引用本文： 朱栋良, 尹小平, 王芳元. 长链非编码RNA-MALAT1对结直肠癌细胞介导的血管形成的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(1): 60-63. doi: 10.7507/1007-9424.20150015 复制
长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度在200～10 000碱基大小的RNA，本身虽然并不能编码基因，但能以多种形式参与基因表达和功能的调控[1-2]。近年来越来越多的研究[3-5]证实，某些lncRNA在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用，作为这些lncRNA其中之一的肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在肺癌、宫颈癌、消化系统肿瘤等多种恶性肿瘤中呈现异常过表达的状态，并能够通过激活某些信号转导通路如MAPK、Wnt等影响肿瘤的进程及预后。MALAT1在结直肠癌中发挥着重要的作用，如可促进细胞增殖、增强肿瘤侵袭转移能力等[6-10]，但MALAT1对结直肠癌血管形成的影响尚不清楚。本研究拟观察MALAT1对结直肠癌细胞SW48介导的内皮细胞血管形成的影响，并通过检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达，探索其中可能的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
MALAT1过表达质粒由咸宁市中心医院肝胆胰胃肠外科既往构建并保存，利用lipofectamine 2000并按照其说明书常规转染质粒。人VEGF酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司（货号：KGEHC108），无生长因子的Matrigel胶购自美国BD公司，抗HIF-1α及GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。10%胎牛血清购自浙江天杭四季青生物科技有限公司，DMEM培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 细胞及培养
人结直肠癌细胞株SW48及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由咸宁市中心医院肝胆胰胃肠外科既往保存，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃恒温温箱内培养48 h后传代，SW48取第39代，HUVEC取第18代。培养条件：①常氧培养，5%CO2、空气及饱和湿度；②乏氧培养，1%O2、5%CO2及94%N2。
1.3 VEGF含量检测
取上述培养传39代的SW48细胞接种于6孔板，转染MALAT1过表达质粒及对照质粒后，按上述条件常规培养或乏氧培养48 h，收集培养液上清，取部分上清按照ELISA试剂盒使用说明依次孵育、洗涤，最终酶标仪检测OD450值，通过标准曲线计算其中的VEGF含量。
1.4 内皮细胞体外成管实验
在96孔板中预先铺置50μL基质胶，置于37℃温箱内30 min凝固，将HUVEC细胞接种在基质胶上，并加入上述实验中获得的培养液上清，24 h后光学显微镜下观察成管现象。HUVEC细胞结成管型，并相互交叉形成网络，通过计数交叉的结点数间接表明细胞的体外成管能力，结点数越多，提示成管能力越强。
1.5 HIF-1α蛋白水平检测
采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法。收集上述转染后的SW48细胞，计数1×106个细胞，加入100μl放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解获取细胞总蛋白液，加入25μl的5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液100℃水浴条件下解交联恢复蛋白一级结构。蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及二抗后化学发光法显影，检测过表达MALAT1后SW48细胞中的HIF-1α蛋白水平的变化，以GAPDH作为内参照。以Image J进行的灰度值分析结果作为HIF-1α蛋白表达水平，实验重复3次。
1.6 统计学方法
用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 VEGF含量检测结果
转染MALAT1质粒及对照质粒后，通过ELISA检测SW48细胞培养液上清中VEGF的含量。结果显示：常规培养条件下，MALAT1组其培养液上清中的VEGF含量为（514±32）mg/L，较对照组的（110±14）mg/L明显增高（P < 0.05）；乏氧培养条件下，MALAT1组VEGF含量为（928±18）mg/L，较对照组的（230±21）mg/L也有明显增高（P < 0.05）。见图 1。该结果提示，过表达MALAT1可以促进结直肠癌细胞SW48分泌VEGF。
图1
示直肠癌细胞SW48分泌的VEGF检测结果
2.2 内皮细胞体外成管结果
利用上述实验中所得的培养液上清孵育HUVEC，并检测HUVEC细胞的体外成管能力。结果显示：不管是在常规培养抑或是乏氧培养条件下，与对照组相比，MALAT1组的内皮细胞形成血管微管的能力更强（P值分别为0.019及0.026）：计数的结点数常规培养对照组为（14±3）个，常规培养MALAT1组为（44±2）个，乏氧培养对照组为（38±4）个，乏氧培养MALAT1组为（74±3）个（图 2）。该结果提示，过表达MALAT1可以促进内皮细胞成管。
图2
示HUVEC细胞体外成管结果。2A：常规培养对照组；2B：常规培养MALAT1组；2C：乏氧培养对照组组；2D：乏氧培养MALAT1组
2.3 HIF-1α蛋白水平检测结果
收集上述转染后的SW48细胞采用Western blot法检测其中HIF-1α蛋白的表达情况，其结果见图 3。各组HIF-1α条带灰度值：常规培养对照组为947±34，常规培养MALAT1组2 877±39，乏氧培养对照组为5 292±54，乏氧培养MALAT1组为9 088±41。即乏氧培养条件下HIF-1α蛋白的表达量较常规培养条件下明显增高（P=0.037），而在常规培养和乏氧培养条件下，MALAT1组的HIF-1α蛋白表达量均高于对照组（P=0.029，P=0.034）。该结果提示，MALAT1可促进结直肠癌细胞SW48中HIF-1α蛋白的表达。
图3
示结直肠癌细胞SW48中HIF-1α蛋白表达检测结果
3 讨论
结直肠癌作为人类常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率逐年升高，快速进展及远处转移是其治疗中的主要难题。一般研究[11-15]认为，肿瘤细胞的快速增殖及高代谢能力使得肿瘤细胞处于一种乏氧状态，从而导致肿瘤细胞内某些相关信号转导通路的持续激活和促血管细胞因子的分泌增加，进而刺激肿瘤中微血管的形成，为肿瘤的持续生长和进展提供了更多的养分和原料。
MALAT1作为lncRNA家族中的一员，最早在非小细胞肺癌中发现，因在转移性的肺腺癌细胞株中的表达水平较无转移倾向的细胞株明显增高而得名[16]。近年来研究[3-5]发现，其广泛表达于人体各组织脏器中，且在宫颈癌、膀胱癌、消化系统肿瘤等多种恶性肿瘤中表达异常增高。一系列研究[17-21]证实，过表达MALAT1可加快肿瘤细胞的周期进程，从而促进细胞增殖，可通过调控bcl-2、Bcl-xl等基因的表达抑制肿瘤细胞的凋亡。MALAT1还可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、Wnt等信号通路促进结直肠癌的侵袭和转移[22-25]，但MALAT1对结直肠癌中血管形成是否也有一定的影响，尚无文献报道。
本研究通过在结直肠癌细胞株SW48中转染质粒过表达MALAT1，观察MALAT1对血管形成的影响，并初步探索其中可能的机理。结果发现，过表达MALAT1的SW48细胞培养液上清中的VEGF含量明显增加，而VEGF是促进血管形成最重要的细胞因子之一，肿瘤细胞可以通过旁分泌VEGF，作用于血管内皮细胞上的VEGF受体，促进内皮细胞的增殖和迁移，从而形成更多的微血管。本研究通过内皮细胞的体外成管实验验证了过表达MALAT1确实可以促进HUVEC的成管能力。为了进一步明确MALAT1促进肿瘤细胞分泌VEGF的具体机理，本研究采用Western blot法检测了SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达，HIF-1α是肿瘤细胞中影响VEGF表达的关键转录因子，其可以特异性地结合于VEGF基因的启动子区域，调控VEGF的转录活性。HIF-1α在细胞内的半衰期很短，在充足氧气条件下会迅速降解，因此本研究采取了常规培养和乏氧培养两种不同的细胞培养条件。结果发现，不管是在常规培养条件下还是在乏氧培养条件下，过表达MALAT1均可促进SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达，从而解释了MALAT1促进VEGF分泌及内皮细胞成管的原因。
综上所述，本研究发现，常规培养及乏氧培养条件下，在结直肠癌细胞株SW48中过表达MALAT1可促进其分泌VEGF，进而增强内皮细胞的体外成管能力；同时发现过表达MALAT1可促进结直肠癌SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达。提示MALAT1可能通过HIF-1α影响VEGF的分泌和内皮细胞形成血管。但MALAT1调控HIF-1α的具体分子学机理尚待阐明，是我们正在致力研究的内容。本研究结果提示，MALAT1可能通过影响血管形成参与结直肠癌的发生发展，这为结直肠癌的临床治疗提供了可能的新的药物靶点及监测指标。
长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度在200～10 000碱基大小的RNA，本身虽然并不能编码基因，但能以多种形式参与基因表达和功能的调控[1-2]。近年来越来越多的研究[3-5]证实，某些lncRNA在肿瘤的发生发展中发挥了重要的作用，作为这些lncRNA其中之一的肺腺癌转移相关转录因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在肺癌、宫颈癌、消化系统肿瘤等多种恶性肿瘤中呈现异常过表达的状态，并能够通过激活某些信号转导通路如MAPK、Wnt等影响肿瘤的进程及预后。MALAT1在结直肠癌中发挥着重要的作用，如可促进细胞增殖、增强肿瘤侵袭转移能力等[6-10]，但MALAT1对结直肠癌血管形成的影响尚不清楚。本研究拟观察MALAT1对结直肠癌细胞SW48介导的内皮细胞血管形成的影响，并通过检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的表达，探索其中可能的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
MALAT1过表达质粒由咸宁市中心医院肝胆胰胃肠外科既往构建并保存，利用lipofectamine 2000并按照其说明书常规转染质粒。人VEGF酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司（货号：KGEHC108），无生长因子的Matrigel胶购自美国BD公司，抗HIF-1α及GAPDH抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。10%胎牛血清购自浙江天杭四季青生物科技有限公司，DMEM培养基购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2 细胞及培养
人结直肠癌细胞株SW48及人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）由咸宁市中心医院肝胆胰胃肠外科既往保存，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃恒温温箱内培养48 h后传代，SW48取第39代，HUVEC取第18代。培养条件：①常氧培养，5%CO2、空气及饱和湿度；②乏氧培养，1%O2、5%CO2及94%N2。
1.3 VEGF含量检测
取上述培养传39代的SW48细胞接种于6孔板，转染MALAT1过表达质粒及对照质粒后，按上述条件常规培养或乏氧培养48 h，收集培养液上清，取部分上清按照ELISA试剂盒使用说明依次孵育、洗涤，最终酶标仪检测OD450值，通过标准曲线计算其中的VEGF含量。
1.4 内皮细胞体外成管实验
在96孔板中预先铺置50μL基质胶，置于37℃温箱内30 min凝固，将HUVEC细胞接种在基质胶上，并加入上述实验中获得的培养液上清，24 h后光学显微镜下观察成管现象。HUVEC细胞结成管型，并相互交叉形成网络，通过计数交叉的结点数间接表明细胞的体外成管能力，结点数越多，提示成管能力越强。
1.5 HIF-1α蛋白水平检测
采用蛋白质免疫印迹（Western blot）法。收集上述转染后的SW48细胞，计数1×106个细胞，加入100μl放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解获取细胞总蛋白液，加入25μl的5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）上样缓冲液100℃水浴条件下解交联恢复蛋白一级结构。蛋白样品行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）转膜并用脱脂奶粉封闭非特异性结合，然后依次孵育一抗及二抗后化学发光法显影，检测过表达MALAT1后SW48细胞中的HIF-1α蛋白水平的变化，以GAPDH作为内参照。以Image J进行的灰度值分析结果作为HIF-1α蛋白表达水平，实验重复3次。
1.6 统计学方法
用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 VEGF含量检测结果
转染MALAT1质粒及对照质粒后，通过ELISA检测SW48细胞培养液上清中VEGF的含量。结果显示：常规培养条件下，MALAT1组其培养液上清中的VEGF含量为（514±32）mg/L，较对照组的（110±14）mg/L明显增高（P < 0.05）；乏氧培养条件下，MALAT1组VEGF含量为（928±18）mg/L，较对照组的（230±21）mg/L也有明显增高（P < 0.05）。见图 1。该结果提示，过表达MALAT1可以促进结直肠癌细胞SW48分泌VEGF。
图1
示直肠癌细胞SW48分泌的VEGF检测结果
2.2 内皮细胞体外成管结果
利用上述实验中所得的培养液上清孵育HUVEC，并检测HUVEC细胞的体外成管能力。结果显示：不管是在常规培养抑或是乏氧培养条件下，与对照组相比，MALAT1组的内皮细胞形成血管微管的能力更强（P值分别为0.019及0.026）：计数的结点数常规培养对照组为（14±3）个，常规培养MALAT1组为（44±2）个，乏氧培养对照组为（38±4）个，乏氧培养MALAT1组为（74±3）个（图 2）。该结果提示，过表达MALAT1可以促进内皮细胞成管。
图2
示HUVEC细胞体外成管结果。2A：常规培养对照组；2B：常规培养MALAT1组；2C：乏氧培养对照组组；2D：乏氧培养MALAT1组
2.3 HIF-1α蛋白水平检测结果
收集上述转染后的SW48细胞采用Western blot法检测其中HIF-1α蛋白的表达情况，其结果见图 3。各组HIF-1α条带灰度值：常规培养对照组为947±34，常规培养MALAT1组2 877±39，乏氧培养对照组为5 292±54，乏氧培养MALAT1组为9 088±41。即乏氧培养条件下HIF-1α蛋白的表达量较常规培养条件下明显增高（P=0.037），而在常规培养和乏氧培养条件下，MALAT1组的HIF-1α蛋白表达量均高于对照组（P=0.029，P=0.034）。该结果提示，MALAT1可促进结直肠癌细胞SW48中HIF-1α蛋白的表达。
图3
示结直肠癌细胞SW48中HIF-1α蛋白表达检测结果
3 讨论
结直肠癌作为人类常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率逐年升高，快速进展及远处转移是其治疗中的主要难题。一般研究[11-15]认为，肿瘤细胞的快速增殖及高代谢能力使得肿瘤细胞处于一种乏氧状态，从而导致肿瘤细胞内某些相关信号转导通路的持续激活和促血管细胞因子的分泌增加，进而刺激肿瘤中微血管的形成，为肿瘤的持续生长和进展提供了更多的养分和原料。
MALAT1作为lncRNA家族中的一员，最早在非小细胞肺癌中发现，因在转移性的肺腺癌细胞株中的表达水平较无转移倾向的细胞株明显增高而得名[16]。近年来研究[3-5]发现，其广泛表达于人体各组织脏器中，且在宫颈癌、膀胱癌、消化系统肿瘤等多种恶性肿瘤中表达异常增高。一系列研究[17-21]证实，过表达MALAT1可加快肿瘤细胞的周期进程，从而促进细胞增殖，可通过调控bcl-2、Bcl-xl等基因的表达抑制肿瘤细胞的凋亡。MALAT1还可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、Wnt等信号通路促进结直肠癌的侵袭和转移[22-25]，但MALAT1对结直肠癌中血管形成是否也有一定的影响，尚无文献报道。
本研究通过在结直肠癌细胞株SW48中转染质粒过表达MALAT1，观察MALAT1对血管形成的影响，并初步探索其中可能的机理。结果发现，过表达MALAT1的SW48细胞培养液上清中的VEGF含量明显增加，而VEGF是促进血管形成最重要的细胞因子之一，肿瘤细胞可以通过旁分泌VEGF，作用于血管内皮细胞上的VEGF受体，促进内皮细胞的增殖和迁移，从而形成更多的微血管。本研究通过内皮细胞的体外成管实验验证了过表达MALAT1确实可以促进HUVEC的成管能力。为了进一步明确MALAT1促进肿瘤细胞分泌VEGF的具体机理，本研究采用Western blot法检测了SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达，HIF-1α是肿瘤细胞中影响VEGF表达的关键转录因子，其可以特异性地结合于VEGF基因的启动子区域，调控VEGF的转录活性。HIF-1α在细胞内的半衰期很短，在充足氧气条件下会迅速降解，因此本研究采取了常规培养和乏氧培养两种不同的细胞培养条件。结果发现，不管是在常规培养条件下还是在乏氧培养条件下，过表达MALAT1均可促进SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达，从而解释了MALAT1促进VEGF分泌及内皮细胞成管的原因。
综上所述，本研究发现，常规培养及乏氧培养条件下，在结直肠癌细胞株SW48中过表达MALAT1可促进其分泌VEGF，进而增强内皮细胞的体外成管能力；同时发现过表达MALAT1可促进结直肠癌SW48细胞中HIF-1α蛋白的表达。提示MALAT1可能通过HIF-1α影响VEGF的分泌和内皮细胞形成血管。但MALAT1调控HIF-1α的具体分子学机理尚待阐明，是我们正在致力研究的内容。本研究结果提示，MALAT1可能通过影响血管形成参与结直肠癌的发生发展，这为结直肠癌的临床治疗提供了可能的新的药物靶点及监测指标。
