引用本文： 李文仿, 张丹峰, 王群, 赵宗彬, 王耕. 乳腺癌肿块表面皮肤浸润情况的临床研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(8): 976-979. doi: 10.7507/1007-9424.20140235 复制
Fisher等[1]提出乳腺癌是一个全身性疾病，不同手术方式对乳腺癌生存率影响并不是很明显。随后，多个医疗机构的大样本前瞻性试验证实了传统根治术同保乳手术在长期生存率方面无明显差异，从而使得乳腺癌的手术治疗模式由“可以耐受的最大治疗”转为“最小而有效的治疗”[2]。保乳手术因为其良好的美容效果，在欧美国家得到广泛开展，但确保手术边缘无肿瘤残留是手术成败的关键[3]。目前随着早中期乳腺癌乳腺再造手术的广泛开展，在行乳腺癌手术治疗的同时需要保留更多的乳腺皮肤，以利于乳腺癌手术后再造手术，但过多的乳腺肿瘤表面皮肤保留可能因皮肤早期浸润而导致肿瘤复发[4]。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）是子宫珠蛋白超家族成员之一，定位于11号染色体，具有乳腺组织特异性[5]。本研究通过巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测hMAM mRNA在乳腺癌组织中的表达，并检测乳腺癌患者肿块表面皮肤浸润情况，以期判断hMAM是否可为临床乳腺癌患者手术皮肤切除范围提供重要的临床资料。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2012年12月至2013年1月期间湖北医药学院附属太和医院病例，所有患者均为青年女性。乳腺纤维腺瘤15例，年龄（18.3±3.2）岁。乳腺增生症15例，年龄（36.3±7.3）岁。乳腺癌患者60例，年龄（44.5±6.3）岁；肿瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；腋窝淋巴结有转移27例，无转移33例。皮肤标本取自肿块表面中央0.5 cm×0.5 cm大小，所有皮肤组织标本均无局部肉眼可见皮肤浸润情况，所取皮肤深度约0.5 cm以内，冻存于液氮，备提取RNA用。
1.2 巢式RT-PCR方法检测hMAM mRNA在不同乳腺（癌）组织中的表达及其相应肿块表面皮肤浸润情况
引物设计参照文献[6]。hMAM引物序列均由上海生工技术服务有限公司合成。外引物：上游引物为5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物为5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGT-GAGC-3′；内引物：上游引物为5′-CTCCCAGCAC-TGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物为5′-CACCTC-AACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′；GAPDH为内参物，上游引物为5′-CCACCCATGGCAAATT-CCATGGCA-3′，下游引物为5′-TCTAGACGGCAG-GTAAGGTCCACC-3′。主要实验步骤：Trizol抽提细胞总RNA，第一步采用RT-PCR，反应体系如下：AMV/Tfl5x反应缓冲液10 mL，外引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP浓度为0.2 mmol/L，Mg2+浓度2 mmol/L，AMV 0.1 U/μL，Tfl DNA poly-merase 0.1 U/μL，RNA 5μL，加去离子水至总反应体积50μL，48℃条件下45 min逆转录，94℃条件下2 min行AMV RT灭活及RNA/cDNA引物变性，PCR反应条件：94℃30 s，58℃1 min，68℃1.5 min，共35个循环，70℃条件下延伸7 min。巢式第二步反应体系如下：AMV/Tfl5x反应缓冲液10μL，内引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，Tfl DNA polymerase 0.1 U/μL，反应中取第一次反应产物3μL，加无离子水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃3 min，94℃30 s，59℃1 min，68℃1 min，35个循环，然后70℃条件下延伸7 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色显示DNA条带，紫外光下显像，201 bp处出现DNA条带时判断为hMAM mRNA阳性结果。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0进行统计学分析。用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hMAM mRNA在不同乳腺（癌）组织中的表达情况
hMAM mRNA表达阳性率在乳腺纤维腺瘤组织中为40.00%（6/15），在乳腺增生组织中为53.33%（8/15），在乳腺癌组织中为83.33%（50/60），乳腺癌组织中hMAM mRNA表达阳性率较纤维腺瘤组织和乳腺增生组织明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。乳腺纤维腺瘤组织及乳腺增生组织表面皮肤均未检测出hMAM mRNA表达。60例乳腺癌患者肿块表面皮肤检测出hMAM mRNA阳性表达3例。
2.2 乳腺癌患者肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与临床病理特征的关系
乳腺癌肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与患者年龄、肿瘤直径及肿瘤分期无关（P＞0.05），但在腋窝淋巴结有转移及肿瘤距离乳头中央距离＜4 cm患者中，hMAM mRNA表达阳性率明显高于无腋窝淋巴结转移及肿瘤距离乳头中央距离≥4 cm者（P＜0.05）。见表 1。
表1
60例乳腺癌患者肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与临床病理特征的关系（例）
Table1.
Relationship of hMAM mRNA expression to clinicopathologic features in 60 patients with infiltration of breast cancer surface skin(case)
3 讨论
hMAM在乳腺组织中特异性高表达，乳腺癌患者hMAM蛋白水平升高可能与肿瘤的形成、发展和转移密切相关，而手术切除和（或）化疗后hMAM蛋白水平降低[7]。研究[8]发现，在卵巢、子宫、肺、睾丸、前列腺、结肠、肝脏、大脑等组织均不表达，而几乎专一表达在正常乳腺上皮和乳腺癌组织中，尤其在不同病理分级的乳腺癌组织中均可检测到hMAM表达，这使得hMAM有一定的乳腺组织特异性。本组60例乳腺癌组织中hMAM mRNA表达阳性率为83.33%，明显高于其在乳腺纤维腺瘤组织（40.00%）及乳腺增生组织（53.33%）中的表达阳性率，表明乳腺癌组织中hMAM mRNA高表达，而在乳腺良性疾病中表达较低。由于hMAM在乳腺癌组织中的特异性使得针对hMAM的乳腺癌靶向治疗得以研究和开发，可以进一步增强乳腺癌治疗的靶向性，以防造成对其他组织的伤害[9]。有文献[10]报道，在乳腺癌患者非乳腺组织检测出hMAM表达，这提示肿瘤细胞浸润或转移，乳腺癌患者外周血中检出hMAM提示乳腺癌发生血液转移，外周血中hMAM检出与乳腺癌病理分期相关，在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的外周血中hMAM检出率为82.9%，而在Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者的外周血中hMAM检出率为23.4%，而且外周血中hMAM检出提示较低的生存率，是患者不良预后的指标。外周血中hMAM检出也被用于乳腺癌患者存在循环肿瘤细胞的诊断，是患者无病生存率及总生存率较低的指标[5]。
从组织学发生来看，皮肤与乳腺组织发生于不同胚层，是完全不同的组织，乳腺癌肿块表面的皮肤不会因为靠近乳腺癌组织而发生癌变，而且无论是血液循环还是淋巴结转移途径，皮肤均不是其转移的靶点，但乳腺癌肿块可突破肿块与皮肤间的包膜，发生皮肤直接浸润[11]。Lookingbill等[12]发现，有1.3%（92/7316）的乳腺癌患者在诊断时有肿块表面皮肤受累，5.0%（367/7316）的患者有皮肤浸润。Ho等[13]对30例全乳切除术的标本进行分析后发现，Ⅰ期乳腺癌皮肤受累率为0，Ⅱ期乳腺癌皮肤受累率为4%。本组60例乳腺癌患者肿块表面皮肤检出hMAM mRNA阳性表达共3例，浸润率为5.00%（3/60），与文献报道基本一致，而且均为临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者。本组在乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病肿块表面皮肤未检出hMAM mRNA表达，这与皮肤与乳腺组织是发生于不同胚层的组织有关，虽然hMAM mRNA特异性表达于乳腺组织，乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病肿块中存在一定的hMAM mRNA表达，但乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病乳腺细胞一般不会迁移到皮肤，故未检出皮肤hMAM mRNA表达。乳腺癌再造手术需要尽可能保留皮肤及乳头和乳晕复合体，这样术后可保持乳腺对称，形状良好，还可减少术后疤痕形成，具有良好的美容效果，但如果皮肤或乳头乳晕复合体有肿瘤浸润则可导致术后复发和转移[14]。
乳腺癌患者腋窝淋巴结转移提示乳腺癌细胞已发生扩散，其肿瘤复发及发生转移可能性明显增高，治疗效果不理想[15-16]。淋巴结转移数目较多及具有较高的肿瘤级别患者，以及分子指标检测雌激素受体阴性患者，具有极低的无病生存率[17]。本组研究结果表明，腋窝淋巴结转移患者的乳腺癌肿块表面皮肤更易发生癌细胞浸润。文献[18]报道，肿块距离乳头乳晕复合体小于3 cm患者更易发生乳头乳晕复合体受累。本研究结果发现，乳腺癌肿块距离乳头中央距离小于4 cm的患者肿瘤更易发生局部皮肤浸润，提示中央区乳腺癌患者手术时需尽可能切除较多乳腺肿瘤表面皮肤。
总之，本研究结果表明，hMAM mRNA表达在乳腺癌组织中明显增高，可用作乳腺癌患者诊断的分子指标，而且乳腺癌患者中肿块表面皮肤浸润更多见于Ⅲ～Ⅳ期、腋窝淋巴结转移、肿块距离乳头中央区较近的患者。但由于本组样本量有限，获取乳腺肿瘤皮肤浸润的更加有价值的临床病理特征尚需进一步大样本研究。
Fisher等[1]提出乳腺癌是一个全身性疾病，不同手术方式对乳腺癌生存率影响并不是很明显。随后，多个医疗机构的大样本前瞻性试验证实了传统根治术同保乳手术在长期生存率方面无明显差异，从而使得乳腺癌的手术治疗模式由“可以耐受的最大治疗”转为“最小而有效的治疗”[2]。保乳手术因为其良好的美容效果，在欧美国家得到广泛开展，但确保手术边缘无肿瘤残留是手术成败的关键[3]。目前随着早中期乳腺癌乳腺再造手术的广泛开展，在行乳腺癌手术治疗的同时需要保留更多的乳腺皮肤，以利于乳腺癌手术后再造手术，但过多的乳腺肿瘤表面皮肤保留可能因皮肤早期浸润而导致肿瘤复发[4]。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）是子宫珠蛋白超家族成员之一，定位于11号染色体，具有乳腺组织特异性[5]。本研究通过巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测hMAM mRNA在乳腺癌组织中的表达，并检测乳腺癌患者肿块表面皮肤浸润情况，以期判断hMAM是否可为临床乳腺癌患者手术皮肤切除范围提供重要的临床资料。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2012年12月至2013年1月期间湖北医药学院附属太和医院病例，所有患者均为青年女性。乳腺纤维腺瘤15例，年龄（18.3±3.2）岁。乳腺增生症15例，年龄（36.3±7.3）岁。乳腺癌患者60例，年龄（44.5±6.3）岁；肿瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例；腋窝淋巴结有转移27例，无转移33例。皮肤标本取自肿块表面中央0.5 cm×0.5 cm大小，所有皮肤组织标本均无局部肉眼可见皮肤浸润情况，所取皮肤深度约0.5 cm以内，冻存于液氮，备提取RNA用。
1.2 巢式RT-PCR方法检测hMAM mRNA在不同乳腺（癌）组织中的表达及其相应肿块表面皮肤浸润情况
引物设计参照文献[6]。hMAM引物序列均由上海生工技术服务有限公司合成。外引物：上游引物为5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物为5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGT-GAGC-3′；内引物：上游引物为5′-CTCCCAGCAC-TGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物为5′-CACCTC-AACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′；GAPDH为内参物，上游引物为5′-CCACCCATGGCAAATT-CCATGGCA-3′，下游引物为5′-TCTAGACGGCAG-GTAAGGTCCACC-3′。主要实验步骤：Trizol抽提细胞总RNA，第一步采用RT-PCR，反应体系如下：AMV/Tfl5x反应缓冲液10 mL，外引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP浓度为0.2 mmol/L，Mg2+浓度2 mmol/L，AMV 0.1 U/μL，Tfl DNA poly-merase 0.1 U/μL，RNA 5μL，加去离子水至总反应体积50μL，48℃条件下45 min逆转录，94℃条件下2 min行AMV RT灭活及RNA/cDNA引物变性，PCR反应条件：94℃30 s，58℃1 min，68℃1.5 min，共35个循环，70℃条件下延伸7 min。巢式第二步反应体系如下：AMV/Tfl5x反应缓冲液10μL，内引物上游及下游引物各0.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Mg2+ 2 mmol/L，Tfl DNA polymerase 0.1 U/μL，反应中取第一次反应产物3μL，加无离子水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃3 min，94℃30 s，59℃1 min，68℃1 min，35个循环，然后70℃条件下延伸7 min。采用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色显示DNA条带，紫外光下显像，201 bp处出现DNA条带时判断为hMAM mRNA阳性结果。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0进行统计学分析。用χ2检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 hMAM mRNA在不同乳腺（癌）组织中的表达情况
hMAM mRNA表达阳性率在乳腺纤维腺瘤组织中为40.00%（6/15），在乳腺增生组织中为53.33%（8/15），在乳腺癌组织中为83.33%（50/60），乳腺癌组织中hMAM mRNA表达阳性率较纤维腺瘤组织和乳腺增生组织明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.05）。乳腺纤维腺瘤组织及乳腺增生组织表面皮肤均未检测出hMAM mRNA表达。60例乳腺癌患者肿块表面皮肤检测出hMAM mRNA阳性表达3例。
2.2 乳腺癌患者肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与临床病理特征的关系
乳腺癌肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与患者年龄、肿瘤直径及肿瘤分期无关（P＞0.05），但在腋窝淋巴结有转移及肿瘤距离乳头中央距离＜4 cm患者中，hMAM mRNA表达阳性率明显高于无腋窝淋巴结转移及肿瘤距离乳头中央距离≥4 cm者（P＜0.05）。见表 1。
表1
60例乳腺癌患者肿块表面皮肤中hMAM mRNA表达与临床病理特征的关系（例）
Table1.
Relationship of hMAM mRNA expression to clinicopathologic features in 60 patients with infiltration of breast cancer surface skin(case)
3 讨论
hMAM在乳腺组织中特异性高表达，乳腺癌患者hMAM蛋白水平升高可能与肿瘤的形成、发展和转移密切相关，而手术切除和（或）化疗后hMAM蛋白水平降低[7]。研究[8]发现，在卵巢、子宫、肺、睾丸、前列腺、结肠、肝脏、大脑等组织均不表达，而几乎专一表达在正常乳腺上皮和乳腺癌组织中，尤其在不同病理分级的乳腺癌组织中均可检测到hMAM表达，这使得hMAM有一定的乳腺组织特异性。本组60例乳腺癌组织中hMAM mRNA表达阳性率为83.33%，明显高于其在乳腺纤维腺瘤组织（40.00%）及乳腺增生组织（53.33%）中的表达阳性率，表明乳腺癌组织中hMAM mRNA高表达，而在乳腺良性疾病中表达较低。由于hMAM在乳腺癌组织中的特异性使得针对hMAM的乳腺癌靶向治疗得以研究和开发，可以进一步增强乳腺癌治疗的靶向性，以防造成对其他组织的伤害[9]。有文献[10]报道，在乳腺癌患者非乳腺组织检测出hMAM表达，这提示肿瘤细胞浸润或转移，乳腺癌患者外周血中检出hMAM提示乳腺癌发生血液转移，外周血中hMAM检出与乳腺癌病理分期相关，在Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌的外周血中hMAM检出率为82.9%，而在Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌患者的外周血中hMAM检出率为23.4%，而且外周血中hMAM检出提示较低的生存率，是患者不良预后的指标。外周血中hMAM检出也被用于乳腺癌患者存在循环肿瘤细胞的诊断，是患者无病生存率及总生存率较低的指标[5]。
从组织学发生来看，皮肤与乳腺组织发生于不同胚层，是完全不同的组织，乳腺癌肿块表面的皮肤不会因为靠近乳腺癌组织而发生癌变，而且无论是血液循环还是淋巴结转移途径，皮肤均不是其转移的靶点，但乳腺癌肿块可突破肿块与皮肤间的包膜，发生皮肤直接浸润[11]。Lookingbill等[12]发现，有1.3%（92/7316）的乳腺癌患者在诊断时有肿块表面皮肤受累，5.0%（367/7316）的患者有皮肤浸润。Ho等[13]对30例全乳切除术的标本进行分析后发现，Ⅰ期乳腺癌皮肤受累率为0，Ⅱ期乳腺癌皮肤受累率为4%。本组60例乳腺癌患者肿块表面皮肤检出hMAM mRNA阳性表达共3例，浸润率为5.00%（3/60），与文献报道基本一致，而且均为临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者。本组在乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病肿块表面皮肤未检出hMAM mRNA表达，这与皮肤与乳腺组织是发生于不同胚层的组织有关，虽然hMAM mRNA特异性表达于乳腺组织，乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病肿块中存在一定的hMAM mRNA表达，但乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症良性乳腺疾病乳腺细胞一般不会迁移到皮肤，故未检出皮肤hMAM mRNA表达。乳腺癌再造手术需要尽可能保留皮肤及乳头和乳晕复合体，这样术后可保持乳腺对称，形状良好，还可减少术后疤痕形成，具有良好的美容效果，但如果皮肤或乳头乳晕复合体有肿瘤浸润则可导致术后复发和转移[14]。
乳腺癌患者腋窝淋巴结转移提示乳腺癌细胞已发生扩散，其肿瘤复发及发生转移可能性明显增高，治疗效果不理想[15-16]。淋巴结转移数目较多及具有较高的肿瘤级别患者，以及分子指标检测雌激素受体阴性患者，具有极低的无病生存率[17]。本组研究结果表明，腋窝淋巴结转移患者的乳腺癌肿块表面皮肤更易发生癌细胞浸润。文献[18]报道，肿块距离乳头乳晕复合体小于3 cm患者更易发生乳头乳晕复合体受累。本研究结果发现，乳腺癌肿块距离乳头中央距离小于4 cm的患者肿瘤更易发生局部皮肤浸润，提示中央区乳腺癌患者手术时需尽可能切除较多乳腺肿瘤表面皮肤。
总之，本研究结果表明，hMAM mRNA表达在乳腺癌组织中明显增高，可用作乳腺癌患者诊断的分子指标，而且乳腺癌患者中肿块表面皮肤浸润更多见于Ⅲ～Ⅳ期、腋窝淋巴结转移、肿块距离乳头中央区较近的患者。但由于本组样本量有限，获取乳腺肿瘤皮肤浸润的更加有价值的临床病理特征尚需进一步大样本研究。
