引用本文： 徐丽, 孙慧萍, 李冬梅, 李霞, 曹军平. 七叶皂苷钠预防大鼠术后肠粘连的机制研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(8): 957-959. doi: 10.7507/1007-9424.20140231 复制
肠粘连是腹腔术后的一种常见并发症，发生率可高达80%～90% [1-2]，目前尚无理想的预防术后肠粘连药物供临床使用。七叶皂苷钠是从七叶树果实娑罗子中提取的三萜皂苷钠盐，具有抗炎、抗渗出、消水肿、改善血液循环等作用[3-5]。前期研究[6]发现，七叶皂苷钠能够预防腹腔术后肠粘连的形成。本研究从炎性细胞因子入手，探讨七叶皂苷钠预防术后肠粘连的机制，为其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠50只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。动物分笼饲养，适应性喂养1周后进行实验。
1.2 药品、试剂和主要仪器
注射用七叶皂苷钠，由北京四环科宝制药有限公司提供。地塞米松磷酸钠注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供。羟脯氨酸试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒均购自美国R & D公司。AC100-110型酶标仪，瑞士Tecan公司。
1.3 方法
1.3.1 Ellis法制备大鼠术后肠粘连模型[1 ]
取SD大鼠，禁食不禁水12 h后，麻醉、固定，腹部消毒，取下腹部正中切口，提出盲肠，置于纱布上约5 min，使浆膜干燥，以解剖刀片轻刮整个盲肠浆膜10遍，造成轻度渗血，然后以无齿镊夹住盲肠系膜动脉约2 min，造成暂时局部缺血。盲肠回纳入腹腔原位后以止血钳夹伤相应腹壁，常规关腹。
1.3.2 分组与给药
取造模成功的大鼠，按随机数字表法分为模型组（注射等体积蒸馏水）、地塞米松组（地塞米松5 mg/kg）、七叶皂苷钠组（注射七叶皂苷钠2 mg/kg），每组10只。另取10只大鼠开腹后立即缝合作为假手术组（注射等体积蒸馏水）。给药方式均采用尾静脉注射，造模前1 d给药1次，造模后继续给药3 d，1次/d。
1.3.3 检测指标
①细胞因子的检测。造模后1周，各组动物进行心脏采血，3 500 r/min（r=10 cm）离心5 min分离血清，采用双抗体夹心ELISA法上酶标仪检测TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平，操作按试剂盒说明书进行。②粘连程度分级。采血后处死动物，开腹观察肠粘连发生情况，并按Phillips 5级标准[7]进行分级：0级，无粘连；Ⅰ级，粘连面积小于20%，易分离；Ⅱ级，粘连面积20%～40%，分离后局部浆膜稍有损伤；Ⅲ级，粘连面积为40%～60%，分离后局部有损伤和渗血；Ⅳ级，粘连面积大于60%，组织粘连成团，分离困难。③羟脯氨酸水平检测。分级后，切除所有盲肠粘连区段，制备组织匀浆，3 500 r/min（r=10 cm）离心10 min后取上清液，分别测定羟脯氨酸和蛋白质含量，操作按试剂盒说明书进行。以羟脯氨酸和蛋白质含量之比（μg/g）来表示组织的羟脯氨酸水平。
1.3.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据分析，粘连程度分级采用秩和检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 七叶皂苷钠对肠粘连程度的影响
腹腔手术后1周，各组动物均存活。假手术组有1只发生粘连，模型组动物均发生粘连，七叶皂苷钠组的部分动物未见粘连或粘连程度较轻。与模型组比较，七叶皂苷钠组或地塞米松组的肠粘连程度明显改善（P＜0.01）。见表 1。
表1
各组术后肠粘连分级情况（例）
Table1.
Status of grading of intestinal adhesion in each group (case)
2.2 七叶皂苷钠对血清细胞因子表达的影响
模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显高于假手术组（P＜0.01）。七叶皂苷钠可明显降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。见表 2。
表2
各组大鼠血清炎症因子表达的比较（ng/L，2.3 七叶皂苷钠对粘连肠段羟脯氨酸水平的影响
术后粘连肠段羟脯氨酸水平模型组为（240.5±29.6）μg/g，明显高于假手术组的（118.8±20.0）μg/g；给药后，七叶皂苷钠组为（178.4±22.7）μg/g，地塞米松组为（169.2±18.9）μg/g，均明显低于模型组（P＜0.01）。
3 讨论
目前对于腹腔术后肠粘连的发生机制仍以炎症学说较流行[8]，认为腹膜损伤导致炎症渗出，改变了胶原合成和分解之间的平衡，进而产生纤维粘连[9]。组织粘连主要取决于胶原的合成，而羟脯氨酸是胶原合成的前体。Ozoğul等[10]研究发现，组织中羟脯氨酸水平与粘连程度分级呈线性正相关，标记的羟脯氨酸出现在损伤后的组织中，并随着组织的愈合而逐渐增多。因此，组织中羟脯氨酸水平是反映腹腔术后肠粘连程度的一个重要指标。
细胞因子在术后肠粘连形成中的作用正逐渐被认识并受到重视[11-12]。TNF-α在损伤后的炎症反应过程中起重要作用，如刺激其他介质包括IL-1、IL-6和血小板激活因子的释放[13]；通过刺激黏附分子的产生，促进中性粒细胞-上皮细胞间的粘连[14]。Kaidi等[15]研究发现，局部和全身高水平的TNF-α在术后短时间内与肠粘连形成的程度有密切联系，可作为粘连形成的一种标志物。另据报道[16]，早期阻断TNF-α活性有利于降低术后肠粘连的发生率。IL-1是机体组织受到损伤和发生炎症反应时做出急性反应的关键介质[17]。Saba等[18]研究发现，术后早期血清中较高水平的IL-1与腹膜粘连的形成显著相关，IL-1升高可作为术后发生肠粘连的可靠指标。IL-6是机体对损伤做出反应时分泌的多功能细胞因子，与免疫性增殖和新生物的形成过程有关[19]。Saba等[20]发现，术前给予抗IL-6抗体能减少肠损伤模型大鼠肠粘连形成且不影响伤口愈合，认为IL-6在刺激术后肠粘连形成中起作用。有临床研究[21]证实，IL-6是腹腔液中的正常成分，但在许多发生术后腹腔粘连患者中IL-6水平明显升高。
本研究观察了七叶皂苷钠对术后肠粘连大鼠血清中细胞因子表达的影响，结果表明，七叶皂苷钠对术后肠粘连有预防作用，能明显改善肠粘连程度，显著降低血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。这与王春霞等[22]关于常通口服液对术后肠粘连大鼠血清细胞因子的研究结果有相似之处。本研究结果提示，七叶皂苷钠预防术后肠粘连的机制可能与抑制炎症因子的过度表达，进而减轻腹腔的早期急性炎症反应有关。
肠粘连是腹腔术后的一种常见并发症，发生率可高达80%～90% [1-2]，目前尚无理想的预防术后肠粘连药物供临床使用。七叶皂苷钠是从七叶树果实娑罗子中提取的三萜皂苷钠盐，具有抗炎、抗渗出、消水肿、改善血液循环等作用[3-5]。前期研究[6]发现，七叶皂苷钠能够预防腹腔术后肠粘连的形成。本研究从炎性细胞因子入手，探讨七叶皂苷钠预防术后肠粘连的机制，为其临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD大鼠50只，雌雄各半，体质量（200±20）g，由河北医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（冀）2008-1-003。动物分笼饲养，适应性喂养1周后进行实验。
1.2 药品、试剂和主要仪器
注射用七叶皂苷钠，由北京四环科宝制药有限公司提供。地塞米松磷酸钠注射液，由天津金耀氨基酸有限公司提供。羟脯氨酸试剂盒和考马斯亮蓝试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒均购自美国R & D公司。AC100-110型酶标仪，瑞士Tecan公司。
1.3 方法
1.3.1 Ellis法制备大鼠术后肠粘连模型[1 ]
取SD大鼠，禁食不禁水12 h后，麻醉、固定，腹部消毒，取下腹部正中切口，提出盲肠，置于纱布上约5 min，使浆膜干燥，以解剖刀片轻刮整个盲肠浆膜10遍，造成轻度渗血，然后以无齿镊夹住盲肠系膜动脉约2 min，造成暂时局部缺血。盲肠回纳入腹腔原位后以止血钳夹伤相应腹壁，常规关腹。
1.3.2 分组与给药
取造模成功的大鼠，按随机数字表法分为模型组（注射等体积蒸馏水）、地塞米松组（地塞米松5 mg/kg）、七叶皂苷钠组（注射七叶皂苷钠2 mg/kg），每组10只。另取10只大鼠开腹后立即缝合作为假手术组（注射等体积蒸馏水）。给药方式均采用尾静脉注射，造模前1 d给药1次，造模后继续给药3 d，1次/d。
1.3.3 检测指标
①细胞因子的检测。造模后1周，各组动物进行心脏采血，3 500 r/min（r=10 cm）离心5 min分离血清，采用双抗体夹心ELISA法上酶标仪检测TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平，操作按试剂盒说明书进行。②粘连程度分级。采血后处死动物，开腹观察肠粘连发生情况，并按Phillips 5级标准[7]进行分级：0级，无粘连；Ⅰ级，粘连面积小于20%，易分离；Ⅱ级，粘连面积20%～40%，分离后局部浆膜稍有损伤；Ⅲ级，粘连面积为40%～60%，分离后局部有损伤和渗血；Ⅳ级，粘连面积大于60%，组织粘连成团，分离困难。③羟脯氨酸水平检测。分级后，切除所有盲肠粘连区段，制备组织匀浆，3 500 r/min（r=10 cm）离心10 min后取上清液，分别测定羟脯氨酸和蛋白质含量，操作按试剂盒说明书进行。以羟脯氨酸和蛋白质含量之比（μg/g）来表示组织的羟脯氨酸水平。
1.3.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据分析，粘连程度分级采用秩和检验，计量资料组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 七叶皂苷钠对肠粘连程度的影响
腹腔手术后1周，各组动物均存活。假手术组有1只发生粘连，模型组动物均发生粘连，七叶皂苷钠组的部分动物未见粘连或粘连程度较轻。与模型组比较，七叶皂苷钠组或地塞米松组的肠粘连程度明显改善（P＜0.01）。见表 1。
表1
各组术后肠粘连分级情况（例）
Table1.
Status of grading of intestinal adhesion in each group (case)
2.2 七叶皂苷钠对血清细胞因子表达的影响
模型组血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明显高于假手术组（P＜0.01）。七叶皂苷钠可明显降低血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平，明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。见表 2。
表2
各组大鼠血清炎症因子表达的比较（ng/L，2.3 七叶皂苷钠对粘连肠段羟脯氨酸水平的影响
术后粘连肠段羟脯氨酸水平模型组为（240.5±29.6）μg/g，明显高于假手术组的（118.8±20.0）μg/g；给药后，七叶皂苷钠组为（178.4±22.7）μg/g，地塞米松组为（169.2±18.9）μg/g，均明显低于模型组（P＜0.01）。
3 讨论
目前对于腹腔术后肠粘连的发生机制仍以炎症学说较流行[8]，认为腹膜损伤导致炎症渗出，改变了胶原合成和分解之间的平衡，进而产生纤维粘连[9]。组织粘连主要取决于胶原的合成，而羟脯氨酸是胶原合成的前体。Ozoğul等[10]研究发现，组织中羟脯氨酸水平与粘连程度分级呈线性正相关，标记的羟脯氨酸出现在损伤后的组织中，并随着组织的愈合而逐渐增多。因此，组织中羟脯氨酸水平是反映腹腔术后肠粘连程度的一个重要指标。
细胞因子在术后肠粘连形成中的作用正逐渐被认识并受到重视[11-12]。TNF-α在损伤后的炎症反应过程中起重要作用，如刺激其他介质包括IL-1、IL-6和血小板激活因子的释放[13]；通过刺激黏附分子的产生，促进中性粒细胞-上皮细胞间的粘连[14]。Kaidi等[15]研究发现，局部和全身高水平的TNF-α在术后短时间内与肠粘连形成的程度有密切联系，可作为粘连形成的一种标志物。另据报道[16]，早期阻断TNF-α活性有利于降低术后肠粘连的发生率。IL-1是机体组织受到损伤和发生炎症反应时做出急性反应的关键介质[17]。Saba等[18]研究发现，术后早期血清中较高水平的IL-1与腹膜粘连的形成显著相关，IL-1升高可作为术后发生肠粘连的可靠指标。IL-6是机体对损伤做出反应时分泌的多功能细胞因子，与免疫性增殖和新生物的形成过程有关[19]。Saba等[20]发现，术前给予抗IL-6抗体能减少肠损伤模型大鼠肠粘连形成且不影响伤口愈合，认为IL-6在刺激术后肠粘连形成中起作用。有临床研究[21]证实，IL-6是腹腔液中的正常成分，但在许多发生术后腹腔粘连患者中IL-6水平明显升高。
本研究观察了七叶皂苷钠对术后肠粘连大鼠血清中细胞因子表达的影响，结果表明，七叶皂苷钠对术后肠粘连有预防作用，能明显改善肠粘连程度，显著降低血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。这与王春霞等[22]关于常通口服液对术后肠粘连大鼠血清细胞因子的研究结果有相似之处。本研究结果提示，七叶皂苷钠预防术后肠粘连的机制可能与抑制炎症因子的过度表达，进而减轻腹腔的早期急性炎症反应有关。
