引用本文： 杨韵, 彭伟, 汪晓东, 唐恬, 段宝凤, 夏霖, 舒晔. miR21在不同分期直肠癌中的表达及意义. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(8): 971-975. doi: 10.7507/1007-9424.20140234 复制
直肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均位居前列[1]。直肠癌患者的预后取决于其初诊时的肿瘤分期（尤其是N、M分期），50%的患者初诊时已有局部或远处转移[2]。因此，为了更加有效地制定术前新辅助放化疗的方案，早期诊断和明确肿瘤分期显得尤为重要。临床上术前通常采用影像学检查如增强CT、MRI等估计肿瘤淋巴结转移情况（即N分期），但由于各种主、客观因素的影响，其准确度存在较大差异。因此，探寻一种客观、准确的预测直肠癌分期的指标具有重要的临床价值。MicroRNA是一类含18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，调控细胞分化、细胞周期及细胞凋亡[3]，其能形成微小RNA诱导沉默复合物（microRNA-induced silencing complex，miRISC），并与信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-untran-slated-regions，3′-UTR）特异性结合，致翻译抑制或mRNA降解，从而影响基因的转录后表达[4-5]。人类基因组中有30%的基因及其生物效应可能受microRNA调控[6-7]，亦包括肿瘤的发生与发展[8]。尽管目前各种microRNA的具体调控机理及功能尚未完全阐明，但多数研究[9-11]表明，microRNA的异常表达与多种肿瘤的发生和发展均有关。其中，miR21作为致癌microRNA的典型代表，已发现在一些肿瘤中存在高表达[12-15]；进一步的转化医学方面的研究[16-17]也提示microRNA可以用于诊断癌和判断预后。但目前尚缺乏miR21在不同分期直肠癌中的表达及意义的报道，miR21能否作为术前预测直肠癌分期的指标也值得探讨。故本研究旨在检测miR21在不同分期直肠癌中的表达量并讨论其临床意义及价值。
1 资料与方法
1.1 患者及组织资料
2012年8～10月期间在我院胃肠外科中心经病理检查确诊的直肠癌患者40例纳入本研究。纳入标准：①无家族性多发性结肠息肉病；②术前未接受新辅助放化疗；③无肠梗阻、肠穿孔及其他急腹症。纳入患者的直肠癌组织和相应癌旁正常组织（近侧距肿瘤5 cm以上的正常直肠组织）于术后将被冷藏于液氮中。由同一病理科医生对肿瘤进行术后肿瘤分期（TNM分期和Dukes分期）；同时，另一组固定的研究者对样品中的miR21表达量进行检测。2组检验者对组间检验结果互不知情。
1.2 microRNA Taq Man实时荧光定量检测组织中miR21的表达
使用Trizol抽提组织中总RNA。miR21、U6 snRNA和U47特异性探针由ABI公司定制。整个检测过程参照ABI公司的Taq Man microRNA检测方法（Taq Man microRNA assay protocol，4364031 Rev.E，01/2011）。U6 snRNA和U47两个内参表达量的几何平均数用以校正miR21的表达量[18]。Taq Man microRNA reverse transcription kit用于逆转录。每25μL反应管中包含5 ng总RNA、9.6μL 5×RT primer（1.6μL/基因）、0.3μL Rnase Inhibitor（20 U/μL）、2.5μL 10×RT buffer、1.6μL MultiScribe reverse tran-scriptase和0.25μL dNTPs（100 mmol/L）。反应样品将加入到PCR系统中，16℃反应30 min，42℃反应30 min，85℃反应5 min，最后降至4℃。Taq Man Universal PCR Master Mix Taq Man用于实时荧光定量。每3次技术重复（10μL/技术重复），包含2.4μL template、1.6μL 20×Taq Man microRNA assay mix和16μL 2×Taq Man Universal PCR buffer（带尿嘧啶DNA糖基化酶）。反应样品将加入到384孔反应盘中并在7900 HT定量系统内进行反应，50℃维持2 min，95℃维持10 min，接着40次循环95℃维持15 s，60℃维持1 min。miR21的相对定量采用2-ΔCt法即进行运算。
1.3 统计学方法
统计学分析采用IBM SPSS 20.0软件。miR21表达量均数的比较采用配对样本t检验或独立样本t检验。Tukey HSD检验法用于N0、N1、N2三组间miR21表达量的比较。受试者操作特征（ROC）曲线用于分析miR21在预测直肠癌分期时的敏感度及特异性。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 患者的临床资料
本组40例直肠癌患者中男23例，女17例；年龄（57.5±11.951）岁，中位年龄56.5岁；分化程度：中分化26例，低分化14例；T分期：T1期2例，T2期10例，T3期28例；N分期：N0期20例，N1期10例，N2期10例；M分期：M0期36例，M1期4例。Dukes分期：A期7例，B期12例，C期17例，D期4例。
2.2 miR21在直肠癌组织和相应癌旁正常组织中的表达量
miR21在直肠癌组织中的表达量明显高于相应癌旁正常组织（4.122±1.973比1.825±0.661，P=0.000），差异有统计学意义，见图 1。
图1
miR21在肿瘤组织和相应癌旁正常组织中的表达量
Figure1.
Expressions of miR21 in cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues
2.3 miR21在不同分期直肠癌中表达量的比较
miR21在有淋巴结转移组（N1～N2组）、Dukes分期C～D期组中的表达量明显高于无淋巴结转移组（N0组）和Dukes分期A～B期组，差异有统计学意义（P=0.019，P=0.021）。采用Tukey HSD检验法，对N0、N1、N2 3组分期直肠癌中miR21表达量进行比较发现，虽然N1组表达量高于N0组（4.148±2.876比3.391±1.171，P=0.530），N2组高于N1组（5.556±1.500比4.148±2.876，P=0.203），但差异均无统计学意义，而N2组中miR21表达量明显高于N0组（5.556±1.500比3.391±1.171，P=0.010）。miR21在直肠癌不同分化程度、不同T分期及不同M分期中表达量差异均无统计学意义（P=0.697，P=0.873，P=0.611）。见表 1。
表1
miR21在不同分期及分化程度直肠癌中表达量的比较（2.4 miR21预测直肠癌N分期和Dukes分期的评价
为了进一步评价miR21预测肿瘤N分期和Dukes分期的价值，ROC曲线分析（图 2、3）结果显示：miR21在预测淋巴结转移时（即区分N0和N1～N2时），其AUC值为0.698（95% CI为0.530～0.865），临界值为4.87，敏感度为50.0%，特异性为90.0%。在预测中晚期直肠癌时（即区分Dukes A～B期和C～D期时），临界值为5.12，其AUC值为0.689（95% CI为0.524～0.855），敏感度为42.9%，特异性为94.7%。
图2
miR21预测直肠癌淋巴结转移情况（即N1～N2期）
Figure2.
N1-N2 stage was distinguished from N0 stage by miR21
图3
miR21预测中晚期直肠癌（即Dukes C～D期）
Figure3.
Dukes C-D stage was distinguished from A-B stage by miR21
3 讨论
全球范围内每年约有123万人患结直肠癌，并有约60万患者死于结直肠癌[19]。随着其诊疗手段的不断进步，尤其是利用现代化检查手段对癌前病变的筛检，使得结直肠癌在一定程度上仍能可防可治[20]。特别是更加准确的术前肿瘤分期，能为术前新辅助放化疗方案的制定提供有力依据，进而更好地改善预后。目前，术前影像学检查如增强CT、MRI等是最为广泛使用的用于估计肿瘤淋巴结转移情况（即N分期）的检测手段，但由于各种主、客观因素（如阅片人经验差异、假阳性或假阴性淋巴结）的影响，其准确度存在较大差异（CT为22%～73%，MRI为39%～75%）[21]。因此，寻找一种敏感性及特异性均高的结直肠癌术前分期指标，具有很高的临床应用价值。
miR21作为促癌miRNA，在肿瘤中常为过表达状态，可负向调节某些抑癌基因的表达，如原肌球蛋白1（tropomyosin1，TPM1）、第10号染色体缺失的同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）基因、程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）基因及乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂（mammary serine proteaseinhibitor，Maspin）基因，miR-21通过作用于这些抗转移基因，在肿瘤的生长、浸润和转移方面起重要作用[22]。Asangani等[23]发现，miR21可下调PDCD4的表达，从而诱导肿瘤的发生、进展、浸润、金属蛋白酶激活，并抑制细胞凋亡。在体内、外试验中，Wang等[24]发现，若敲出PDCD4能下调上皮特异性蛋白的表达，同时上调间叶细胞特异性蛋白的表达，致使在创面愈合实验和博伊登室（体外趋化）实验中，细胞迁移能力明显增强。故miR21的高表达及PDCD4的低表达可导致上皮细胞-间充质细胞转换（EMT）并促进细胞迁移，此为肿瘤细胞转移的关键机制。Slaby等[25]发现结直肠癌组织中miR21高表达，且与淋巴结转移、远处转移和肿瘤分期密切相关。随后的一项包含有中国及美国结肠癌患者的队列研究[26]发现，miR21与患者预后也密切相关，其中高表达miR21与低生存率密切相关，且在Ⅲ期肿瘤患者中，这种高表达与化疗敏感性和早期复发均有关。
在本研究中，miR21在直肠癌组织中的表达水平明显高于相应癌旁正常组织中的表达水平，miR21在N1～N2期以及Dukes C～D期直肠癌组织中的表达明显高于N0期以及Dukes A～B期，结果提示，miR21高表达可能与肿瘤N分期（即淋巴结转移）和Dukes分期（即中晚期肿瘤）有潜在关联。miR21表达与肿瘤分化程度及T分期无关。另外，miR21在预测淋巴结转移时（即区分N0和N1～N2时），其AUC值为0.698，敏感度为50.0%，特异性为90.0%；在预测中晚期直肠癌时（即区分C＋D期和A＋B期时），其AUC值为0.689，敏感度为42.9%，特异性为94.7%，有一定的诊断价值。
综上所述，miR21可能是术前预测直肠癌N和Dukes分期的潜在新型肿瘤标志物。但由于本研究的样本量有限，microRNA定量技术的高成本以及其中逆转录和RT-PCR技术的高条件要求，miR21能否成为术前预测直肠癌N分期和Dukes分期的理想指标以及能否推广、应用还有大量的工作要做。
直肠癌是最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均位居前列[1]。直肠癌患者的预后取决于其初诊时的肿瘤分期（尤其是N、M分期），50%的患者初诊时已有局部或远处转移[2]。因此，为了更加有效地制定术前新辅助放化疗的方案，早期诊断和明确肿瘤分期显得尤为重要。临床上术前通常采用影像学检查如增强CT、MRI等估计肿瘤淋巴结转移情况（即N分期），但由于各种主、客观因素的影响，其准确度存在较大差异。因此，探寻一种客观、准确的预测直肠癌分期的指标具有重要的临床价值。MicroRNA是一类含18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，调控细胞分化、细胞周期及细胞凋亡[3]，其能形成微小RNA诱导沉默复合物（microRNA-induced silencing complex，miRISC），并与信使RNA（mRNA）的3′-非翻译区（3′-untran-slated-regions，3′-UTR）特异性结合，致翻译抑制或mRNA降解，从而影响基因的转录后表达[4-5]。人类基因组中有30%的基因及其生物效应可能受microRNA调控[6-7]，亦包括肿瘤的发生与发展[8]。尽管目前各种microRNA的具体调控机理及功能尚未完全阐明，但多数研究[9-11]表明，microRNA的异常表达与多种肿瘤的发生和发展均有关。其中，miR21作为致癌microRNA的典型代表，已发现在一些肿瘤中存在高表达[12-15]；进一步的转化医学方面的研究[16-17]也提示microRNA可以用于诊断癌和判断预后。但目前尚缺乏miR21在不同分期直肠癌中的表达及意义的报道，miR21能否作为术前预测直肠癌分期的指标也值得探讨。故本研究旨在检测miR21在不同分期直肠癌中的表达量并讨论其临床意义及价值。
1 资料与方法
1.1 患者及组织资料
2012年8～10月期间在我院胃肠外科中心经病理检查确诊的直肠癌患者40例纳入本研究。纳入标准：①无家族性多发性结肠息肉病；②术前未接受新辅助放化疗；③无肠梗阻、肠穿孔及其他急腹症。纳入患者的直肠癌组织和相应癌旁正常组织（近侧距肿瘤5 cm以上的正常直肠组织）于术后将被冷藏于液氮中。由同一病理科医生对肿瘤进行术后肿瘤分期（TNM分期和Dukes分期）；同时，另一组固定的研究者对样品中的miR21表达量进行检测。2组检验者对组间检验结果互不知情。
1.2 microRNA Taq Man实时荧光定量检测组织中miR21的表达
使用Trizol抽提组织中总RNA。miR21、U6 snRNA和U47特异性探针由ABI公司定制。整个检测过程参照ABI公司的Taq Man microRNA检测方法（Taq Man microRNA assay protocol，4364031 Rev.E，01/2011）。U6 snRNA和U47两个内参表达量的几何平均数用以校正miR21的表达量[18]。Taq Man microRNA reverse transcription kit用于逆转录。每25μL反应管中包含5 ng总RNA、9.6μL 5×RT primer（1.6μL/基因）、0.3μL Rnase Inhibitor（20 U/μL）、2.5μL 10×RT buffer、1.6μL MultiScribe reverse tran-scriptase和0.25μL dNTPs（100 mmol/L）。反应样品将加入到PCR系统中，16℃反应30 min，42℃反应30 min，85℃反应5 min，最后降至4℃。Taq Man Universal PCR Master Mix Taq Man用于实时荧光定量。每3次技术重复（10μL/技术重复），包含2.4μL template、1.6μL 20×Taq Man microRNA assay mix和16μL 2×Taq Man Universal PCR buffer（带尿嘧啶DNA糖基化酶）。反应样品将加入到384孔反应盘中并在7900 HT定量系统内进行反应，50℃维持2 min，95℃维持10 min，接着40次循环95℃维持15 s，60℃维持1 min。miR21的相对定量采用2-ΔCt法即进行运算。
1.3 统计学方法
统计学分析采用IBM SPSS 20.0软件。miR21表达量均数的比较采用配对样本t检验或独立样本t检验。Tukey HSD检验法用于N0、N1、N2三组间miR21表达量的比较。受试者操作特征（ROC）曲线用于分析miR21在预测直肠癌分期时的敏感度及特异性。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 患者的临床资料
本组40例直肠癌患者中男23例，女17例；年龄（57.5±11.951）岁，中位年龄56.5岁；分化程度：中分化26例，低分化14例；T分期：T1期2例，T2期10例，T3期28例；N分期：N0期20例，N1期10例，N2期10例；M分期：M0期36例，M1期4例。Dukes分期：A期7例，B期12例，C期17例，D期4例。
2.2 miR21在直肠癌组织和相应癌旁正常组织中的表达量
miR21在直肠癌组织中的表达量明显高于相应癌旁正常组织（4.122±1.973比1.825±0.661，P=0.000），差异有统计学意义，见图 1。
图1
miR21在肿瘤组织和相应癌旁正常组织中的表达量
Figure1.
Expressions of miR21 in cancer tissues and corresponding adjacent normal tissues
2.3 miR21在不同分期直肠癌中表达量的比较
miR21在有淋巴结转移组（N1～N2组）、Dukes分期C～D期组中的表达量明显高于无淋巴结转移组（N0组）和Dukes分期A～B期组，差异有统计学意义（P=0.019，P=0.021）。采用Tukey HSD检验法，对N0、N1、N2 3组分期直肠癌中miR21表达量进行比较发现，虽然N1组表达量高于N0组（4.148±2.876比3.391±1.171，P=0.530），N2组高于N1组（5.556±1.500比4.148±2.876，P=0.203），但差异均无统计学意义，而N2组中miR21表达量明显高于N0组（5.556±1.500比3.391±1.171，P=0.010）。miR21在直肠癌不同分化程度、不同T分期及不同M分期中表达量差异均无统计学意义（P=0.697，P=0.873，P=0.611）。见表 1。
表1
miR21在不同分期及分化程度直肠癌中表达量的比较（2.4 miR21预测直肠癌N分期和Dukes分期的评价
为了进一步评价miR21预测肿瘤N分期和Dukes分期的价值，ROC曲线分析（图 2、3）结果显示：miR21在预测淋巴结转移时（即区分N0和N1～N2时），其AUC值为0.698（95% CI为0.530～0.865），临界值为4.87，敏感度为50.0%，特异性为90.0%。在预测中晚期直肠癌时（即区分Dukes A～B期和C～D期时），临界值为5.12，其AUC值为0.689（95% CI为0.524～0.855），敏感度为42.9%，特异性为94.7%。
图2
miR21预测直肠癌淋巴结转移情况（即N1～N2期）
Figure2.
N1-N2 stage was distinguished from N0 stage by miR21
图3
miR21预测中晚期直肠癌（即Dukes C～D期）
Figure3.
Dukes C-D stage was distinguished from A-B stage by miR21
3 讨论
全球范围内每年约有123万人患结直肠癌，并有约60万患者死于结直肠癌[19]。随着其诊疗手段的不断进步，尤其是利用现代化检查手段对癌前病变的筛检，使得结直肠癌在一定程度上仍能可防可治[20]。特别是更加准确的术前肿瘤分期，能为术前新辅助放化疗方案的制定提供有力依据，进而更好地改善预后。目前，术前影像学检查如增强CT、MRI等是最为广泛使用的用于估计肿瘤淋巴结转移情况（即N分期）的检测手段，但由于各种主、客观因素（如阅片人经验差异、假阳性或假阴性淋巴结）的影响，其准确度存在较大差异（CT为22%～73%，MRI为39%～75%）[21]。因此，寻找一种敏感性及特异性均高的结直肠癌术前分期指标，具有很高的临床应用价值。
miR21作为促癌miRNA，在肿瘤中常为过表达状态，可负向调节某些抑癌基因的表达，如原肌球蛋白1（tropomyosin1，TPM1）、第10号染色体缺失的同源性磷酸酶-张力蛋白（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN）基因、程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）基因及乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂（mammary serine proteaseinhibitor，Maspin）基因，miR-21通过作用于这些抗转移基因，在肿瘤的生长、浸润和转移方面起重要作用[22]。Asangani等[23]发现，miR21可下调PDCD4的表达，从而诱导肿瘤的发生、进展、浸润、金属蛋白酶激活，并抑制细胞凋亡。在体内、外试验中，Wang等[24]发现，若敲出PDCD4能下调上皮特异性蛋白的表达，同时上调间叶细胞特异性蛋白的表达，致使在创面愈合实验和博伊登室（体外趋化）实验中，细胞迁移能力明显增强。故miR21的高表达及PDCD4的低表达可导致上皮细胞-间充质细胞转换（EMT）并促进细胞迁移，此为肿瘤细胞转移的关键机制。Slaby等[25]发现结直肠癌组织中miR21高表达，且与淋巴结转移、远处转移和肿瘤分期密切相关。随后的一项包含有中国及美国结肠癌患者的队列研究[26]发现，miR21与患者预后也密切相关，其中高表达miR21与低生存率密切相关，且在Ⅲ期肿瘤患者中，这种高表达与化疗敏感性和早期复发均有关。
在本研究中，miR21在直肠癌组织中的表达水平明显高于相应癌旁正常组织中的表达水平，miR21在N1～N2期以及Dukes C～D期直肠癌组织中的表达明显高于N0期以及Dukes A～B期，结果提示，miR21高表达可能与肿瘤N分期（即淋巴结转移）和Dukes分期（即中晚期肿瘤）有潜在关联。miR21表达与肿瘤分化程度及T分期无关。另外，miR21在预测淋巴结转移时（即区分N0和N1～N2时），其AUC值为0.698，敏感度为50.0%，特异性为90.0%；在预测中晚期直肠癌时（即区分C＋D期和A＋B期时），其AUC值为0.689，敏感度为42.9%，特异性为94.7%，有一定的诊断价值。
综上所述，miR21可能是术前预测直肠癌N和Dukes分期的潜在新型肿瘤标志物。但由于本研究的样本量有限，microRNA定量技术的高成本以及其中逆转录和RT-PCR技术的高条件要求，miR21能否成为术前预测直肠癌N分期和Dukes分期的理想指标以及能否推广、应用还有大量的工作要做。
