引用本文： 闫文貌, 程石. FasL在重症急性胰腺炎肺泡巨噬细胞凋亡机理中的作用. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(7): 869-871. doi: 10.7507/1007-9424.20140205 复制
重症急性胰腺炎（SAP）是临床常见危重疾病。尽管目前国内外对SAP的治疗已有了长足发展，但其病死率仍高达20％～30％，其中65％的SAP患者死于急性肺损伤（acute lung injury，ALI）[1]。笔者的前期研究[2-3]已发现肺泡巨噬细胞（AM）活化在SAP所致ALI中的主要作用，并已证实抑制AM活化，促使AM适度凋亡，可减轻SAP所致的ALI。然而，引起AM凋亡的机理较复杂，目前仍不清楚。本实验将通过观察FasL在AM中的表达，探讨FasL在AM凋亡机理中的作用，以为临床SAP所致肺损伤的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器
氯化钆G-7532（美国Sigma公司）；牛磺酸钠BR1383-1（晶美生物工程有限公司）；FasL抗体（美国SANTA公司）；胞浆蛋白提取试剂盒（北京普利莱公司）；EM208s透射电镜（荷兰Philips公司）；流式细胞仪FACACalibur（美国BD公司）。
1.2 实验动物及分组
雄性SD大鼠48只（中国医学科学院实验动物研究所提供），体质量250～300 g。按数字表法随机分成对照组、SAP组及氯化钆（GdCl3）组3组，每组16只。对照组：经胰胆管逆行注射生理盐水（1 mL/kg）；SAP组：经胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）制备SAP模型；GdCl3组在SAP模型制备成功后即刻按10 mg/kg经阴茎背静脉注射GdCl3。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 支气管肺泡灌洗及细胞培养
模型制备成功后6 h处死动物，取右肺下叶，备用。用4℃生理盐水经支气管行肺泡灌洗（每次10 mL，每只大鼠缓慢连续灌洗4次），收集灌洗液，并离心（1 500 r/min，r=12 cm，5 min）获取细胞沉淀，将细胞沉淀置于培养皿中，在37℃、5% CO2条件下培养1 h，用20℃1 640培养液冲洗2次，去除未黏附细胞，再以2 000 r/min（r=9 cm）离心10 min，所获细胞即为AM，备用。所有标本均重复检查2次。
1.3.2 肺组织病理学检查
取各组大鼠右肺下叶组织置10%甲醛溶液浸泡，石蜡包埋切片，行HE染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学改变。
1.3.3 透射电子显微镜观察AM
将AM团按常规方法制备电镜超薄切片，于透射电镜下观察AM的形态。
1.3.4 流式细胞仪检测AM凋亡情况
将前述获得的AM以Annexin V/FITC和碘化丙啶（PI）双染色法于流式细胞仪上样，检测各组AM凋亡情况。
1.3.5 免疫印记Western blot法检测AM中FasL蛋白表达水平
应用胞质蛋白制备试剂盒提取AM胞质蛋白并测定浓度后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果用计算机扫描，用图像分析系统测定目的条带与内参的光密度值，并取两者的比值作半定量分析。
1.4 统计学方法
计量数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 肺组织病理学改变
结果见图 1。由图 1可见，对照组肺泡组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见渗出液；SAP组肺间隔弥漫增厚，肺间质明显充血、水肿，有大量中性粒细胞浸润；GdCl3组肺组织改变与SAP组相比有所减轻，但仍有中性粒细胞浸润，肺呈轻度水肿改变。
图1
示各组肺组织的病理学改变（HE×200）。1A：对照组；1B：SAP组；1C：GdCl3组 图 2 示正常AM和典型的早期凋亡AM。2A：正常AM（TEM×5 000）；2B：黄
2.2 透射电子显微镜观察结果
GdCl3组AM可见典型早期凋亡形态学特征，即细胞核染色质边集，在细胞核膜周边聚集形成新月体；细胞体积缩小，细胞膜表面微绒毛和伪足减少或消失（图 2）；凋亡晚期可见凋亡小体。对照组及SAP组均无典型细胞凋亡形态出现。
2.3 流式细胞仪检测AM凋亡率结果
GdCl3组中AM凋亡率显著高于SAP组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；对照组大鼠的AM凋亡率较低，但高于SAP组，而低于GdCl3组，其差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。
表1
各组AM凋亡率级AM中FasL蛋白相对表达量检测结果（2.4 AM中FasL蛋白表达水平检测结果
GdCl3组与对照组及SAP组相比，AM中FasL蛋白相对表达量明显升高（P＜0.01），见图 3及表 1）。AM凋亡率与AM中FasL蛋白的表达呈明显的线性正相关关系（R2=0.766，P＜0.01）。
图3
示各组AM中的FasL蛋白表达
3 讨论
SAP是临床常见危重疾病，病情进展迅速，早期容易合并多种器官功能障碍，死亡率高[4]。因此，早期预防和治疗ALI对降低SAP的病死率及改善疾病的预后具有重要意义。
细胞凋亡在急性胰腺炎发病过程中具有特殊重要的作用，诱导腺泡细胞凋亡可减轻急性胰腺炎病情[5-8]。研究[9]表明，SAP发生后，AM大量活化而导致肺损伤；应用GdCl3处理AM，发现GdCl3能诱导SAP大鼠AM发生凋亡，抑制AM活化，减少AM分泌炎症介质，进而减轻肺损伤。但GdCl3如何诱导AM发生凋亡，其机理较复杂，目前仍不十分清楚。如果能探明AM凋亡的机理，将会为SAP肺损伤的早期预防和治疗提供有力的理论支持。
FasL是TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白，分子质量为31×103，糖基化后分子质量为36×103～43×103，Fas与其配体FasL结合可诱导细胞发生凋亡。Fas/FasL系统是多种疾病的细胞凋亡介质，参与外周T淋巴细胞克隆的清除和活化的T淋巴细胞的凋亡，具有免疫下调的作用[10-11]。在SAP中，通过Fas/FasL系统促进T淋巴细胞凋亡，引起CD4+细胞水平的降低而导致免疫功能的损害[12]。
近年来有研究[13-15]表明，Fas/FasL系统活化可能参与了AM的凋亡。Kitsmura等[13]发现，在内毒素诱导的小鼠ALI后，Fas/FasL在AM的表达均明显上调，且Fas/FasL表达的增强与AM凋亡的增加呈平行关系，提示Fas/FasL系统活化可能参与了AM凋亡的机理。Peng等[14]和Gallagher等[15-16]发现，Fas/FasL系统的激活可诱导急性胰腺炎肝脏Kupffer细胞发生凋亡，进而导致肝损伤。本实验结果发现，SAP时AM胞浆中FasL蛋白相对表达量较低，AM凋亡减少，而给予GdCl3干预治疗后，AM胞浆中FasL蛋白相对表达量明显增高，AM凋亡明显增多，且两者之间存在正相关关系。这表明GdCl3可能通过FasL激活而启动凋亡信号通路，促使AM凋亡。
Fas/FasL系统是启动细胞凋亡的上游途径之一，GdCl3是否同时诱导引起细胞凋亡上游途径的其他蛋白发生活化，以及引起AM凋亡的下游途径是什么，其诱导AM发生凋亡机理较复杂，尚需我们今后进一步研究验证。
重症急性胰腺炎（SAP）是临床常见危重疾病。尽管目前国内外对SAP的治疗已有了长足发展，但其病死率仍高达20％～30％，其中65％的SAP患者死于急性肺损伤（acute lung injury，ALI）[1]。笔者的前期研究[2-3]已发现肺泡巨噬细胞（AM）活化在SAP所致ALI中的主要作用，并已证实抑制AM活化，促使AM适度凋亡，可减轻SAP所致的ALI。然而，引起AM凋亡的机理较复杂，目前仍不清楚。本实验将通过观察FasL在AM中的表达，探讨FasL在AM凋亡机理中的作用，以为临床SAP所致肺损伤的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验试剂及仪器
氯化钆G-7532（美国Sigma公司）；牛磺酸钠BR1383-1（晶美生物工程有限公司）；FasL抗体（美国SANTA公司）；胞浆蛋白提取试剂盒（北京普利莱公司）；EM208s透射电镜（荷兰Philips公司）；流式细胞仪FACACalibur（美国BD公司）。
1.2 实验动物及分组
雄性SD大鼠48只（中国医学科学院实验动物研究所提供），体质量250～300 g。按数字表法随机分成对照组、SAP组及氯化钆（GdCl3）组3组，每组16只。对照组：经胰胆管逆行注射生理盐水（1 mL/kg）；SAP组：经胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg）制备SAP模型；GdCl3组在SAP模型制备成功后即刻按10 mg/kg经阴茎背静脉注射GdCl3。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 支气管肺泡灌洗及细胞培养
模型制备成功后6 h处死动物，取右肺下叶，备用。用4℃生理盐水经支气管行肺泡灌洗（每次10 mL，每只大鼠缓慢连续灌洗4次），收集灌洗液，并离心（1 500 r/min，r=12 cm，5 min）获取细胞沉淀，将细胞沉淀置于培养皿中，在37℃、5% CO2条件下培养1 h，用20℃1 640培养液冲洗2次，去除未黏附细胞，再以2 000 r/min（r=9 cm）离心10 min，所获细胞即为AM，备用。所有标本均重复检查2次。
1.3.2 肺组织病理学检查
取各组大鼠右肺下叶组织置10%甲醛溶液浸泡，石蜡包埋切片，行HE染色，光学显微镜下观察肺组织的病理学改变。
1.3.3 透射电子显微镜观察AM
将AM团按常规方法制备电镜超薄切片，于透射电镜下观察AM的形态。
1.3.4 流式细胞仪检测AM凋亡情况
将前述获得的AM以Annexin V/FITC和碘化丙啶（PI）双染色法于流式细胞仪上样，检测各组AM凋亡情况。
1.3.5 免疫印记Western blot法检测AM中FasL蛋白表达水平
应用胞质蛋白制备试剂盒提取AM胞质蛋白并测定浓度后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果用计算机扫描，用图像分析系统测定目的条带与内参的光密度值，并取两者的比值作半定量分析。
1.4 统计学方法
计量数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 肺组织病理学改变
结果见图 1。由图 1可见，对照组肺泡组织结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见渗出液；SAP组肺间隔弥漫增厚，肺间质明显充血、水肿，有大量中性粒细胞浸润；GdCl3组肺组织改变与SAP组相比有所减轻，但仍有中性粒细胞浸润，肺呈轻度水肿改变。
图1
示各组肺组织的病理学改变（HE×200）。1A：对照组；1B：SAP组；1C：GdCl3组 图 2 示正常AM和典型的早期凋亡AM。2A：正常AM（TEM×5 000）；2B：黄
2.2 透射电子显微镜观察结果
GdCl3组AM可见典型早期凋亡形态学特征，即细胞核染色质边集，在细胞核膜周边聚集形成新月体；细胞体积缩小，细胞膜表面微绒毛和伪足减少或消失（图 2）；凋亡晚期可见凋亡小体。对照组及SAP组均无典型细胞凋亡形态出现。
2.3 流式细胞仪检测AM凋亡率结果
GdCl3组中AM凋亡率显著高于SAP组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；对照组大鼠的AM凋亡率较低，但高于SAP组，而低于GdCl3组，其差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。
表1
各组AM凋亡率级AM中FasL蛋白相对表达量检测结果（2.4 AM中FasL蛋白表达水平检测结果
GdCl3组与对照组及SAP组相比，AM中FasL蛋白相对表达量明显升高（P＜0.01），见图 3及表 1）。AM凋亡率与AM中FasL蛋白的表达呈明显的线性正相关关系（R2=0.766，P＜0.01）。
图3
示各组AM中的FasL蛋白表达
3 讨论
SAP是临床常见危重疾病，病情进展迅速，早期容易合并多种器官功能障碍，死亡率高[4]。因此，早期预防和治疗ALI对降低SAP的病死率及改善疾病的预后具有重要意义。
细胞凋亡在急性胰腺炎发病过程中具有特殊重要的作用，诱导腺泡细胞凋亡可减轻急性胰腺炎病情[5-8]。研究[9]表明，SAP发生后，AM大量活化而导致肺损伤；应用GdCl3处理AM，发现GdCl3能诱导SAP大鼠AM发生凋亡，抑制AM活化，减少AM分泌炎症介质，进而减轻肺损伤。但GdCl3如何诱导AM发生凋亡，其机理较复杂，目前仍不十分清楚。如果能探明AM凋亡的机理，将会为SAP肺损伤的早期预防和治疗提供有力的理论支持。
FasL是TNF家族Ⅱ型跨膜蛋白，分子质量为31×103，糖基化后分子质量为36×103～43×103，Fas与其配体FasL结合可诱导细胞发生凋亡。Fas/FasL系统是多种疾病的细胞凋亡介质，参与外周T淋巴细胞克隆的清除和活化的T淋巴细胞的凋亡，具有免疫下调的作用[10-11]。在SAP中，通过Fas/FasL系统促进T淋巴细胞凋亡，引起CD4+细胞水平的降低而导致免疫功能的损害[12]。
近年来有研究[13-15]表明，Fas/FasL系统活化可能参与了AM的凋亡。Kitsmura等[13]发现，在内毒素诱导的小鼠ALI后，Fas/FasL在AM的表达均明显上调，且Fas/FasL表达的增强与AM凋亡的增加呈平行关系，提示Fas/FasL系统活化可能参与了AM凋亡的机理。Peng等[14]和Gallagher等[15-16]发现，Fas/FasL系统的激活可诱导急性胰腺炎肝脏Kupffer细胞发生凋亡，进而导致肝损伤。本实验结果发现，SAP时AM胞浆中FasL蛋白相对表达量较低，AM凋亡减少，而给予GdCl3干预治疗后，AM胞浆中FasL蛋白相对表达量明显增高，AM凋亡明显增多，且两者之间存在正相关关系。这表明GdCl3可能通过FasL激活而启动凋亡信号通路，促使AM凋亡。
Fas/FasL系统是启动细胞凋亡的上游途径之一，GdCl3是否同时诱导引起细胞凋亡上游途径的其他蛋白发生活化，以及引起AM凋亡的下游途径是什么，其诱导AM发生凋亡机理较复杂，尚需我们今后进一步研究验证。
