引用本文： 丁睿, 李霄, 窦科峰. 人分化抑制蛋白1慢病毒干扰载体的构建、筛选及其沉默效应的鉴定. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(12): 1511-1517. doi: 10.7507/1007-9424.20140358 复制
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上发病率位于第5位的常见肿瘤，其也是世界第3位、我国第2位的肿瘤致死原因[1]。乙肝病毒（HBV）在肝癌形成中的关键作用毋庸置疑，但其参与肝细胞转化的机理仍不清楚[2-4]。分化抑制蛋白（inhibitor of differentiation，Id）又称DNA结合抑制蛋白。由于Id蛋白缺少DNA结合结构域，它与其他碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）结合后可形成没有DNA结合能力的异二聚体，从而起到负性调节作用[5]。作为Id蛋白家族的一员，Id1蛋白在细胞分化过程中起到了重要的作用，它在包括HCC在内的多种人类肿瘤组织中呈高表达[6]。不受控制的Id1蛋白表达将促进肿瘤细胞增殖、抑制分化、刺激肿瘤血管生成及诱发基因组失稳。Id1蛋白的高表达往往和肿瘤的高侵袭性、较低的分化程度和较差的临床预后相关[7-11]。高表达的Id1蛋白可以介导HCC细胞的增殖，并且是预测慢性肝炎肝硬变患者HCC发生风险的指标[12-13]。由此，Id1蛋白参与HCC形成的具体机理是什么？该过程中与Id1蛋白发生作用的分子主要有哪些？沉默Id1基因的表达能否抑制HCC的发生？这些均值得进一步深入研究。因此，笔者构建和筛选了Id1慢病毒干扰载体，并在HCC细胞系中加以验证。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备
慢病毒干扰载体（pGCSIL-GFP质粒）、真核表达载体（pGC-FU质粒）、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体以及pcDNA3.1空质粒均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。pGCSIL-GFP质粒包含AgeⅠ以及EcoRⅠ2个酶切位点，pGC-FU质粒包含AgeⅠ1个酶切位点。限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ均购自大连宝生物工程公司，T4 DNA Ligase试剂盒和实时定量PCR（real time-PCR）试剂盒均购自日本Takara生物公司，QIAGEN Plasmid Plus质粒抽提试剂盒和转染试剂盒均购自德国QIAGEN公司，Trizol以及Lipofectamine2000均购自上海Invitrogen公司，Id1兔抗鼠/人单克隆抗体购自美国Calbioreagents公司，DMEM培养液和Opti-MEM® I减血清培养基均购自美国Gibco Industries公司。本实验所用的细胞包括人HCC HepG2细胞以及239T细胞，均由笔者所在医院实验室提供；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自上海吉凯基因化学技术有限公司。设备：Centricon Plus-20离心超滤管购自美国EMD Millipore公司，TP800 real time-PCR仪购自日本Takara公司，IX73型荧光显微镜购自日本Olympus公司，3311型CO2培养箱购自美国Forma Scicentific公司，电泳槽、电泳仪、转移槽和Molecular Imager显影机均购自美国Bio-Rad公司；Oligo 7软件为美国Molecular Biology Insights公司产品，Photoshop CS6软件为美国Adobe公司产品，Beacon Designer2软件为美国PREMIER Biosoft公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人HepG2细胞置于含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、5 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL氨苄青霉素和500μg/mL G418的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养。239T细胞置于含10%胎牛血清、100μg/mL氨苄青霉素和500μg/mL G418的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养。
1.2.2 Id1-小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒干扰载体的构建与鉴定
根据Id1基因（GenBank®/EMBL提取号码：NM_002165）的信息，按照siRNA干扰序列设计原则[14]，运用Oligo 7软件设计4对可用的siRNA干扰序列（表 1）。根据Id1-siRNA干扰序列分别设计病毒载体构建框架，其两端均含酶切位点粘性末端（AgeⅠ：ACCGGT；EcoRⅠ：GAATTC）。经BLAST分析确认4对干扰片段的特异性。同时设计错配序列作为阴性对照：正义链为5′-CCGGT-TCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，反义链为5′-AA-TTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTT-CTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。由上海锐赛生物技术有限公司分别合成上述单链。将合成的4对寡核苷酸链等量混匀，于95℃条件下作用5 min以退火，冷却至室温，以形成带粘性末端的双链DNA（ds DNA Oligo），见表 2。以AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP质粒使其线性化，利用T4 DNA连接酶将合成的双链DNA与载体连接（连接步骤参照T4 DNA Ligase试剂盒说明书进行）。构建的4种特异性沉默Id1基因的重组慢病毒干扰载体分别为：pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3以及pCGSIL-GFP-Id1-4。采用CaCl2法制备感受态细胞DH5α，4组各取5μL过夜连接物转化感受态细胞DH5α后（制备和转化操作参照DH5α感受态细菌说明书进行），分别涂于含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB平板上，于37℃恒温箱中培养过夜。于每个培养皿上选择3个单克隆菌落接种于3 mL含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250 r/min）培养过夜。经菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆，参照QIAGEN Plasmid Plus质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，并送上海Invitrogen公司测序。同时构建Id1基因高表达载体（pGC-FU-Id1）以及含错配序列的pGCSIL-GFP载体并测序，方法同上。
表1
4组含Id1干扰靶点的siRNA序列
Table1.
Four kinds of siRNA sequences with Id1 interference targets
表2
4组含Id1干扰靶点的寡聚单链DNA序列
Table2.
Oligo sequences contained Id1 interference targets of 4 groups
1.2.3 Id1-RNA干扰（RNAi）有效靶点的筛选
转染前24 h将对数生长期的293T细胞按每孔1×104个/mL接种于24孔板中，每种干扰载体设3个复孔。当细胞生长至80.0%～90.0%融合时，更换为400µL的Opti-MEM® I减血清培养基。将含Id1基因的pGC-FU-Id1重组质粒和针对不同干扰靶点的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体共同转染293T细胞：每孔pGC-FU-Id1重组质粒的量均为0.5µg，Id1-siRNA重组载体的量均为0.5µg，Lipofectamine2000的体积均为2µL。将2种质粒（1µg）和Lipofectamine2000（2µL）分别溶解于Opti-MEM®I减血清培养基（48µL）中混匀，室温静置5 min后，再将稀释好的质粒和Lipofectamine2000合并混匀，室温静置20 min。将混合液（100µL）加入293T细胞（转染其他操作按试剂盒说明书进行），置于5% CO2培养箱中，37℃条件下培养6～8 h后，再换成新鲜的含10%胎牛血清的完全培养液。另以不转染任何质粒的293T细胞作为空白对照组（CON组），以共转染过表达质粒和pcDNA3.1空质粒的293T细胞作为空载体对照组（MOCK组），以共转染过表达质粒和含错配序列的pGCSIL-GFP载体的293T细胞作为阴性对照组（NC组）。将以上处理24 h后的293T细胞置于荧光显微镜下观察（200倍），随机选择3个视野，计数绿色荧光阳性细胞数，并计算其所占比例（即转染率）。转染率＞90.0%为合格。收集处理36～48 h后的293T细胞，抽提总蛋白，调整样品蛋白终浓度为2 g/L，行Western blot法检测Id1蛋白的表达水平。每个样品取相同的蛋白量，加入上样缓冲液，于100℃条件下煮沸变性10 min；行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜于硝酸纤维素膜（NC膜）上；以10％脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Id1兔抗鼠/人单克隆抗体（1：100，12μL/孔），4℃孵育过夜；再以TBST缓冲液洗膜4次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1：5 000，12μL/孔），室温孵育1 h；再以TBST缓冲液洗膜4次，每次5 min；最后用化学发光试剂（ECL）法显影。采用Photoshop CS6软件分析Id1蛋白和β-actin条带的灰度值，通过计算Id1蛋白条带和β-actin条带灰度值的比值作为Id1蛋白的相对表达水平，并计算Id1蛋白表达的相对抑制效率（1-实验组平均蛋白表达水平/NC组平均蛋白表达水平×100%），以筛选目的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体。
1.2.4 慢病毒颗粒的包装
以筛选出的干扰效果最佳的Id1-siRNA重组质粒（pCGSIL-GFP-Id1-4）组建慢病毒即Id1-RNAi-LV。抽提质粒方法同上。将293T细胞按6×105个/mL接种于15 cm培养皿中，培养过夜后换无血清培养基，将脂质体-质粒复合物（含pGCSIL-GFP-Id1-4重组质粒20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg）与相应体积的Opti-MEM®I减血清培养基混合均匀，将总体积调整为2.5 mL，加入到细胞培养皿中。另将100μLLipofectamine2000试剂与2.4 mL Opti-MEM® I培养基轻柔混合后，也小心地加入到细胞培养皿中，以进行转染（转染其他操作按试剂盒说明书进行）。转染8 h后，更换为完全培养液。48 h后收集病毒原液进行离心浓缩（4 000×g，10 min），-80℃存储以备进行滴度鉴定。对含错配序列的pGCSIL-GFP载体也进行慢病毒包装，方法同上。
1.2.5 滴度鉴定
采用逐孔稀释法滴定病毒滴度。测定前24 h，将293T细胞铺于96孔板中（4×104个/孔）。取8个无菌离心管，每管加入90μL无血清培养基。取待测定的病毒原液10μL加入到第1个离心管中混匀，再从中取10μL加入到第2个管中，以此进行梯度稀释，继续相同的操作直到最后1管（第1管含10μL病毒原液，第8管含1×10-6μL病毒原液）。选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基丢弃后，加入90μL分别稀释好的病毒溶液，放入37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。再轻柔加入完全培养基100μL，操作时避免吹起细胞。4 d后于荧光显微镜下（100倍）观察荧光细胞的数量。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少，计数最后2个有荧光的管中荧光细胞的克隆数。假设克隆数分别为X和Y，则病毒滴度（TU/mL）=（X＋Y×10）×1 000/2/X孔中病毒原液的含量（µL）。含错配序列的慢病毒的病毒滴度和Id1-RNAI-LV相同。
1.2.6 慢病毒感染HepG2细胞
用0.25%胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞，制成细胞悬液（1×105个/mL）。将含约5×104个细胞的悬液接种于6孔板中，加入2 mL DMEM培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养，直至培养细胞密度达到约80.0%时进行病毒感染。以包装好的Id1-RNAi-LV感染HepG2细胞（Id1-RNAi-LV组）。根据滴定值于DMEM培养基中加入适量的病毒，使MOI=10（MOI为病毒数与细胞数量的比值）。若细胞生长良好，继续培养24 h后更换培养基；如果观察到明显的细胞毒性效应（如细胞体积缩小、连接消失等），则立即更换培养基。感染3 d后于荧光显微镜（100倍）下观察细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，如表达GFP的细胞比例大于50%，则继续培养2 d后，收集细胞分别行real time-PCR（操作和反应体系同试剂盒说明书，Id1 mRNA的表达水平采用2-ΔΔCt法计算）和Western blot检测（方法同上）；若感染率低于50%，需重新进行感染实验。实验中采用未感染任何病毒的HepG2细胞为空白对照组（VCON组），采用感染含错配序列慢病毒的HepG2细胞为阴性对照组（VNC组），感染操作同上（每组设3个复孔）。计算Id1-RNAi-LV组的相对抑制率，相对抑制效率=1-Id1-RNAi-LV组Id1蛋白或mRNA的表达水平/VNC组对应蛋白或mRNA的表达水平×100%。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（
2 结果
2.1 Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体的鉴定结果
经上海Invitrogen公司测序证实，本实验所得的特异性沉默Id1基因的4种siRNA重组慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）的测序结果均与设计合成的靶向链一致，表明均构建成功。经测序，真核表达载体（pGC-FU-Id1）和含错配序列的pCGSIL-GFP载体也构建成功。
2.2 沉默效率最高的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体的筛选结果
经荧光显微镜观察发现，pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组、pCGSIL-GFP-Id1-3组、pCGSIL-GFP-Id1-4组、MOCK组及NC组的转染率均在90.0%以上（CON组无转染率结果），符合要求。7组293T细胞中Id1蛋白的表达水平结果见图 1。由图 1可见，与其余5组比较（除CON组外），pCGSIL-GFP-Id1-4组Id1蛋白的表达水平最低（P < 0.05），提示pCGSIL-GFP-Id1-4具有最高的沉默效率，其相对抑制效率为76.8%。
图1
7组293T细胞中Id1蛋白的SDS-PAGE电泳结果和表达水平结果。1A：SDS-PAGE电泳结果；1B：Id1蛋白的表达水平结果，与其他5组比较（除CON组外），* P < 0.05；1：CON组；2：MOCK组；3：NC组；4：pCGSIL-GFP-Id1-1组；5：pCGSIL-GFP-Id1-2组；6：pCGSIL-GFP-Id1-3组；7：pCGSIL-GFP-Id1-4组 图 2不同稀释倍数的Id1-RNAi-LV感染293T细胞后的荧光细胞观察结果（倒置荧光显微镜×100）。3A：病毒原液；3B：10倍；3C：1×102倍；3D：1×103倍；3E：1×104倍；3F：1×105倍；3G：1×106倍；3H：1×107倍 图 33组HepG2细胞中Id1 mRNA及其蛋白的SDS-PAGE电泳结果和表达水平结果。3A：Id1蛋白的SDS-PAGE电泳结果；3B：Id1 mRNA及其蛋白的表达水平结果，与其余2组比较，* P < 0.05；1：VCON组；2：VNC组；3：Id1-RNAi-LV组
Figure1.
SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 protein in 293T cells of 7 groups．1A: Results of SDS-PAGE electro-phoresis; 1B: The expression levels of Id1 protein in 7 groups, compared with other 5 groups (except for CON group), *P < 0.05; 1: CON group; 2: MOCK group; 3: NC group; 4: pCGSIL-GFP-Id1-1 group; 5: pCGSIL-GFP-Id1-2 group; 6: pCGSIL-GFP-Id1-3 group; 7: pCGSIL-GFP-Id1-4 group Figure 2 Fluorescent cells observation results of 293T cells in different diluted times after infection of Id1-RNAi-LV (Inverted fluorescence microscope ×100). 2A: No diluted; 2B: Diluted 10 times; 2C: Diluted 1×102 times; 2D: Diluted 1×103 times; 2E: Diluted 1×104 times; 2F: Diluted 1×105 times; 2G: Diluted 1×106 times; 2H: Diluted 1×107 times Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 mRNA and its protein in HepG2 cells of 3 groups. 3A: Results of SDS-PAGE electrophoresis of Id1 protein; 3B: The expression levels of Id1 mRNA and its protein in 3 groups, compared with other 2 groups, * P < 0.05; 1: VCON group; 2: VNC group; 3: Id1-RNAi-LV group
2.3 慢病毒颗粒的滴度测定结果
本实验所构建的Id1-siRNA-LV的病毒滴度为2.0×109 TU/mL，说明Id1-siRNA-LV包装成功。荧光显微镜下见荧光显影细胞的数量随稀释倍数的增加而减少，在稀释1×107倍的情况下，视野中仍可见荧光显影细胞（图 2）。
2.4 Id1-RNAi-LV感染HepG2细胞的效果
real time-PCR结果表明，Id1-RNAi-LV组Id1 mRNA的表达水平较VCON组和VNC组低（P < 0.05），相对抑制效率为55.0%；而VCON组与VNC组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot结果表明，Id1-RNAi-LV组Id1蛋白的表达水平较VCON组和VNC组低（P < 0.05），相对抑制效率为38.8%；而VCON组与VNC组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 3。该结果提示，Id1-RNAi-LV对HepG2细胞Id1 mRNA及其蛋白的表达均具有抑制作用。
3 讨论
Id1参与了人类肿瘤的发生、发展以及侵袭过程。最初的研究[15-17]发现，正常人类原代细胞转染Id1基因后发生p53和视网膜母细胞瘤抑制蛋白（Rb）通路的失活，Id1基因可修复由p53基因介导的DNA损伤，并且通过引起Rb蛋白的过磷酸化而启动细胞周期进程，促进细胞增殖。因此认为，Id1基因可能起到癌基因的作用。目前已经在超过15种人类肿瘤中发现了Id1基因转录和转译水平的表达上调[6]。如在前列腺癌中，Id1蛋白的表达随着Gleason等级的升高（提示肿瘤恶性程度）和分化程度的变差而上调[8]。在卵巢癌中，低分化癌细胞和较差预后患者的癌组织标本中均检测出了高水平表达的Id1蛋白[7]。高表达的Id1蛋白被认为是早期宫颈癌预后较差的标志[10]。这些结果表明，Id1蛋白不仅是介导肿瘤发生的因子，也可能是肿瘤发展过程中的关键因子。在肿瘤侵袭过程中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）起到了重要的作用，其可调节基底膜的降解和重塑细胞外基质。研究[18]也发现，持续表达的Id1蛋白可增加乳腺细胞衰老过程中MMP蛋白的表达水平，促进乳腺细胞的能动性和侵袭性，将Id1基因转入非侵袭性乳腺癌细胞后可促进细胞的增殖和侵袭。此外，在肿瘤发展过程中，Id1蛋白还参与促进肿瘤血管生成，提高肿瘤对化疗药物的耐受性。如前列腺癌细胞系转染Id1基因后可促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）启动子的表达，而敲除Id1基因后，不仅可下调VEGF基因的转录活性，也能抑制VEGF的分泌[19]。在前列腺癌和鼻咽癌细胞中，异位表达的Id1蛋白引起了肿瘤对紫杉醇的耐药[20-21]。除了紫杉醇，Id1蛋白表达上调还与前列腺癌细胞对阿霉素和环磷酰胺的耐药有关[22]。但目前对Id1基因和HCC关系的研究仍较少。目前已发现，过度表达的Id1蛋白可以通过抑制与细胞衰老有关的p16INK4a/Rb信号转导通路而介导HCC的增殖[23]。经转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的Id1抑制通路可能在HCC细胞的生长抑制和部分分化中均起到重要作用[13]。此外，研究[12]还发现，Id1蛋白的高表达可能是预测慢性肝炎肝硬变患者HCC发生风险的指标。因此，在揭示HCC发生和发展的研究过程中，我们不能忽视Id1基因在其中所起的重要作用。
RNAi技术通过细胞内的RNA酶Dicer，将双链的RNA分子降解为21～23碱基对大小的siRNA，后者再结合核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物，之后再定位并切割对应的mRNA，从而达到抑制同源基因表达的效果[24]。但由于siRNA的易降解性，需要特定的载体以维持其长期稳定的RNAi效果。2003年，Stewart等[25]首次报道了慢病毒介导的RNAi在Hela细胞和原代树突细胞中的应用。慢病毒属逆转录病毒，慢病毒载体是在其基础上通过重组改造而成的，其表达效率和安全性均更高[26]。慢病毒载体的主要结构包括3个部分，分别为包装质粒、包膜质粒和转移质粒。将3种质粒经重组改造后感染293T细胞，即可产生存在复制缺陷的HIV病毒[27]。这种病毒在宿主体内不但可以长期稳定表达，而且免疫反应轻微，并且可同时兼容多个转录启动子。将慢病毒载体高效感染和整合的特性，结合RNAi对同源基因特异性抑制的特性，即构成了慢病毒载体介导的RNAi。它对原代培养的人巨噬细胞、造血干细胞等各类哺乳动物细胞均具有有效的RNAi效果。由于慢病毒载体能够将外源基因安全和高效地转入动物或人体内，并能够使目的基因高效、稳定且持续表达，故在临床中特别是在肿瘤治疗中具有很好的应用前景。
本实验设计、筛选并成功构建了人Id1慢病毒干扰载体，并成功实现慢病毒的包装，病毒滴度为2.0×109 TU/mL。将包装好的慢病毒（Id1-RNAi-LV）感染HepG2细胞后，与VCON组和VNC组比较，其Id1 mRNA和蛋白的表达水平均较低，表明慢病毒干扰载体构建成功。本实验构建的慢病毒干扰载体可用于研究Id1基因沉默对HCC发生和发展过程的影响，有助于进一步了解在HCC形成过程中与Id1基因相关的分子通路，以及寻找有效的HCC基因治疗靶点；同时其有助于研究Id1基因与HCC肿瘤耐药间的关系。如果抑制Id1基因的表达可以降低肿瘤对化疗药物的耐受作用，那么将Id1慢病毒干扰载体结合至化疗药物上共同使用则可能增强药物介导的凋亡并逆转肿瘤的抗药性。此外，本实验成功构建的Id1慢病毒干扰载体对有Id1参与的其他人类肿瘤的研究也具有重要价值。
肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上发病率位于第5位的常见肿瘤，其也是世界第3位、我国第2位的肿瘤致死原因[1]。乙肝病毒（HBV）在肝癌形成中的关键作用毋庸置疑，但其参与肝细胞转化的机理仍不清楚[2-4]。分化抑制蛋白（inhibitor of differentiation，Id）又称DNA结合抑制蛋白。由于Id蛋白缺少DNA结合结构域，它与其他碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH）结合后可形成没有DNA结合能力的异二聚体，从而起到负性调节作用[5]。作为Id蛋白家族的一员，Id1蛋白在细胞分化过程中起到了重要的作用，它在包括HCC在内的多种人类肿瘤组织中呈高表达[6]。不受控制的Id1蛋白表达将促进肿瘤细胞增殖、抑制分化、刺激肿瘤血管生成及诱发基因组失稳。Id1蛋白的高表达往往和肿瘤的高侵袭性、较低的分化程度和较差的临床预后相关[7-11]。高表达的Id1蛋白可以介导HCC细胞的增殖，并且是预测慢性肝炎肝硬变患者HCC发生风险的指标[12-13]。由此，Id1蛋白参与HCC形成的具体机理是什么？该过程中与Id1蛋白发生作用的分子主要有哪些？沉默Id1基因的表达能否抑制HCC的发生？这些均值得进一步深入研究。因此，笔者构建和筛选了Id1慢病毒干扰载体，并在HCC细胞系中加以验证。
1 材料与方法
1.1 主要材料和设备
慢病毒干扰载体（pGCSIL-GFP质粒）、真核表达载体（pGC-FU质粒）、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体以及pcDNA3.1空质粒均购自上海吉凯基因化学技术有限公司。pGCSIL-GFP质粒包含AgeⅠ以及EcoRⅠ2个酶切位点，pGC-FU质粒包含AgeⅠ1个酶切位点。限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ均购自大连宝生物工程公司，T4 DNA Ligase试剂盒和实时定量PCR（real time-PCR）试剂盒均购自日本Takara生物公司，QIAGEN Plasmid Plus质粒抽提试剂盒和转染试剂盒均购自德国QIAGEN公司，Trizol以及Lipofectamine2000均购自上海Invitrogen公司，Id1兔抗鼠/人单克隆抗体购自美国Calbioreagents公司，DMEM培养液和Opti-MEM® I减血清培养基均购自美国Gibco Industries公司。本实验所用的细胞包括人HCC HepG2细胞以及239T细胞，均由笔者所在医院实验室提供；大肠杆菌感受态细胞DH5α购自上海吉凯基因化学技术有限公司。设备：Centricon Plus-20离心超滤管购自美国EMD Millipore公司，TP800 real time-PCR仪购自日本Takara公司，IX73型荧光显微镜购自日本Olympus公司，3311型CO2培养箱购自美国Forma Scicentific公司，电泳槽、电泳仪、转移槽和Molecular Imager显影机均购自美国Bio-Rad公司；Oligo 7软件为美国Molecular Biology Insights公司产品，Photoshop CS6软件为美国Adobe公司产品，Beacon Designer2软件为美国PREMIER Biosoft公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人HepG2细胞置于含10%胎牛血清、0.1 mmol/L非必需氨基酸、5 mmol/L L-谷氨酰胺、100μg/mL氨苄青霉素和500μg/mL G418的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养。239T细胞置于含10%胎牛血清、100μg/mL氨苄青霉素和500μg/mL G418的DMEM培养液中，于37℃、5% CO2恒温培养箱中常规培养。
1.2.2 Id1-小干扰RNA（siRNA）重组慢病毒干扰载体的构建与鉴定
根据Id1基因（GenBank®/EMBL提取号码：NM_002165）的信息，按照siRNA干扰序列设计原则[14]，运用Oligo 7软件设计4对可用的siRNA干扰序列（表 1）。根据Id1-siRNA干扰序列分别设计病毒载体构建框架，其两端均含酶切位点粘性末端（AgeⅠ：ACCGGT；EcoRⅠ：GAATTC）。经BLAST分析确认4对干扰片段的特异性。同时设计错配序列作为阴性对照：正义链为5′-CCGGT-TCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGT-GACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′，反义链为5′-AA-TTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTT-CTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。由上海锐赛生物技术有限公司分别合成上述单链。将合成的4对寡核苷酸链等量混匀，于95℃条件下作用5 min以退火，冷却至室温，以形成带粘性末端的双链DNA（ds DNA Oligo），见表 2。以AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pGCSIL-GFP质粒使其线性化，利用T4 DNA连接酶将合成的双链DNA与载体连接（连接步骤参照T4 DNA Ligase试剂盒说明书进行）。构建的4种特异性沉默Id1基因的重组慢病毒干扰载体分别为：pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3以及pCGSIL-GFP-Id1-4。采用CaCl2法制备感受态细胞DH5α，4组各取5μL过夜连接物转化感受态细胞DH5α后（制备和转化操作参照DH5α感受态细菌说明书进行），分别涂于含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB平板上，于37℃恒温箱中培养过夜。于每个培养皿上选择3个单克隆菌落接种于3 mL含卡那霉素抗性（30 mg/L）的LB培养液中，37℃恒温摇床（250 r/min）培养过夜。经菌落PCR筛选，将筛选得到的阳性克隆，参照QIAGEN Plasmid Plus质粒抽提试剂盒说明书提取质粒，并送上海Invitrogen公司测序。同时构建Id1基因高表达载体（pGC-FU-Id1）以及含错配序列的pGCSIL-GFP载体并测序，方法同上。
表1
4组含Id1干扰靶点的siRNA序列
Table1.
Four kinds of siRNA sequences with Id1 interference targets
表2
4组含Id1干扰靶点的寡聚单链DNA序列
Table2.
Oligo sequences contained Id1 interference targets of 4 groups
1.2.3 Id1-RNA干扰（RNAi）有效靶点的筛选
转染前24 h将对数生长期的293T细胞按每孔1×104个/mL接种于24孔板中，每种干扰载体设3个复孔。当细胞生长至80.0%～90.0%融合时，更换为400µL的Opti-MEM® I减血清培养基。将含Id1基因的pGC-FU-Id1重组质粒和针对不同干扰靶点的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体共同转染293T细胞：每孔pGC-FU-Id1重组质粒的量均为0.5µg，Id1-siRNA重组载体的量均为0.5µg，Lipofectamine2000的体积均为2µL。将2种质粒（1µg）和Lipofectamine2000（2µL）分别溶解于Opti-MEM®I减血清培养基（48µL）中混匀，室温静置5 min后，再将稀释好的质粒和Lipofectamine2000合并混匀，室温静置20 min。将混合液（100µL）加入293T细胞（转染其他操作按试剂盒说明书进行），置于5% CO2培养箱中，37℃条件下培养6～8 h后，再换成新鲜的含10%胎牛血清的完全培养液。另以不转染任何质粒的293T细胞作为空白对照组（CON组），以共转染过表达质粒和pcDNA3.1空质粒的293T细胞作为空载体对照组（MOCK组），以共转染过表达质粒和含错配序列的pGCSIL-GFP载体的293T细胞作为阴性对照组（NC组）。将以上处理24 h后的293T细胞置于荧光显微镜下观察（200倍），随机选择3个视野，计数绿色荧光阳性细胞数，并计算其所占比例（即转染率）。转染率＞90.0%为合格。收集处理36～48 h后的293T细胞，抽提总蛋白，调整样品蛋白终浓度为2 g/L，行Western blot法检测Id1蛋白的表达水平。每个样品取相同的蛋白量，加入上样缓冲液，于100℃条件下煮沸变性10 min；行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，转膜于硝酸纤维素膜（NC膜）上；以10％脱脂奶粉室温封闭1 h，加入Id1兔抗鼠/人单克隆抗体（1：100，12μL/孔），4℃孵育过夜；再以TBST缓冲液洗膜4次，每次5 min；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1：5 000，12μL/孔），室温孵育1 h；再以TBST缓冲液洗膜4次，每次5 min；最后用化学发光试剂（ECL）法显影。采用Photoshop CS6软件分析Id1蛋白和β-actin条带的灰度值，通过计算Id1蛋白条带和β-actin条带灰度值的比值作为Id1蛋白的相对表达水平，并计算Id1蛋白表达的相对抑制效率（1-实验组平均蛋白表达水平/NC组平均蛋白表达水平×100%），以筛选目的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体。
1.2.4 慢病毒颗粒的包装
以筛选出的干扰效果最佳的Id1-siRNA重组质粒（pCGSIL-GFP-Id1-4）组建慢病毒即Id1-RNAi-LV。抽提质粒方法同上。将293T细胞按6×105个/mL接种于15 cm培养皿中，培养过夜后换无血清培养基，将脂质体-质粒复合物（含pGCSIL-GFP-Id1-4重组质粒20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper2.0载体10μg）与相应体积的Opti-MEM®I减血清培养基混合均匀，将总体积调整为2.5 mL，加入到细胞培养皿中。另将100μLLipofectamine2000试剂与2.4 mL Opti-MEM® I培养基轻柔混合后，也小心地加入到细胞培养皿中，以进行转染（转染其他操作按试剂盒说明书进行）。转染8 h后，更换为完全培养液。48 h后收集病毒原液进行离心浓缩（4 000×g，10 min），-80℃存储以备进行滴度鉴定。对含错配序列的pGCSIL-GFP载体也进行慢病毒包装，方法同上。
1.2.5 滴度鉴定
采用逐孔稀释法滴定病毒滴度。测定前24 h，将293T细胞铺于96孔板中（4×104个/孔）。取8个无菌离心管，每管加入90μL无血清培养基。取待测定的病毒原液10μL加入到第1个离心管中混匀，再从中取10μL加入到第2个管中，以此进行梯度稀释，继续相同的操作直到最后1管（第1管含10μL病毒原液，第8管含1×10-6μL病毒原液）。选取所需的细胞孔，吸去90μL培养基丢弃后，加入90μL分别稀释好的病毒溶液，放入37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。再轻柔加入完全培养基100μL，操作时避免吹起细胞。4 d后于荧光显微镜下（100倍）观察荧光细胞的数量。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少，计数最后2个有荧光的管中荧光细胞的克隆数。假设克隆数分别为X和Y，则病毒滴度（TU/mL）=（X＋Y×10）×1 000/2/X孔中病毒原液的含量（µL）。含错配序列的慢病毒的病毒滴度和Id1-RNAI-LV相同。
1.2.6 慢病毒感染HepG2细胞
用0.25%胰酶消化处于对数生长期的HepG2细胞，制成细胞悬液（1×105个/mL）。将含约5×104个细胞的悬液接种于6孔板中，加入2 mL DMEM培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养，直至培养细胞密度达到约80.0%时进行病毒感染。以包装好的Id1-RNAi-LV感染HepG2细胞（Id1-RNAi-LV组）。根据滴定值于DMEM培养基中加入适量的病毒，使MOI=10（MOI为病毒数与细胞数量的比值）。若细胞生长良好，继续培养24 h后更换培养基；如果观察到明显的细胞毒性效应（如细胞体积缩小、连接消失等），则立即更换培养基。感染3 d后于荧光显微镜（100倍）下观察细胞绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，如表达GFP的细胞比例大于50%，则继续培养2 d后，收集细胞分别行real time-PCR（操作和反应体系同试剂盒说明书，Id1 mRNA的表达水平采用2-ΔΔCt法计算）和Western blot检测（方法同上）；若感染率低于50%，需重新进行感染实验。实验中采用未感染任何病毒的HepG2细胞为空白对照组（VCON组），采用感染含错配序列慢病毒的HepG2细胞为阴性对照组（VNC组），感染操作同上（每组设3个复孔）。计算Id1-RNAi-LV组的相对抑制率，相对抑制效率=1-Id1-RNAi-LV组Id1蛋白或mRNA的表达水平/VNC组对应蛋白或mRNA的表达水平×100%。
1.3 统计学方法
采用SPSS 18.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差（
2 结果
2.1 Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体的鉴定结果
经上海Invitrogen公司测序证实，本实验所得的特异性沉默Id1基因的4种siRNA重组慢病毒干扰载体（pCGSIL-GFP-Id1-1、pCGSIL-GFP-Id1-2、pCGSIL-GFP-Id1-3及pCGSIL-GFP-Id1-4）的测序结果均与设计合成的靶向链一致，表明均构建成功。经测序，真核表达载体（pGC-FU-Id1）和含错配序列的pCGSIL-GFP载体也构建成功。
2.2 沉默效率最高的Id1-siRNA重组慢病毒干扰载体的筛选结果
经荧光显微镜观察发现，pCGSIL-GFP-Id1-1组、pCGSIL-GFP-Id1-2组、pCGSIL-GFP-Id1-3组、pCGSIL-GFP-Id1-4组、MOCK组及NC组的转染率均在90.0%以上（CON组无转染率结果），符合要求。7组293T细胞中Id1蛋白的表达水平结果见图 1。由图 1可见，与其余5组比较（除CON组外），pCGSIL-GFP-Id1-4组Id1蛋白的表达水平最低（P < 0.05），提示pCGSIL-GFP-Id1-4具有最高的沉默效率，其相对抑制效率为76.8%。
图1
7组293T细胞中Id1蛋白的SDS-PAGE电泳结果和表达水平结果。1A：SDS-PAGE电泳结果；1B：Id1蛋白的表达水平结果，与其他5组比较（除CON组外），* P < 0.05；1：CON组；2：MOCK组；3：NC组；4：pCGSIL-GFP-Id1-1组；5：pCGSIL-GFP-Id1-2组；6：pCGSIL-GFP-Id1-3组；7：pCGSIL-GFP-Id1-4组 图 2不同稀释倍数的Id1-RNAi-LV感染293T细胞后的荧光细胞观察结果（倒置荧光显微镜×100）。3A：病毒原液；3B：10倍；3C：1×102倍；3D：1×103倍；3E：1×104倍；3F：1×105倍；3G：1×106倍；3H：1×107倍 图 33组HepG2细胞中Id1 mRNA及其蛋白的SDS-PAGE电泳结果和表达水平结果。3A：Id1蛋白的SDS-PAGE电泳结果；3B：Id1 mRNA及其蛋白的表达水平结果，与其余2组比较，* P < 0.05；1：VCON组；2：VNC组；3：Id1-RNAi-LV组
Figure1.
SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 protein in 293T cells of 7 groups．1A: Results of SDS-PAGE electro-phoresis; 1B: The expression levels of Id1 protein in 7 groups, compared with other 5 groups (except for CON group), *P < 0.05; 1: CON group; 2: MOCK group; 3: NC group; 4: pCGSIL-GFP-Id1-1 group; 5: pCGSIL-GFP-Id1-2 group; 6: pCGSIL-GFP-Id1-3 group; 7: pCGSIL-GFP-Id1-4 group Figure 2 Fluorescent cells observation results of 293T cells in different diluted times after infection of Id1-RNAi-LV (Inverted fluorescence microscope ×100). 2A: No diluted; 2B: Diluted 10 times; 2C: Diluted 1×102 times; 2D: Diluted 1×103 times; 2E: Diluted 1×104 times; 2F: Diluted 1×105 times; 2G: Diluted 1×106 times; 2H: Diluted 1×107 times Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis results and expression level results of Id1 mRNA and its protein in HepG2 cells of 3 groups. 3A: Results of SDS-PAGE electrophoresis of Id1 protein; 3B: The expression levels of Id1 mRNA and its protein in 3 groups, compared with other 2 groups, * P < 0.05; 1: VCON group; 2: VNC group; 3: Id1-RNAi-LV group
2.3 慢病毒颗粒的滴度测定结果
本实验所构建的Id1-siRNA-LV的病毒滴度为2.0×109 TU/mL，说明Id1-siRNA-LV包装成功。荧光显微镜下见荧光显影细胞的数量随稀释倍数的增加而减少，在稀释1×107倍的情况下，视野中仍可见荧光显影细胞（图 2）。
2.4 Id1-RNAi-LV感染HepG2细胞的效果
real time-PCR结果表明，Id1-RNAi-LV组Id1 mRNA的表达水平较VCON组和VNC组低（P < 0.05），相对抑制效率为55.0%；而VCON组与VNC组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot结果表明，Id1-RNAi-LV组Id1蛋白的表达水平较VCON组和VNC组低（P < 0.05），相对抑制效率为38.8%；而VCON组与VNC组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 3。该结果提示，Id1-RNAi-LV对HepG2细胞Id1 mRNA及其蛋白的表达均具有抑制作用。
3 讨论
Id1参与了人类肿瘤的发生、发展以及侵袭过程。最初的研究[15-17]发现，正常人类原代细胞转染Id1基因后发生p53和视网膜母细胞瘤抑制蛋白（Rb）通路的失活，Id1基因可修复由p53基因介导的DNA损伤，并且通过引起Rb蛋白的过磷酸化而启动细胞周期进程，促进细胞增殖。因此认为，Id1基因可能起到癌基因的作用。目前已经在超过15种人类肿瘤中发现了Id1基因转录和转译水平的表达上调[6]。如在前列腺癌中，Id1蛋白的表达随着Gleason等级的升高（提示肿瘤恶性程度）和分化程度的变差而上调[8]。在卵巢癌中，低分化癌细胞和较差预后患者的癌组织标本中均检测出了高水平表达的Id1蛋白[7]。高表达的Id1蛋白被认为是早期宫颈癌预后较差的标志[10]。这些结果表明，Id1蛋白不仅是介导肿瘤发生的因子，也可能是肿瘤发展过程中的关键因子。在肿瘤侵袭过程中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）起到了重要的作用，其可调节基底膜的降解和重塑细胞外基质。研究[18]也发现，持续表达的Id1蛋白可增加乳腺细胞衰老过程中MMP蛋白的表达水平，促进乳腺细胞的能动性和侵袭性，将Id1基因转入非侵袭性乳腺癌细胞后可促进细胞的增殖和侵袭。此外，在肿瘤发展过程中，Id1蛋白还参与促进肿瘤血管生成，提高肿瘤对化疗药物的耐受性。如前列腺癌细胞系转染Id1基因后可促进血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）启动子的表达，而敲除Id1基因后，不仅可下调VEGF基因的转录活性，也能抑制VEGF的分泌[19]。在前列腺癌和鼻咽癌细胞中，异位表达的Id1蛋白引起了肿瘤对紫杉醇的耐药[20-21]。除了紫杉醇，Id1蛋白表达上调还与前列腺癌细胞对阿霉素和环磷酰胺的耐药有关[22]。但目前对Id1基因和HCC关系的研究仍较少。目前已发现，过度表达的Id1蛋白可以通过抑制与细胞衰老有关的p16INK4a/Rb信号转导通路而介导HCC的增殖[23]。经转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的Id1抑制通路可能在HCC细胞的生长抑制和部分分化中均起到重要作用[13]。此外，研究[12]还发现，Id1蛋白的高表达可能是预测慢性肝炎肝硬变患者HCC发生风险的指标。因此，在揭示HCC发生和发展的研究过程中，我们不能忽视Id1基因在其中所起的重要作用。
RNAi技术通过细胞内的RNA酶Dicer，将双链的RNA分子降解为21～23碱基对大小的siRNA，后者再结合核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物，之后再定位并切割对应的mRNA，从而达到抑制同源基因表达的效果[24]。但由于siRNA的易降解性，需要特定的载体以维持其长期稳定的RNAi效果。2003年，Stewart等[25]首次报道了慢病毒介导的RNAi在Hela细胞和原代树突细胞中的应用。慢病毒属逆转录病毒，慢病毒载体是在其基础上通过重组改造而成的，其表达效率和安全性均更高[26]。慢病毒载体的主要结构包括3个部分，分别为包装质粒、包膜质粒和转移质粒。将3种质粒经重组改造后感染293T细胞，即可产生存在复制缺陷的HIV病毒[27]。这种病毒在宿主体内不但可以长期稳定表达，而且免疫反应轻微，并且可同时兼容多个转录启动子。将慢病毒载体高效感染和整合的特性，结合RNAi对同源基因特异性抑制的特性，即构成了慢病毒载体介导的RNAi。它对原代培养的人巨噬细胞、造血干细胞等各类哺乳动物细胞均具有有效的RNAi效果。由于慢病毒载体能够将外源基因安全和高效地转入动物或人体内，并能够使目的基因高效、稳定且持续表达，故在临床中特别是在肿瘤治疗中具有很好的应用前景。
本实验设计、筛选并成功构建了人Id1慢病毒干扰载体，并成功实现慢病毒的包装，病毒滴度为2.0×109 TU/mL。将包装好的慢病毒（Id1-RNAi-LV）感染HepG2细胞后，与VCON组和VNC组比较，其Id1 mRNA和蛋白的表达水平均较低，表明慢病毒干扰载体构建成功。本实验构建的慢病毒干扰载体可用于研究Id1基因沉默对HCC发生和发展过程的影响，有助于进一步了解在HCC形成过程中与Id1基因相关的分子通路，以及寻找有效的HCC基因治疗靶点；同时其有助于研究Id1基因与HCC肿瘤耐药间的关系。如果抑制Id1基因的表达可以降低肿瘤对化疗药物的耐受作用，那么将Id1慢病毒干扰载体结合至化疗药物上共同使用则可能增强药物介导的凋亡并逆转肿瘤的抗药性。此外，本实验成功构建的Id1慢病毒干扰载体对有Id1参与的其他人类肿瘤的研究也具有重要价值。
