重而增高。由此推测，促炎因子MCP-1可加重胰腺和肠道组织的损伤，抑炎因子IL-10的水平随病情加重而增高，保持了致炎-抗炎因子的平衡，可能对减轻胰腺及肠道组织的损伤有一定作用。
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）的病理生理机理复杂，其发病机理尚未完全阐明。目前普遍认为可能是多因素共同作用的结果，如胰腺的微循环障碍、白细胞过度活化-炎性因子级联瀑布效应、胰腺腺泡细胞“钙超载”、细胞凋亡、肠道细菌移位等[1]。近年的研究[2]发现，SAP的发病机理主要与始发的胰腺细胞内事件、炎症反应等密切相关，而细胞因子和炎症反应失平衡在SAP的发病机理中的重要地位已得到了公认[3]。在SAP时，炎症细胞既能产生促炎因子，也能产生抗炎因子。众多的炎症介质如NO、IL-10、趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、核因子-κB、TNF-α、血小板活化因子（PAF）等均参与了疾病的发生与发展，其中趋化因子起着重要的作用。趋化因子中的MCP-1不仅是一种趋化物，亦是一种调节几种单核细胞功能参数的细胞因子[4]，可以趋化单核细胞、诱导单核细胞液中游离Ca2+浓度的增加和呼吸爆发（respiratory burst），也能诱导CD11c、CD11b、IL-1及IL-2的表达。Rau等[5]的临床研究发现，有局部并发症或远处器官衰竭的SAP患者其血浆MCP-1浓度明显升高，且MCP-1升高的程度与远处器官衰竭的严重程度密切相关。本研究通过复制SAP模型，检测SAP大鼠胰腺和肠黏膜组织中MCP-1 mRNA表达情况，旨在为SAP的诊断治疗提供一个新的靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
清洁级SD大鼠24只，由第三军医大学野战外科研究所动物室提供，动物质量合格证号SCXK-（军）2007017；PCR反应试剂购于宝生物工程（大连）有限公司；大鼠IL-10 ELISA试剂盒及大鼠MCP-1 ELISA试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司；二胺氧化酶（diamine oxydase，DAO）试剂盒购于南京建成科技有限公司；牛磺胆酸钠（美国Sigma公司）。
1.2 动物分组及SAP模型制备
将24只SD大鼠按随机数字表法随机分为对照组（n=12）和SAP模型组（n=12）2组。参照Aho等[6]的方法并加以改进制作SAP大鼠模型：实验大鼠术前12 h禁食不禁水，应用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉动物，取上腹正中切口入腹，显露胆胰管，于肝门侧用小动脉夹暂时夹闭胆管；然后用胰岛素注射针由十二指肠前壁斜行进针，经乳头部插入胆胰管，再以0.1 mL/min的速度匀速向胆胰管内注入3%牛磺胆酸钠（0.1 mL/100 g），注射完毕后拔出针头，用小动脉夹夹闭胆胰管进入十二指肠的开口2 min，然后关腹，术毕；术后大鼠自由饮水、禁食。对照组大鼠开腹后仅翻动肠管后关腹，未作其他处理。2组分别在制模后12及24 h分别随机选取6只大鼠采血样及胰腺组织和回肠组织标本备检。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 血清MCP-1、IL-10、淀粉酶（AMY）和DAO水平检测
模型制备后12及24 h应用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉动物，于下腔静脉取血5 mL，离心（3 000r/min，r=5 cm）10 min后留置血清样本，采用ELISA法检测血清中MCP-1及IL-10水平；采用比色法测定血清中AMY水平及DAO水平。
1.3.2 胰腺组织及回肠组织的病理学改变观察
分别取1.0 cm×0.3 cm×0.2 cm大的胰腺组织和1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大的回肠组织，用10%甲醛液固定、石蜡包埋，4μm厚切片，HE染色，于光镜下观察胰腺组织及回肠组织的病理学改变，并以Schimidt评分标准[7]对胰腺组织的病理学改变进行评分。
1.3.3 胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA表达的检测
切取1.0 cm×0.3 cm×0.2 cm大胰腺组织及1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大回肠组织，标本于-80℃低温保存，采用real-time PCR（RT-PCR）法检测胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA的表达（参照试剂盒说明书操作），用参照基因的△Ct法相对定量分析，以Bio-rad公司提供的基因表达分析软件Genex xls进行数据处理。RT-PCR的引物见表 1。
表1
RT-PCR的引物对
Table1.
Primer sequences used in RT-PCR
1.4 统计学方法
应用SPSS 13.0分析统计软件包进行统计分析。计量资料结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组大鼠血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平检测结果
SAP组12及24 h血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平均明显高于对照组（P＜0.01），见表 2。
表2
2组大鼠血清MCP-1、IL-10、AMY和DAO水平检测结果（2.2 2组大鼠胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA表达检测结果
12及24 h SAP组大鼠胰腺及回肠组织中MCP-1 mRNA的表达均明显高于对照组（P＜0.01），12 h时分别上调了8倍和6倍，24 h时则分别上调了10倍和12倍；且MCP-1 mRNA在胰腺组织中的表达要高于回肠组织（P＜0.01）。见表 3。
表3
2组大鼠胰腺组织及回肠组织中MCP-1 mRNA表达的变化（pg/mL，2.3 2组大鼠回肠及胰腺组织的病理学改变
对照组大鼠12及24 h均未见腹水；SAP组大鼠12及24 h腹水量分别为（7.1±1.5）mL和（9.2±1.5）mL。①回肠组织病理形态学改变：对照组回肠黏膜结构完整，可见较多淋巴滤泡反应性增生；SAP组回肠黏膜腺体分泌明显增多，部分被覆上皮脱落，淋巴滤泡反应性增生，回肠外膜层间质血管扩张充血伴小状灶出血，可见少量中性粒细胞浸润。②胰腺组织病理形态学改变：对照组胰腺结构完整，间质内可见极少量淋巴细胞浸润；SAP组胰腺小叶结构欠清，可见小灶状腺泡结构破坏，细胞液化、坏死，间质血管扩张充血伴较多中性粒细胞浸润。具体见图 1及图 2。胰腺组织的病理学评分对照组12及24 h均为0分，而SAP组12 h为（9.2±1.6）分，24 h为（11.6±2.2）分，明显高于对照组（P＜0.01）。
图1
示2组大鼠回肠组织的病理学检查结果（HE×400）。1A：12 h对照组；1B：12 h SAP组；1C：24 h对照组；1D：24 h SAP组 图 2 示2组大鼠胰腺组织的病理学检查结果（HE×400）。2A：12 h对照组；2B：12 h SAP组；2C：24 h对照组；2D：24 h SAP组
Figure1.
Pathological results of ileum tissues of rats in 2 groups(HE×400). 1A: 12 h control group; 1B: 12 h SAP group; 1C: 24 h control group; 1D: 24 h SAP group Figure 2 Pathological results of pancreas tissues of rats in 2 groups(HE×400). 2A: 12 h control group; 2B: 12 h SAP group; 2C: 24 h control group; 2D: 24 h SAP group
3 讨论
SAP不仅是胰腺的局部炎症病变，而且是涉及胰外多个脏器的全身性疾病，可引起全身炎症反应综合征（SIRS）、多器官功能障碍综合征（MODS）、弥散性血管内凝血（DIC）、休克等，甚至是死亡，病死率可高达20%～30% [8-9]。肠屏障功能障碍（intestine barrier functional disturbance，IBFD）是导致SAP死亡率居高不下的主要原因之一[10]。临床上常见的SAP发病是由于胆道疾病、胰管梗塞、十二指肠乳头临近部病变以及暴饮暴食等 ，导致SAP产生。一方面，胰酶激活，胰腺组织消化以及胰腺微循环改变均可导致白细胞过度激活而释放TNF-α、IL-1、IL-6等炎症介质，继而导致炎症失控；另一方面，多种细胞因子和炎症介质的释放是造成肠黏膜屏障损伤、肠道通透性增加和肠源性感染的原因[11-14]。进一步激发SIRS的发生，而发展为MODS。通过检测外周血中DAO水平可以反映肠上皮细胞的成熟度和完整性，其变化可反映肠黏膜屏障的功能状态[15]。DAO是肠道上皮细胞的标志酶，大部分存在于哺乳动物小肠黏膜绒毛上皮层，当肠上皮细胞受损后则释放入血，使血中DAO升高。因此DAO是反映肠上皮细胞完整性的血浆标志物，也是反映小肠结构功能较为理想的指标[16]。吴承堂等[17]对狗急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）模型研究发现，肠黏膜绒毛顶端上皮破损，肠黏膜通透性升高，外周血DAO水平发生显著变化，提示肠黏膜上皮完整性的破坏。血浆DAO水平的升高和降低，与病理检验证实的肠黏膜结构的破坏与恢复是一致的[18]。本实验结果表明：SAP组胰腺损伤严重，同时伴有回肠组织损伤，测血清DAO的水平明显高于对照组（P＜0.01）。因此，保护肠黏膜屏障、减少肠道细菌易位，在SAP的治疗中就显得十分重要[19]。
在SAP时，趋化因子的合成与释放对于炎性介质的局部损伤及全身播散起重要作用[20-21]，Rau等[5]的临床研究发现，有局部并发症或远处器官衰竭的SAP患者其血浆趋化因子MCP-1浓度明显升高；在腺泡细胞中的产生也增加[22]；而MCP-1在正常胰腺组织中的表达无明显变化[23]。MCP-1升高的程度与远处器官衰竭的严重程度密切相关，提示MCP-1在SAP的局部并发症和远处脏器损伤的发生机理中扮演着重要角色。在SAP时，炎性细胞除产生促炎因子外，也能产生抗炎因子如IL-10，IL-10是以抑制辅助性T细胞1（Th1）克隆细胞因子合成为特点的多效免疫调节因子，IL-10对炎性细胞因子网络具有负调节作用[24]，从而改善胰腺相关性微循环障碍[25]。本实验结果表明：SAP模型组12及24 h血清MCP-1及IL-10水平均较对照组升高（P＜0.01），同时还发现SAP模型组的MCP-1 mRNA在胰腺及回肠组织中的表达均上调，明显高于对照组（P＜0.01），且在胰腺组织中的表达高于回肠组织，这可能与其组织的结构和功能有关。
胰腺坏死和胰外器官衰竭是SAP的两大重要标志[26]。本研究发现，SAP时胰腺及回肠组织均存在损伤。光镜下见对照组大鼠胰腺结构完整，间质内可见极少量淋巴细胞浸润；回肠黏膜结构完整，可见较多淋巴滤波反应性增生。而SAP组大鼠胰腺小叶结构欠清，可见小灶状腺泡结构破坏，细胞液化、坏死，间质血管扩张充血伴较多中性粒细胞浸润；回肠黏膜腺体分泌明显增多，部分被覆上皮脱落，淋巴滤泡反应性增生，回肠外膜层间质血管扩张充血伴小灶状出血，可见少量中性粒细胞浸润。其结果表明：SAP组胰腺损伤严重，同时伴有回肠组织的损伤。
综上所述，本研究结果发现：①SAP组胰腺和回肠组织中MCP-1 mRNA的表达水平较对照组明显增高（P＜0.01）；②血清AMY、DAO、MCP-1及IL-10水平也较对照组明显升高（P＜0.01）；③SAP组胰腺及回肠组织细胞损害严重。上述研究结果表明，促炎因子MCP-1在胰腺及回肠组织中的表达上调，可加重胰腺和肠道组织损伤，加重病情；抑炎因子IL-10的水平也随病情加重而增高。由此推测，促炎因子MCP-1可加重胰腺和肠道组织的损伤，抑炎因子IL-10的水平随病情加重而增高，保持了致炎-抗炎因子的平衡，可能对减轻胰腺及肠道组织的损伤有一定作用。
