引用本文： 李晓刚, 陆平, 靳文帝, 李波, 王春晓, 牛朝, 罗开元. 不同放射剂量的125Ⅰ粒子对人低分化胃癌细胞影响的动物实验研究. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(12): 1518-1523. doi: 10.7507/1007-9424.20140359 复制
125I粒子组织间植入作为一种新兴的对肿瘤行放射治疗的技术，目前已被广泛应用于临床各种恶性肿瘤的放射治疗中[1-2]，其中在胃癌的治疗中，其与外科手术相结合，取得了良好的临床疗效[3]。粒子组织间植入放射治疗是解决术后局部复发及远处转移的有效方法，但其分子生物学机理尚不十分明确，多考虑与诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长并影响细胞增殖有关。细胞周期因子E（cyclinE）与细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）均是细胞周期由G1期到S期的主要限速因子[4]。本实验通过将125I粒子植入BGC823人低分化胃癌组织后，从细胞生长、凋亡、cyclinE表达等方面进行量化分析，以探讨125I粒子组织间植入治疗胃癌的机理及其合适的剂量，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
SPF级BLAB nu/nu裸鼠64只，体质量17～22 g（平均20 g），4周龄，雄性，购自北京维通利华公司。主要材料：BGC823人低分化胃癌细胞系（中国科学院上海细胞库）、125I粒子（放射性剂量分别为1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq，上海欣科医药公司）、DMEM培养液（美国Hyclone公司）、胎牛血清（乌拉圭GIBCO公司）、RNA提取试剂盒（美国BECKMAN COULTER公司）、抗人表皮生长因子抗体（Anti-hEGFR，美国R & D SYSTEMS公司）、PCR试剂盒（深圳匹基生物工程有限公司）、Ferme-ntas逆转录试剂盒（杭州主诺生物技术有限公司）以及DNA提纯试剂盒（中国上海科敏生物科技有限公司）。主要设备：18G植入针（美国Mick Radio-Nuclear公司）、ABI实时荧光定量PCR（PT-PCR）仪（ABI7300，美国ABI公司）、流式细胞仪（MoFlo XDP，美国Beckman Coulter公司）、显微拍摄系统（CH2型，日本NIKON公司）及Primer Premier 5.0软件（加拿大Premier公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将BGC823细胞复苏后置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中进行培养，2～3 d传代1次。取对数生长期细胞，用PBS缓冲液配制成5×107个/mL的细胞悬液，用于制备荷瘤鼠模型。
1.2.2 制备荷瘤鼠模型
接到裸鼠后，在SPF条件下于动物实验室饲养2～3 d，以适应环境。取上述细胞悬液种植于裸鼠左肩胛皮下（1.00 mL），在SPF条件下于动物实验室饲养3周左右，待肿瘤生长至0.7～1.2 cm时作为荷瘤鼠模型，用于后续实验。
1.2.3 制备荷瘤鼠放射模型
将64只荷瘤鼠随机分为4组（随机数字表法）：空白对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组16只。空白对照组仅植入1粒空白粒子（不含放射性元素）；低剂量组、中剂量组及高剂量组为实验组，分别植入放射剂量为1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq的125I粒子。植入方法：测量肿瘤长短径后，按照无菌原则用粒子植入针沿肿瘤长径方向将粒子植入到肿瘤中央，使粒子到肿瘤各边缘距离均＜1.0 cm。在SPF条件下于动物实验室饲养，各饲养笼之间的距离＞50.0 cm。本实验周期为28 d，时间较短，无裸鼠发生多个转移瘤的情况，且实验期间均无荷瘤裸鼠死亡。
1.2.4 测量肿瘤体积
分别于粒子植入前、植入后7、14、21及28 d，4组均随机（随机数字表法）抽取4只荷瘤鼠处死，剥取瘤体称重，并测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积〔体积（mm3）=长径（mm）×短径（mm）2/2）〕。
1.2.5 流式细胞仪检测肿瘤组织的细胞凋亡率
分别于植入粒子后14 d和28 d，取上述标本采用流式细胞法（FCM）检测肿瘤组织的细胞凋亡率。取0.1 g肿瘤组织，以4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，每次10 min；采用剪碎机械法[5]制备单细胞悬液样品，然后加入PBS缓冲液，吹打收集的细胞，制成细胞悬液（1×103个/mL）；离心（2 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），沉淀用PBS缓冲液洗涤2次，每次4 min；加入核糖核酸酶200.00μL，37℃孵育10 min；最后加入碘化丙啶（PI）1 000.00μL，染色30 min后上流式细胞仪分析。
1.2.6 RT-PCR法检测cyclinE mRNA的表达
于植入粒子后14 d和28 d，采用RT-PCR法检测肿瘤组织中cyclinE mRNA的表达。cyclinE基因的上游引物序列为5′-GGAGCGGGATGCGAAGGAGC-3′，下游引物序列为5′-AGCGGGGAGCCTCTGGAT-GG-3′（扩增长度为297 bp）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的上游引物序列为5′-GCATGGCCT-TCCGTGTCCCC-3′，下游引物序列为5′-GGCTGG-GGTCCAGGGGTCT-3′（扩增长度为339 bp）。本实验所需引物均由引物设计软件Primer Premier 5.0设计，并且经由美国国立生物技术信息中心（NCBI）中的BLAST比对以验证引物的准确性及可靠性。所有引物均由厦门浩博生物技术有限公司协助完成。取0.1 g肿瘤组织，按常规Trizol法提取总RNA，于-80℃冰箱中保存。本实验提取的RNA的浓度为1×10-3 ng/L，符合实验要求。取5μg RNA，逆转录为cDNA，逆转录步骤按试剂盒操作说明书进行，并以cDNA为模板进行PCR扩增。25.00μL PCR反应体系为：cDNA 2.00μL，Mg2+ 1.60μL，TaqDNA多聚酶0.20μL，10μmol/L的上下游引物各0.40μL，10μmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.50μL，10×PCR缓冲液2.50μL，核苷酸胶体染料（SYBR-GreenⅠ）0.13μL，再以焦碳酸二乙酯（DEPC）水补足至25.00μL。反应条件：95℃10 min预变性；95℃15 s变性，59.5℃25 s退火，72℃1 min延伸，共40个循环。PCR结束后采用溶解曲线确定产物的特异性，以得出循环阈值（threshold cycle，Ct），并计算目的基因的表达水平。cyclinE mRNA的表达水平采用公式2-△△Ct计算。
1.3 统计学方法
实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 4组裸鼠的肿瘤体积
除空白对照组外（空白对照组的变化不大），低、中及高剂量组的肿瘤体积随时间延长均呈下降趋势。①植入前4组裸鼠的肿瘤体积比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②植入粒子后7、14及21 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤体积均较小（P < 0.05）；而后3组之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。③28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤体积均较小（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的肿瘤体积均较大（P < 0.05），而中剂量组与高剂量组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
表1
各时点4组裸鼠的肿瘤体积和质量（n=4，2.2 4组裸鼠的肿瘤质量
除空白对照组外（空白对照组的变化不大），低、中及高剂量组的肿瘤质量随时间延长均呈下降趋势。①植入前和植入后7 d，4组裸鼠的肿瘤质量比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。②植入粒子后14 d和21 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤质量均较轻（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的瘤体质量均较重（P < 0.05），而中剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤质量均较轻（P < 0.05），且后3组两两比较差异均有统计学意义，低、中及高剂量组的瘤体质量依次增加（P < 0.05），见表 1。
2.3 4组裸鼠肿瘤组织的细胞凋亡率
①植入粒子后14 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的凋亡率均较高（P < 0.05），但后3组比较差异无统计学差异（P > 0.05）。②28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的凋亡率均较高（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的凋亡率均较低（P < 0.05），但中剂量组和高剂量组的凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③同组内与14 d比较，28 d时除空白对照组的差异无统计学意义外（P > 0.05），其余3组的凋亡率水平均较高（P < 0.05），见表 2和图 1。
表2
4组裸鼠肿瘤组织的细胞凋亡率及cyclinE mRNA表达水平结果（n=4）
Table2.
The results of tumor cell apoptosis rates and expression levels of cyclinE mRNA in nude mice of 4 groups (n=4)
图1
示粒子植入28 d时4组裸鼠肿瘤细胞的流式细胞图。1A：空白对照组；1B：低剂量组；1C：中剂量组；1D：高剂量组 图 2 28 d时3个实验组裸鼠的肿瘤组织行RT-PCR检测的溶解曲线及扩增曲线。2A：低剂量组的溶解曲线；2B：低剂量组的扩增曲线；2C：中剂量组的溶解曲线；2D：中剂量组的扩增曲线；2E：高剂量组的溶解曲线；2F：高剂量组的扩增曲线
Figure1.
Flow diagrams of tumor cells in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 1A: Blank control group; 1B: Low dose group; 1C: Middle dose group; 1D: High dose group Figure 2 Dissolve curves and amplification curves of tumor tissues in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 2A: Dissolve curve of low dose group; 2B: Amplification curve of low dose group; 2C: Dissolve curve of middle dose group; 2D: Amplification curve of middle dose group; 2E: Dissolve curve of high dose group; 1F: Amplification curve of high dose group
2.4 4组裸鼠肿瘤组织中cyclinE mRNA的表达
①植入粒子后14 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05），而后3组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。②28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较高（P < 0.05），但中剂量组和高剂量组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③同组内与14 d比较，28 d时除空白对照组的差异无统计学意义外（P > 0.05），其余3组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05），见表 2和图 2。
3 讨论
通过植入放射性粒子以近距离治疗恶性肿瘤是一种新的放疗手段，其中125I粒子是目前组织间放疗最常用的放射性粒子。它是一种人工合成的同位素，半衰期为60.1 d，相对较长；相比传统体外放射治疗，其具有精度高、创伤小、射线杀伤半径适当等优点[6]。在衰变过程中，大部分衰变能量经内转换而释放X射线和γ射线，其中低能量的γ射线持续照射可以抑制肿瘤细胞的有丝分裂，引发肿瘤细胞损伤而导致肿瘤细胞凋亡[7]。低分化结肠腺癌因其恶性程度较高，增殖能力较强而预后不佳[8-10]。国外文献[11]报道，以125I放射粒子组织间植入治疗结肠腺癌时，除射线直接造成的细胞死亡外，其还具有诱导细胞凋亡的作用，提示其是一种有效的治疗方法。
3.1 125I粒子能抑制人低分化胃癌细胞的增殖
肿瘤细胞的增殖能力是决定其生长速度的重要因素。本实验结果显示，荷瘤鼠胃癌瘤体经125I粒子体外照射后，均出现体积减小、质量减轻的现象，提示肿瘤细胞的生长速度放缓，表明125I粒子组织间植入可以明显抑制胃癌瘤体的生长，延长瘤体的倍增时间；并且这种效应随照射时间的延长而逐渐明显，低剂量组植入28 d时其瘤体体积和质量较其余3组均较小（轻），效果较好。考虑与其放射线直接破坏癌细胞DNA双键，并通过激活与细胞凋亡相关的基因而诱导细胞程序性死亡有关[12]。
3.2 125I粒子剂量与放射性抗拒
本实验结果显示，14 d时，低、中及高剂量组的凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.05），但28 d时低剂量组的凋亡率较中剂量组和高剂量组均高（P < 0.05）；且同组内与14 d比较，3个实验组28 d时的凋亡率均较高（P < 0.05）。该结果提示，125I放射粒子作用于BGC823人低分化胃癌细胞的过程中，随着照射时间延长，低剂量组的肿瘤生长抑制作用更明显。这说明可能存在如下机理：肿瘤细胞为了尽量减少辐射对自身的毒性作用，增强了自身生存的保护性反应，这也是肿瘤放射性抗拒的体现[13-15]。
3.3 细胞周期蛋白与放射性抗拒
cyclinE和CDK2均是控制细胞从G1晚期进入S期的限速蛋白因子，其过表达可以促使细胞由G1期向S期过渡，使细胞增生失控而出现恶性肿瘤式增殖[16]。其在正常组织中一般呈低表达，而在恶性肿瘤组织中呈高表达[17]。有文献[18-23]报道，cyclinE-CDK2复合物与细胞周期依赖性激酶特异性抑制蛋白（p27KIP1）相结合后，在细胞周期的G1/S期调控中起抑制作用，从而影响肿瘤细胞的放射敏感性，说明cyclinE与肿瘤细胞的放射性抗拒相关。有研究[24-25]发现，细胞周期运行的起始因子即cyclinD1可下调p27KIP1的表达，增强肿瘤细胞的放射敏感性。本实验结果也恰恰证实了这一结论：在空白对照组中cyclinE mRNA呈高表达，而在3个实验组中cyclinE mRNA的表达下调；在28 d时，低剂量组的cyclinE mRNA表达水平最低。该结果说明，肿瘤细胞出现了放射性抗拒，并随放射剂量的增加而增强。
125I粒子组织间植入作为一种新兴的对肿瘤行放射治疗的技术，目前已被广泛应用于临床各种恶性肿瘤的放射治疗中[1-2]，其中在胃癌的治疗中，其与外科手术相结合，取得了良好的临床疗效[3]。粒子组织间植入放射治疗是解决术后局部复发及远处转移的有效方法，但其分子生物学机理尚不十分明确，多考虑与诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长并影响细胞增殖有关。细胞周期因子E（cyclinE）与细胞周期素依赖性激酶2（CDK2）均是细胞周期由G1期到S期的主要限速因子[4]。本实验通过将125I粒子植入BGC823人低分化胃癌组织后，从细胞生长、凋亡、cyclinE表达等方面进行量化分析，以探讨125I粒子组织间植入治疗胃癌的机理及其合适的剂量，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要材料和设备
SPF级BLAB nu/nu裸鼠64只，体质量17～22 g（平均20 g），4周龄，雄性，购自北京维通利华公司。主要材料：BGC823人低分化胃癌细胞系（中国科学院上海细胞库）、125I粒子（放射性剂量分别为1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq，上海欣科医药公司）、DMEM培养液（美国Hyclone公司）、胎牛血清（乌拉圭GIBCO公司）、RNA提取试剂盒（美国BECKMAN COULTER公司）、抗人表皮生长因子抗体（Anti-hEGFR，美国R & D SYSTEMS公司）、PCR试剂盒（深圳匹基生物工程有限公司）、Ferme-ntas逆转录试剂盒（杭州主诺生物技术有限公司）以及DNA提纯试剂盒（中国上海科敏生物科技有限公司）。主要设备：18G植入针（美国Mick Radio-Nuclear公司）、ABI实时荧光定量PCR（PT-PCR）仪（ABI7300，美国ABI公司）、流式细胞仪（MoFlo XDP，美国Beckman Coulter公司）、显微拍摄系统（CH2型，日本NIKON公司）及Primer Premier 5.0软件（加拿大Premier公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
将BGC823细胞复苏后置于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中进行培养，2～3 d传代1次。取对数生长期细胞，用PBS缓冲液配制成5×107个/mL的细胞悬液，用于制备荷瘤鼠模型。
1.2.2 制备荷瘤鼠模型
接到裸鼠后，在SPF条件下于动物实验室饲养2～3 d，以适应环境。取上述细胞悬液种植于裸鼠左肩胛皮下（1.00 mL），在SPF条件下于动物实验室饲养3周左右，待肿瘤生长至0.7～1.2 cm时作为荷瘤鼠模型，用于后续实验。
1.2.3 制备荷瘤鼠放射模型
将64只荷瘤鼠随机分为4组（随机数字表法）：空白对照组、低剂量组、中剂量组及高剂量组，每组16只。空白对照组仅植入1粒空白粒子（不含放射性元素）；低剂量组、中剂量组及高剂量组为实验组，分别植入放射剂量为1.48×10-7、2.22×10-7及2.96×10-7 Bq的125I粒子。植入方法：测量肿瘤长短径后，按照无菌原则用粒子植入针沿肿瘤长径方向将粒子植入到肿瘤中央，使粒子到肿瘤各边缘距离均＜1.0 cm。在SPF条件下于动物实验室饲养，各饲养笼之间的距离＞50.0 cm。本实验周期为28 d，时间较短，无裸鼠发生多个转移瘤的情况，且实验期间均无荷瘤裸鼠死亡。
1.2.4 测量肿瘤体积
分别于粒子植入前、植入后7、14、21及28 d，4组均随机（随机数字表法）抽取4只荷瘤鼠处死，剥取瘤体称重，并测量肿瘤长短径，计算肿瘤体积〔体积（mm3）=长径（mm）×短径（mm）2/2）〕。
1.2.5 流式细胞仪检测肿瘤组织的细胞凋亡率
分别于植入粒子后14 d和28 d，取上述标本采用流式细胞法（FCM）检测肿瘤组织的细胞凋亡率。取0.1 g肿瘤组织，以4℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次，每次10 min；采用剪碎机械法[5]制备单细胞悬液样品，然后加入PBS缓冲液，吹打收集的细胞，制成细胞悬液（1×103个/mL）；离心（2 000 r/min，r=13.5 cm，5 min），沉淀用PBS缓冲液洗涤2次，每次4 min；加入核糖核酸酶200.00μL，37℃孵育10 min；最后加入碘化丙啶（PI）1 000.00μL，染色30 min后上流式细胞仪分析。
1.2.6 RT-PCR法检测cyclinE mRNA的表达
于植入粒子后14 d和28 d，采用RT-PCR法检测肿瘤组织中cyclinE mRNA的表达。cyclinE基因的上游引物序列为5′-GGAGCGGGATGCGAAGGAGC-3′，下游引物序列为5′-AGCGGGGAGCCTCTGGAT-GG-3′（扩增长度为297 bp）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的上游引物序列为5′-GCATGGCCT-TCCGTGTCCCC-3′，下游引物序列为5′-GGCTGG-GGTCCAGGGGTCT-3′（扩增长度为339 bp）。本实验所需引物均由引物设计软件Primer Premier 5.0设计，并且经由美国国立生物技术信息中心（NCBI）中的BLAST比对以验证引物的准确性及可靠性。所有引物均由厦门浩博生物技术有限公司协助完成。取0.1 g肿瘤组织，按常规Trizol法提取总RNA，于-80℃冰箱中保存。本实验提取的RNA的浓度为1×10-3 ng/L，符合实验要求。取5μg RNA，逆转录为cDNA，逆转录步骤按试剂盒操作说明书进行，并以cDNA为模板进行PCR扩增。25.00μL PCR反应体系为：cDNA 2.00μL，Mg2+ 1.60μL，TaqDNA多聚酶0.20μL，10μmol/L的上下游引物各0.40μL，10μmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）0.50μL，10×PCR缓冲液2.50μL，核苷酸胶体染料（SYBR-GreenⅠ）0.13μL，再以焦碳酸二乙酯（DEPC）水补足至25.00μL。反应条件：95℃10 min预变性；95℃15 s变性，59.5℃25 s退火，72℃1 min延伸，共40个循环。PCR结束后采用溶解曲线确定产物的特异性，以得出循环阈值（threshold cycle，Ct），并计算目的基因的表达水平。cyclinE mRNA的表达水平采用公式2-△△Ct计算。
1.3 统计学方法
实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 4组裸鼠的肿瘤体积
除空白对照组外（空白对照组的变化不大），低、中及高剂量组的肿瘤体积随时间延长均呈下降趋势。①植入前4组裸鼠的肿瘤体积比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②植入粒子后7、14及21 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤体积均较小（P < 0.05）；而后3组之间的差异无统计学意义（P > 0.05）。③28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤体积均较小（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的肿瘤体积均较大（P < 0.05），而中剂量组与高剂量组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表 1。
表1
各时点4组裸鼠的肿瘤体积和质量（n=4，2.2 4组裸鼠的肿瘤质量
除空白对照组外（空白对照组的变化不大），低、中及高剂量组的肿瘤质量随时间延长均呈下降趋势。①植入前和植入后7 d，4组裸鼠的肿瘤质量比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。②植入粒子后14 d和21 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤质量均较轻（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的瘤体质量均较重（P < 0.05），而中剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的肿瘤质量均较轻（P < 0.05），且后3组两两比较差异均有统计学意义，低、中及高剂量组的瘤体质量依次增加（P < 0.05），见表 1。
2.3 4组裸鼠肿瘤组织的细胞凋亡率
①植入粒子后14 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的凋亡率均较高（P < 0.05），但后3组比较差异无统计学差异（P > 0.05）。②28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的凋亡率均较高（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的凋亡率均较低（P < 0.05），但中剂量组和高剂量组的凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③同组内与14 d比较，28 d时除空白对照组的差异无统计学意义外（P > 0.05），其余3组的凋亡率水平均较高（P < 0.05），见表 2和图 1。
表2
4组裸鼠肿瘤组织的细胞凋亡率及cyclinE mRNA表达水平结果（n=4）
Table2.
The results of tumor cell apoptosis rates and expression levels of cyclinE mRNA in nude mice of 4 groups (n=4)
图1
示粒子植入28 d时4组裸鼠肿瘤细胞的流式细胞图。1A：空白对照组；1B：低剂量组；1C：中剂量组；1D：高剂量组 图 2 28 d时3个实验组裸鼠的肿瘤组织行RT-PCR检测的溶解曲线及扩增曲线。2A：低剂量组的溶解曲线；2B：低剂量组的扩增曲线；2C：中剂量组的溶解曲线；2D：中剂量组的扩增曲线；2E：高剂量组的溶解曲线；2F：高剂量组的扩增曲线
Figure1.
Flow diagrams of tumor cells in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 1A: Blank control group; 1B: Low dose group; 1C: Middle dose group; 1D: High dose group Figure 2 Dissolve curves and amplification curves of tumor tissues in nude mice of 4 groups on 28th day after 125I implantation. 2A: Dissolve curve of low dose group; 2B: Amplification curve of low dose group; 2C: Dissolve curve of middle dose group; 2D: Amplification curve of middle dose group; 2E: Dissolve curve of high dose group; 1F: Amplification curve of high dose group
2.4 4组裸鼠肿瘤组织中cyclinE mRNA的表达
①植入粒子后14 d，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05），而后3组间的差异无统计学意义（P > 0.05）。②28 d时，与空白对照组比较，低、中及高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05）；与低剂量组比较，中剂量组和高剂量组的cyclinE mRNA表达水平均较高（P < 0.05），但中剂量组和高剂量组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。③同组内与14 d比较，28 d时除空白对照组的差异无统计学意义外（P > 0.05），其余3组的cyclinE mRNA表达水平均较低（P < 0.05），见表 2和图 2。
3 讨论
通过植入放射性粒子以近距离治疗恶性肿瘤是一种新的放疗手段，其中125I粒子是目前组织间放疗最常用的放射性粒子。它是一种人工合成的同位素，半衰期为60.1 d，相对较长；相比传统体外放射治疗，其具有精度高、创伤小、射线杀伤半径适当等优点[6]。在衰变过程中，大部分衰变能量经内转换而释放X射线和γ射线，其中低能量的γ射线持续照射可以抑制肿瘤细胞的有丝分裂，引发肿瘤细胞损伤而导致肿瘤细胞凋亡[7]。低分化结肠腺癌因其恶性程度较高，增殖能力较强而预后不佳[8-10]。国外文献[11]报道，以125I放射粒子组织间植入治疗结肠腺癌时，除射线直接造成的细胞死亡外，其还具有诱导细胞凋亡的作用，提示其是一种有效的治疗方法。
3.1 125I粒子能抑制人低分化胃癌细胞的增殖
肿瘤细胞的增殖能力是决定其生长速度的重要因素。本实验结果显示，荷瘤鼠胃癌瘤体经125I粒子体外照射后，均出现体积减小、质量减轻的现象，提示肿瘤细胞的生长速度放缓，表明125I粒子组织间植入可以明显抑制胃癌瘤体的生长，延长瘤体的倍增时间；并且这种效应随照射时间的延长而逐渐明显，低剂量组植入28 d时其瘤体体积和质量较其余3组均较小（轻），效果较好。考虑与其放射线直接破坏癌细胞DNA双键，并通过激活与细胞凋亡相关的基因而诱导细胞程序性死亡有关[12]。
3.2 125I粒子剂量与放射性抗拒
本实验结果显示，14 d时，低、中及高剂量组的凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.05），但28 d时低剂量组的凋亡率较中剂量组和高剂量组均高（P < 0.05）；且同组内与14 d比较，3个实验组28 d时的凋亡率均较高（P < 0.05）。该结果提示，125I放射粒子作用于BGC823人低分化胃癌细胞的过程中，随着照射时间延长，低剂量组的肿瘤生长抑制作用更明显。这说明可能存在如下机理：肿瘤细胞为了尽量减少辐射对自身的毒性作用，增强了自身生存的保护性反应，这也是肿瘤放射性抗拒的体现[13-15]。
3.3 细胞周期蛋白与放射性抗拒
cyclinE和CDK2均是控制细胞从G1晚期进入S期的限速蛋白因子，其过表达可以促使细胞由G1期向S期过渡，使细胞增生失控而出现恶性肿瘤式增殖[16]。其在正常组织中一般呈低表达，而在恶性肿瘤组织中呈高表达[17]。有文献[18-23]报道，cyclinE-CDK2复合物与细胞周期依赖性激酶特异性抑制蛋白（p27KIP1）相结合后，在细胞周期的G1/S期调控中起抑制作用，从而影响肿瘤细胞的放射敏感性，说明cyclinE与肿瘤细胞的放射性抗拒相关。有研究[24-25]发现，细胞周期运行的起始因子即cyclinD1可下调p27KIP1的表达，增强肿瘤细胞的放射敏感性。本实验结果也恰恰证实了这一结论：在空白对照组中cyclinE mRNA呈高表达，而在3个实验组中cyclinE mRNA的表达下调；在28 d时，低剂量组的cyclinE mRNA表达水平最低。该结果说明，肿瘤细胞出现了放射性抗拒，并随放射剂量的增加而增强。
