引用本文： 蒋志伟, 汪涛, 汤礼军, 陈光宇, 黎鹏武, 郑晓博, 王科. 紧密连接蛋白1与重症急性胰腺炎大鼠胰腺微血管损伤关系的实验研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(9): 1114-1119. doi: 10.7507/1007-9424.20140267 复制
重症急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）
病程进展迅速，病情凶险，病死率高达20%～30% [1]，被称为“20世纪尚未攻克的医学堡垒”。有研究 [2-3]证实，导致SAP死亡率居高不下的主要原因为一些高发生率的“致死并发症”，而在这些并发症的发生发展过程中，血管通透性的改变都扮演着十分重要的角色。有研究[4]指出，毛细血管渗漏综合征（capillary leak syndrome，CLS）可能在SAP的病程发展中起决定性的作用，并与SAP互为因果。对于SAP的病理学过程，业已有了较为统一的认识，即胰腺发生局部病变后，大量炎症因子及毒素进入体循环，形成级联瀑布反应，并发全身多脏器的功能不全和衰竭。CLS发生的初始病理状态即为细胞旁途径的病理性开放，此为水、离子及大分子物质的“大门”。毛细血管屏障一般由机械屏障、化学屏障、免疫屏障等构成，与毛细血管渗透性关系最密切的为机械屏障，其由血管内皮细胞本身及紧密连接复合体组成。而构成紧密连接的众多蛋白中，紧密连接蛋白1（ZO-1蛋白）因其与其他成员蛋白的关系密切，因此在紧密连接中的地位也较重要。研究 [5]发现，ZO-1蛋白的破坏能较直接地影响紧密连接的屏障功能。归结起来就是，CLS的病理重点在于血管内皮细胞紧密连接的损伤，紧密连接损伤蛋白水平的重点在于ZO-1蛋白的异常表达。因此，本研究检测了SAP大鼠胰腺微血管中ZO-1蛋白的表达及血液中ZO-1蛋白的浓度情况，并探讨了其与SAP病程发展的联系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂与设备
选用健康雄性SPF级Wistar大鼠54只 （购自四川省资阳市达硕动物公司），体质量 200～250 g，6～8周龄，进行环境适应性喂养1周后，再进行实验。试剂：牛磺胆酸钠（Sigma公司），大鼠血清淀粉酶试剂盒（泛博生物公司），胰蛋白酶测定试剂盒（建成生物公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）及ZO-1蛋白的ELISA试剂盒（BD公司），ZO-1蛋白抗体（小鼠抗大鼠ZO-1蛋白及羊抗小鼠IgG，博士德生物公司）。设备：全自动生化分析仪（美国Beckman公司）、Bioreal550型酶标仪（美国Thermo公司）及BIO-TEK全自动酶标仪（美国Thermo公司）。
1.2 动物分组与模型制备
将48只大鼠按随机数字表法随机分为假手术组（SO）和SAP组，每组24只；另6只大鼠作为死亡大鼠的补充。实验前12 h禁食、不禁水。①SO组：腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后（SAP组同），行开腹手术，翻动胰腺后关腹。②SAP组：参照Aho等[6]的方法，开腹后以动脉夹夹闭肝门部胆管，经十二指肠乳头逆行行胰胆管穿刺，用静脉微量输液泵以3 mL/h的速度注射5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg），再用动脉夹夹闭近十二指肠端的胰胆管10 min。肉眼见胰腺组织发生充血、水肿、出血、坏死等改变后，表明大鼠SAP模型制备成功，关腹。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平检测
2组大鼠均分别于手术后6、12及24 h随机（随机数字表法）处死8只大鼠，采集腹主动脉血3～4 mL，以离心机离心（3 000 r/min，r=8 cm，10 min），取上层清夜置于-20℃冰箱中冻存，以待检测。分别采用全自动生化分析仪及酶标仪检测血液中血清淀粉酶及胰蛋白酶水平；采用ELISA法检测血液中IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平。操作均按试剂盒说明书进行。
1.3.2 HE染色
取胰腺组织1 g以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm厚切片，行苏木精-伊红（HE）染色，在光镜下观察胰腺组织的病理学改变，并进行病理学评分，病理学评分参照Schmidt等[7]的方法。
1.3.3 ZO-1蛋白的免疫组化染色
取胰腺组织1 g进行SP免疫组化染色。首先将组织以4%甲醛液固定，脱水，石蜡包埋，5μm厚连续切片。切片经常规脱蜡至水，以胃蛋白酶消化后滴加相应的小鼠抗大鼠ZO-1蛋白，4℃冰箱过夜；滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育2 h；以二氨基联苯胺（DAB）显色10 min后，用中性树胶封片。以正常Wistar大鼠胰腺组织行免疫组化染色后的切片为阳性对照，以未行免疫组化染色的切片为阴性对照。目标蛋白ZO-1蛋白为棕黄色颗粒，观察各时相胰腺组织棕黄色颗粒的表达情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组大鼠手术后的一般情况
SAP组大鼠造模成功后出现精神萎靡、活动量减少、食欲差及尿量少，且随时间延长，上述症状逐渐加重；而各时点SO组大鼠的一般情况与术前无明显差异。术后SO组大鼠均未出现死亡，而SAP组大鼠因肠道出血、坏死、大量胸腹水、重度腹腔感染等因素死亡（于造模后7、12、16及19 h分别死亡1、1、2及2只），6只死亡大鼠均予以重新造模补充。
2.2 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平检测结果
与同时点SO组比较，各时点SAP组的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平均较高（P＜0.05）。SO组内各时点间的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平的差异均无统计学意义（P＞0.05），而SAP组内除3个时点组的TNF-α水平比较差异无统计学意义之外（P＞0.05），3个时点组的其余指标均不全相同（P＜0.05）。①血清淀粉酶：SAP-6 h组和12 h组的血清淀粉酶水平均低于24 h组（P＜0.05），而6 h组和12 h组的差异无统计学意义（P＞0.05）；②胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白：SAP组内大鼠的胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白水平均随时点的延长逐渐升高，各时点两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。
表1
2组大鼠各时点的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α、ZO-1蛋白水平及胰腺组织的病理学评分结果（n=8，2.3 血清ZO-1蛋白水平与其他指标的关系
多重线性回归模型结果显示，SAP组血清ZO-1蛋白水平与胰腺组织病理学评分（b=0.96，P＜0.05）、血清淀粉酶水平（b=0.87，P＜0.05）、胰蛋白酶水平（b=0.72，P＜0.05）及IL-8水平（b=0.69，P＜0.05）均呈正相关，而与TNF-α水平的关系无统计学意义（P＞0.05）。
2.4 处死大鼠的胰腺大体观察结果
各时点SO组大鼠的胰腺大体无异常。SAP组大鼠在注射5%牛磺胆酸钠后，见沿胰管走行方向的周围胰腺组织出现轻度充血水肿；造模6 h后胰腺整体见明显的充血水肿，伴少量血性腹水；12 h时见胰腺出血坏死，胰周出现皂化斑，伴血性腹水；24 h时胰腺坏死明显，胰腺组织变薄，网膜见大量皂化斑，腹水量达6～10 mL（平均7.84 mL）。
2.5 胰腺组织的病理学改变
HE染色结果显示，各时点SO组大鼠的胰腺组织无明显异常。SAP-6 h组大鼠的胰腺组织水肿明显，出现点状出血，并有散在坏死灶及少量中性粒细胞浸润；12 h组见腺泡小叶结构破坏，伴实质出血；24 h组除实质出血外，还存在胰腺组织片状坏死，且有大量中性粒细胞和单核细胞浸润（图 1）。同时点与SO组比较，SAP各时点组大鼠的胰腺组织病理学评分均较高（P＜0.05）。SO组各时点间的胰腺组织病理学评分的差异无统计学意义（P＞0.05）；SAP-12 h组和24 h组的病理学评分均高于6 h组（P＜0.05），而12 h组和24 h组的差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。
图1
示各时点2组大鼠胰腺组织的HE染色结果（HE×200）。1A：SO-6 h组；1B：SO-12 h组；1C：SO-24 h组；1D：SAP-6 h组；1E：SAP-12 h组；1F：SAP-24 h组图 2 示2组大鼠胰腺组织的免疫组化染色结果。2A：SO-6 h组（SP×200）；2B：SO-12 h组（SP×200）；2C：SO-24 h组（SP×400）；2D：SAP-6 h组（SP×200）；2E：SAP-12 h组（SP×200）；2F：SAP-24 h组（SP×400）
Figure1.
HE staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups at different time points (HE×200). 1A:SO-6 hours group; 1B:SO-12 hours group; 1C: SO-24 hours group; 1D:SAP-6 hours group; 1E: SAP-12 hours group; 1F: SAP-24 hours group Figure 2 The immunohistochemical staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups. 2A: SO-6 hours group (SP×200); 2B: SO-12 hours group (SP×200); 2C: SO-24 hours group (SP×400); 2D:SAP-6 hours group (SP×200); 2E: SAP-12 hours group (SP×200); 2F:SAP-24 hours group(SP×400)
2.6 胰腺组织ZO-1蛋白的免疫组化染色结果
2组大鼠的免疫组化染色结果显示，目标蛋白ZO-1蛋白为棕黄色颗粒。各时点SO组见胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁有棕黄色ZO-1蛋白染色颗粒表达，且在毛细血管中的表达呈连续性。SAP-6 h组毛细血管壁及胰腺腺泡细胞间棕黄色颗粒表达不连续，较SO组表达颗粒明显减少；12 h时见胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁的棕黄色颗粒表达数量较6 h时明显少，且在毛细血管中的表达为间断表达；24 h时胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁只见少量散在的棕黄色颗粒（图 2）。
3 讨论
ZO蛋白是组成紧密连接的结构蛋白，其细胞外部分跨膜4次而形成2个环状结构，与相邻细胞的外环连接，封闭细胞间隙；而胞质内的蛋白端则与细胞骨架蛋白相连，使其紧密连接固定在细胞膜上并保持延续性[8]。SAP时大量血管内液体、小分子蛋白等透过各屏障迅速渗漏到组织等第三间隙，多数会产生病理相关性腹水[9]，并出现由进行性全身性水肿、低蛋白血症、血压及中心静脉压降低、血液浓缩、急性肾缺血等临床表现构成的一组综合征，严重时可发生多器官功能衰竭。如临床上SAP患者中急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发生率约为60% [10]；肾功能损害的发生率仅次于肺功能损伤，为14%～43% [11]；腹腔间隔室综合征（ACS）的发病率约为40% [12-14]等。在SAP的病理状态下，炎症细胞因子大量释放，胰酶的易位、过度激活等因素成为了SAP时并发CLS的重要原因，提示SAP与CLS有着密不可分的关联。
经过多年的临床实践发现，血清淀粉酶的活性高低与SAP的病情严重程度没有一定的相关性，但其升高的幅度越大，诊断胰腺炎的可能性也越大，因此，目前还是将血清淀粉酶作为胰腺炎诊断的首选指标。本实验发现，SAP组造模6 h后其血清胰蛋白酶、IL-8及ZO-1蛋白水平均随时间延长逐渐升高，并出现腹水；同时血清ZO-1蛋白水平与血清淀粉酶、IL-8等胰腺炎血清学经典指标以及胰腺组织病理学评分均呈正相关，提示ZO-1蛋白的变化出现在SAP的早期，并贯穿于SAP的病程发展过程中。ZO-1蛋白分布于细胞间紧密连接及毛细血管内皮细胞上，对于ZO-1蛋白表达缺乏的小鼠的研究[15]充分证明了其在紧密连接中的重要地位；也有研究[16]证实，TNF-α能通过激活上皮细胞间的肌球蛋白轻链激酶，调整ZO-1蛋白在细胞膜上的分布。另有实验[17]发现，单纯将胰蛋白酶注入大鼠循环系统后，能破坏毛细血管中的ZO-1蛋白，使其从紧密连接处脱落入血或进入周围组织液，改变血管的渗透功能，可导致与大鼠SAP时极为相似的血管及周围组织的病理学改变。本实验结果显示，随着时间的推移，SAP组大鼠血清中ZO-1蛋白的浓度与胰蛋白酶水平同步逐渐上升，与上述研究结果相近；同时免疫组化染色结果显示，随时间推移，SAP组胰腺组织及周围毛细血管中ZO-1蛋白的表达逐渐下调，甚至几乎不表达，考虑系TNF-α与胰蛋白酶共同作用的结果。
SAP时的血管损伤是SAP病程发展的重要环节之一，临床上对毛细血管屏障功能的保护也成了研究治疗SAP及改善其预后的一个热点。ZO-1蛋白作为其中的重要一环，其影响因素并未完全探明，本实验在前人的基础上进一步探索其临床治疗的理论基础，为SAP的治疗提出了ZO-1蛋白这一可能的关键靶点，希望找到疾病治疗的新方向。
重症急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）
病程进展迅速，病情凶险，病死率高达20%～30% [1]，被称为“20世纪尚未攻克的医学堡垒”。有研究 [2-3]证实，导致SAP死亡率居高不下的主要原因为一些高发生率的“致死并发症”，而在这些并发症的发生发展过程中，血管通透性的改变都扮演着十分重要的角色。有研究[4]指出，毛细血管渗漏综合征（capillary leak syndrome，CLS）可能在SAP的病程发展中起决定性的作用，并与SAP互为因果。对于SAP的病理学过程，业已有了较为统一的认识，即胰腺发生局部病变后，大量炎症因子及毒素进入体循环，形成级联瀑布反应，并发全身多脏器的功能不全和衰竭。CLS发生的初始病理状态即为细胞旁途径的病理性开放，此为水、离子及大分子物质的“大门”。毛细血管屏障一般由机械屏障、化学屏障、免疫屏障等构成，与毛细血管渗透性关系最密切的为机械屏障，其由血管内皮细胞本身及紧密连接复合体组成。而构成紧密连接的众多蛋白中，紧密连接蛋白1（ZO-1蛋白）因其与其他成员蛋白的关系密切，因此在紧密连接中的地位也较重要。研究 [5]发现，ZO-1蛋白的破坏能较直接地影响紧密连接的屏障功能。归结起来就是，CLS的病理重点在于血管内皮细胞紧密连接的损伤，紧密连接损伤蛋白水平的重点在于ZO-1蛋白的异常表达。因此，本研究检测了SAP大鼠胰腺微血管中ZO-1蛋白的表达及血液中ZO-1蛋白的浓度情况，并探讨了其与SAP病程发展的联系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂与设备
选用健康雄性SPF级Wistar大鼠54只 （购自四川省资阳市达硕动物公司），体质量 200～250 g，6～8周龄，进行环境适应性喂养1周后，再进行实验。试剂：牛磺胆酸钠（Sigma公司），大鼠血清淀粉酶试剂盒（泛博生物公司），胰蛋白酶测定试剂盒（建成生物公司），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-8（IL-8）及ZO-1蛋白的ELISA试剂盒（BD公司），ZO-1蛋白抗体（小鼠抗大鼠ZO-1蛋白及羊抗小鼠IgG，博士德生物公司）。设备：全自动生化分析仪（美国Beckman公司）、Bioreal550型酶标仪（美国Thermo公司）及BIO-TEK全自动酶标仪（美国Thermo公司）。
1.2 动物分组与模型制备
将48只大鼠按随机数字表法随机分为假手术组（SO）和SAP组，每组24只；另6只大鼠作为死亡大鼠的补充。实验前12 h禁食、不禁水。①SO组：腹腔注射3%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉后（SAP组同），行开腹手术，翻动胰腺后关腹。②SAP组：参照Aho等[6]的方法，开腹后以动脉夹夹闭肝门部胆管，经十二指肠乳头逆行行胰胆管穿刺，用静脉微量输液泵以3 mL/h的速度注射5%牛磺胆酸钠（1 mL/kg），再用动脉夹夹闭近十二指肠端的胰胆管10 min。肉眼见胰腺组织发生充血、水肿、出血、坏死等改变后，表明大鼠SAP模型制备成功，关腹。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平检测
2组大鼠均分别于手术后6、12及24 h随机（随机数字表法）处死8只大鼠，采集腹主动脉血3～4 mL，以离心机离心（3 000 r/min，r=8 cm，10 min），取上层清夜置于-20℃冰箱中冻存，以待检测。分别采用全自动生化分析仪及酶标仪检测血液中血清淀粉酶及胰蛋白酶水平；采用ELISA法检测血液中IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平。操作均按试剂盒说明书进行。
1.3.2 HE染色
取胰腺组织1 g以4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm厚切片，行苏木精-伊红（HE）染色，在光镜下观察胰腺组织的病理学改变，并进行病理学评分，病理学评分参照Schmidt等[7]的方法。
1.3.3 ZO-1蛋白的免疫组化染色
取胰腺组织1 g进行SP免疫组化染色。首先将组织以4%甲醛液固定，脱水，石蜡包埋，5μm厚连续切片。切片经常规脱蜡至水，以胃蛋白酶消化后滴加相应的小鼠抗大鼠ZO-1蛋白，4℃冰箱过夜；滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育2 h；以二氨基联苯胺（DAB）显色10 min后，用中性树胶封片。以正常Wistar大鼠胰腺组织行免疫组化染色后的切片为阳性对照，以未行免疫组化染色的切片为阴性对照。目标蛋白ZO-1蛋白为棕黄色颗粒，观察各时相胰腺组织棕黄色颗粒的表达情况。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行数据的统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 2组大鼠手术后的一般情况
SAP组大鼠造模成功后出现精神萎靡、活动量减少、食欲差及尿量少，且随时间延长，上述症状逐渐加重；而各时点SO组大鼠的一般情况与术前无明显差异。术后SO组大鼠均未出现死亡，而SAP组大鼠因肠道出血、坏死、大量胸腹水、重度腹腔感染等因素死亡（于造模后7、12、16及19 h分别死亡1、1、2及2只），6只死亡大鼠均予以重新造模补充。
2.2 血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平检测结果
与同时点SO组比较，各时点SAP组的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平均较高（P＜0.05）。SO组内各时点间的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α及ZO-1蛋白水平的差异均无统计学意义（P＞0.05），而SAP组内除3个时点组的TNF-α水平比较差异无统计学意义之外（P＞0.05），3个时点组的其余指标均不全相同（P＜0.05）。①血清淀粉酶：SAP-6 h组和12 h组的血清淀粉酶水平均低于24 h组（P＜0.05），而6 h组和12 h组的差异无统计学意义（P＞0.05）；②胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白：SAP组内大鼠的胰蛋白酶、IL-8和ZO-1蛋白水平均随时点的延长逐渐升高，各时点两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表 1。
表1
2组大鼠各时点的血清淀粉酶、胰蛋白酶、IL-8、TNF-α、ZO-1蛋白水平及胰腺组织的病理学评分结果（n=8，2.3 血清ZO-1蛋白水平与其他指标的关系
多重线性回归模型结果显示，SAP组血清ZO-1蛋白水平与胰腺组织病理学评分（b=0.96，P＜0.05）、血清淀粉酶水平（b=0.87，P＜0.05）、胰蛋白酶水平（b=0.72，P＜0.05）及IL-8水平（b=0.69，P＜0.05）均呈正相关，而与TNF-α水平的关系无统计学意义（P＞0.05）。
2.4 处死大鼠的胰腺大体观察结果
各时点SO组大鼠的胰腺大体无异常。SAP组大鼠在注射5%牛磺胆酸钠后，见沿胰管走行方向的周围胰腺组织出现轻度充血水肿；造模6 h后胰腺整体见明显的充血水肿，伴少量血性腹水；12 h时见胰腺出血坏死，胰周出现皂化斑，伴血性腹水；24 h时胰腺坏死明显，胰腺组织变薄，网膜见大量皂化斑，腹水量达6～10 mL（平均7.84 mL）。
2.5 胰腺组织的病理学改变
HE染色结果显示，各时点SO组大鼠的胰腺组织无明显异常。SAP-6 h组大鼠的胰腺组织水肿明显，出现点状出血，并有散在坏死灶及少量中性粒细胞浸润；12 h组见腺泡小叶结构破坏，伴实质出血；24 h组除实质出血外，还存在胰腺组织片状坏死，且有大量中性粒细胞和单核细胞浸润（图 1）。同时点与SO组比较，SAP各时点组大鼠的胰腺组织病理学评分均较高（P＜0.05）。SO组各时点间的胰腺组织病理学评分的差异无统计学意义（P＞0.05）；SAP-12 h组和24 h组的病理学评分均高于6 h组（P＜0.05），而12 h组和24 h组的差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。
图1
示各时点2组大鼠胰腺组织的HE染色结果（HE×200）。1A：SO-6 h组；1B：SO-12 h组；1C：SO-24 h组；1D：SAP-6 h组；1E：SAP-12 h组；1F：SAP-24 h组图 2 示2组大鼠胰腺组织的免疫组化染色结果。2A：SO-6 h组（SP×200）；2B：SO-12 h组（SP×200）；2C：SO-24 h组（SP×400）；2D：SAP-6 h组（SP×200）；2E：SAP-12 h组（SP×200）；2F：SAP-24 h组（SP×400）
Figure1.
HE staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups at different time points (HE×200). 1A:SO-6 hours group; 1B:SO-12 hours group; 1C: SO-24 hours group; 1D:SAP-6 hours group; 1E: SAP-12 hours group; 1F: SAP-24 hours group Figure 2 The immunohistochemical staining results of pancreatic tissues in rats of 2 groups. 2A: SO-6 hours group (SP×200); 2B: SO-12 hours group (SP×200); 2C: SO-24 hours group (SP×400); 2D:SAP-6 hours group (SP×200); 2E: SAP-12 hours group (SP×200); 2F:SAP-24 hours group(SP×400)
2.6 胰腺组织ZO-1蛋白的免疫组化染色结果
2组大鼠的免疫组化染色结果显示，目标蛋白ZO-1蛋白为棕黄色颗粒。各时点SO组见胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁有棕黄色ZO-1蛋白染色颗粒表达，且在毛细血管中的表达呈连续性。SAP-6 h组毛细血管壁及胰腺腺泡细胞间棕黄色颗粒表达不连续，较SO组表达颗粒明显减少；12 h时见胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁的棕黄色颗粒表达数量较6 h时明显少，且在毛细血管中的表达为间断表达；24 h时胰腺腺泡细胞间及毛细血管壁只见少量散在的棕黄色颗粒（图 2）。
3 讨论
ZO蛋白是组成紧密连接的结构蛋白，其细胞外部分跨膜4次而形成2个环状结构，与相邻细胞的外环连接，封闭细胞间隙；而胞质内的蛋白端则与细胞骨架蛋白相连，使其紧密连接固定在细胞膜上并保持延续性[8]。SAP时大量血管内液体、小分子蛋白等透过各屏障迅速渗漏到组织等第三间隙，多数会产生病理相关性腹水[9]，并出现由进行性全身性水肿、低蛋白血症、血压及中心静脉压降低、血液浓缩、急性肾缺血等临床表现构成的一组综合征，严重时可发生多器官功能衰竭。如临床上SAP患者中急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的发生率约为60% [10]；肾功能损害的发生率仅次于肺功能损伤，为14%～43% [11]；腹腔间隔室综合征（ACS）的发病率约为40% [12-14]等。在SAP的病理状态下，炎症细胞因子大量释放，胰酶的易位、过度激活等因素成为了SAP时并发CLS的重要原因，提示SAP与CLS有着密不可分的关联。
经过多年的临床实践发现，血清淀粉酶的活性高低与SAP的病情严重程度没有一定的相关性，但其升高的幅度越大，诊断胰腺炎的可能性也越大，因此，目前还是将血清淀粉酶作为胰腺炎诊断的首选指标。本实验发现，SAP组造模6 h后其血清胰蛋白酶、IL-8及ZO-1蛋白水平均随时间延长逐渐升高，并出现腹水；同时血清ZO-1蛋白水平与血清淀粉酶、IL-8等胰腺炎血清学经典指标以及胰腺组织病理学评分均呈正相关，提示ZO-1蛋白的变化出现在SAP的早期，并贯穿于SAP的病程发展过程中。ZO-1蛋白分布于细胞间紧密连接及毛细血管内皮细胞上，对于ZO-1蛋白表达缺乏的小鼠的研究[15]充分证明了其在紧密连接中的重要地位；也有研究[16]证实，TNF-α能通过激活上皮细胞间的肌球蛋白轻链激酶，调整ZO-1蛋白在细胞膜上的分布。另有实验[17]发现，单纯将胰蛋白酶注入大鼠循环系统后，能破坏毛细血管中的ZO-1蛋白，使其从紧密连接处脱落入血或进入周围组织液，改变血管的渗透功能，可导致与大鼠SAP时极为相似的血管及周围组织的病理学改变。本实验结果显示，随着时间的推移，SAP组大鼠血清中ZO-1蛋白的浓度与胰蛋白酶水平同步逐渐上升，与上述研究结果相近；同时免疫组化染色结果显示，随时间推移，SAP组胰腺组织及周围毛细血管中ZO-1蛋白的表达逐渐下调，甚至几乎不表达，考虑系TNF-α与胰蛋白酶共同作用的结果。
SAP时的血管损伤是SAP病程发展的重要环节之一，临床上对毛细血管屏障功能的保护也成了研究治疗SAP及改善其预后的一个热点。ZO-1蛋白作为其中的重要一环，其影响因素并未完全探明，本实验在前人的基础上进一步探索其临床治疗的理论基础，为SAP的治疗提出了ZO-1蛋白这一可能的关键靶点，希望找到疾病治疗的新方向。
