引用本文： 李文仿, 王明华, 王耕, 赵宗彬. 乳腺癌患者外周血乳腺珠蛋白检测的临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(1): 91-94. doi: 10.7507/1007-9424.20150022 复制
目前乳腺癌被认为是一种全身性疾病，早期即可出现全身转移，该观点被全球乳腺癌专家广泛接受[1]。乳腺癌细胞通过血行转移，到达肝脏、脑、骨髓等重要靶器官，由微转移癌细胞逐步发生增殖，形成具有破坏力的乳腺癌转移灶，并可导致患者的死亡。是否发生血行转移被认为是影响乳腺癌患者生存的重要影响因素[2-3]。组织特异性人乳腺珠蛋白（human mammary gland globin，hMAM）mRNA的表达可以判断乳腺癌存在微转移的可能性，并被用于乳腺癌骨髓微转移的检测[4]，脑脊液中hMAM阳性表达是乳腺癌脑部转移的重要分子指标[5]；乳腺癌患者外周血中检出hMAM被认为预后较差[6]。本研究通过检测hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血的表达情况，以探讨外周血hMAM mRNA与乳腺癌患者的临床病理因素之间的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
本研究收集2011年6月至2012年10月期间笔者所在医院收治的乳腺癌患者78例以及乳腺良性病变患者30例（乳腺增生症15例，乳腺纤维腺瘤15例）作为研究对象。15例乳腺纤维腺瘤患者均为青年女性，年龄(18.3±3.2)岁（14～25岁）；15例乳腺增生症均为女性患者，年龄（36.3±7.3）岁（28～43岁）。78例乳腺癌患者均为女性，年龄（44.5±6.3）岁（34～55岁），其中≤45岁35例，> 45岁43例；肿瘤临床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴结转移0～3枚30例，4～9枚37例，> 9枚11例。本组所有乳腺癌患者均检测了雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体-2（Her-2）表达状态，结果ER阳性32例，PR阳性33例，Her-2阳性31例。
1.2 外周血hMAM mRNA表达的检测方法
1.2.1 标本采集
分别于手术后2～3周期后抽取患者肘静脉外周血5 mL，加入1/8体积的柠檬酸钠(武汉博士德生物有限公司)抗凝，采用淋巴细胞分离液(上海研谨生物有限公司，货号：LTS1077)分离单个核细胞, 在倒置显微镜（德国徕卡DMI4000）下计数细胞数在5×106个，用Trizol试剂盒（百泰克生物有限公司）抽提细胞总RNA，具体操作按试剂盒说明书进行。用紫外分光光度计（德国耶拿SPEKOL1300）测定260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），A260/A280的比值在1.8～2.0为质量合格RNA，用于后续实验。
1.2.2 引物
hMAM引物序列均由上海生工技术服务有限公司合成[6]，外引物的上游引物为5′-GAAGT-TGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物为5′-CTCACCATACCCTGC AGTTCTGTGAGC-3′；内引物的上游引物为5′-CTCCCAGCACTGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物为5′-CACCTCAACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′。以GAPDH作为内参物，引物序列上游为5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′，下游为5′-TCTAGACGGCAGGTAAGGTCCACC-3′。
1.2.3 巢式-逆转录-聚合酶链反应（Nested-RT-PCR）[6 ]
Trizol抽提细胞总RNA，第1步采用RT-PCR，采用Promega公司提供的试剂盒，反应体系如下：浓度为0.1 U/μL鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反应缓冲液10μL，浓度为0.5 mmol/L的外上游及外下游引物各1μL，取浓度为0.2 mmol/L的dNTP 1μL，浓度为0.1 U/μL的DNA聚合酶1μL, RNA量为2μg，加去离子水至总反应体积50μL。PCR反应条件为：48℃条件下45 min逆转录，94℃条件下行AMV RT灭活2 min及RNA/cDNA引物变性，PCR反应条件：94℃、3 min预变性，94℃、30 s解聚模板DNA，58℃条件下1 min退火，68℃条件下1.5 min扩增模板DNA，反应共计35个循环，70℃条件下延伸7 min后结束反应。第2步反应体系如下：AMV反应缓冲液10μL，浓度为0.5 mmol/L外上游及外下游引物各1μL，0.2 mmol/L的dNTP 1μL，浓度为0.1 U/μL的DNA聚合酶1μL，反应中取第1次反应产物2μL，加无离子水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃、3 min预变性，94℃、30 s解聚模板DNA，59℃条件下1 min退火，68℃条件下1 min扩增模板DNA，共35个循环，然后70℃条件下延伸7 min后结束反应。
1.2.4 结果观察
对PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色显示DNA条带，紫外线下光显像，201 bp处出现DNA条带时判断为阳性结果[6]。
1.3 统计学方法
数据分析采用SPSS 17.0统计分析软件，乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤及乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果先行3组间的χ2检验，如P < 0.05，则再用χ2分割进行两两比较分析；乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果与患者年龄、肿瘤直径、ER、PR及HER-2表达关系的分析采用χ2检验或精确概率分析方法，与肿瘤分期及淋巴结转移情况分析采用Mann-Whitney等级资料的非参数秩和检验方法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤和乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果
15例乳腺增生症及15例乳腺纤维腺瘤患者外周血中均未检测到hMAM mRNA表达，而在78例乳腺癌患者外周血中，共检出hMAM mRNA阳性表达者38例（48.72%），见图 1。乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达阳性率明显高于乳腺增生症及乳腺纤维腺瘤患者，3组间χ2检验结果提示其差异有统计学意义(χ2=22.549，P=0.000），而两两卡方分割检验重新确定检验水准α=0.0167，结果提示乳腺癌患者外周血中的hMAM mRNA表达阳性率与乳腺纤维腺瘤（χ2=12.357，P=0.000）和乳腺增生症（χ2=12.357，P=0.000）患者比较差异仍有统计学意义。
图1
示外周血hMAM mRNA表达的PCR产物凝胶电泳结果（巢式PCR法）。1：表达阳性乳腺癌；2：表达阴性乳腺癌；3：乳腺增生症；4：乳腺纤维腺瘤；M：标记条带
2.2 乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达与其临床病理特征的关系
结果见表 1。由表 1可见，乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型以及ER、PR和HER-2表达情况均无关（P > 0.05）；而与淋巴结转移（Z=-2.754，P=0.006）和肿瘤的临床分期（Z=-2.214，P=0.027）有关。
表1
乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA的表达与其临床病理特征的关系
3 讨论
乳腺癌是高度恶性的肿瘤，转移是乳腺癌的重要特点，即使在诊断早期，也可有血液、肝、脑等脏器微转移，是乳腺癌术后复发和转移的重要因素[7-8]。而目前认为腋窝淋巴结转移与否是乳腺癌患者是否需行腋窝淋巴结清扫的重要指标[9]。hMAM是第1个应用差异筛选分离到的新的乳腺组织相关基因，位于11号染色体q13上，具有两大特点：①表达仅限于成人乳腺组织；②在乳腺癌细胞株和乳腺肿瘤中过度表达[10]。hMAM是一种应用前景良好的乳腺癌标志物，在乳腺癌的筛选、诊断、疗效检测、预后判断、转移检测等方面都具有重要意义。Zhao等[11]通过RT-PCR方法检测98例乳腺癌患者外周血hMAM，发现在68例（69.4%）患者中可检测到hMAM，而且外周血hMAM阳性患者具有较低的无病生存率及无复发生存率。另一研究[12]发现，66例行手术后的乳腺癌患者外周血中hMAM阳性率为13.6%，但其中26例明确有转移患者的外周血hMAM阳性率却达到30.8%。本研究发现，乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达阳性率为48.72%，而乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症患者外周血中未检出hMAM mRNA表达，表明外周血检出hMAM mRNA具有一定的乳腺癌诊断特异性，与乳腺癌是否发生血性转移有关。笔者认为，乳腺癌患者外周血hMAM表达阳性率的差异性与不同研究纳入患者存在差异有一定关系，也可能与纳入样本量偏小有关。
影响乳腺癌预后的因素包括肿瘤大小、临床分期、腋窝淋巴结转移情况以及ER、PR和HER-2状况[13-14]。Ferro等[15]报道，外周血中hMAM的阳性表达与乳腺癌预后较差相关。Liu等[16]的研究表明，在乳腺癌骨髓微转移患者中可检测出hMAM，而且hMAM阳性患者更易发生远处转移，伴有较差的预后。淋巴结状态一直是乳腺癌预后的重要参数之一，Lee等[10]报道乳腺癌外周血中hMAM阳性表达与淋巴结转移密切相关。本研究结果也表明，在乳腺癌淋巴结转移患者中更易检出hMAM，提示外周血中hMAM表达阳性与患者的肿瘤是否发生转移存在一定的关系。本研究还发现，外周血hMAM的表达与患者的年龄、肿瘤大小、病理学类型以及ER、PR和HER-2状态无明显关系。ER及PR阳性乳腺癌细胞对以他莫西芬为基础的内分泌治疗效果较好，ER、PR和HER-2均阴性的三阴性乳腺癌对内分泌治疗一般认为无效，同时对化疗耐药，是乳腺癌相对预后较差的分子生物学标志物[17-18]。Lee等[10]报道，乳腺癌外周血中hMAM表达与ER和PR有关，但本研究中乳腺癌患者外周血hMAM的表达与患者的ER及PR表达情况无关，这可能与病例选择数量和hMAM表达检测方法，以及ER和PR阳性判断方法存在一定的差异有关。因此，外周血hMAM的表达与乳腺癌患者ER及PR表达的关系需要大样本、多中心研究来进一步确定，外周血hMAM表达与乳腺癌患者内分泌治疗及化疗敏感性是否有明确关系也需要进一步明确。
HER-2阳性是乳腺癌预后较差的指标，HER-2阳性乳腺癌细胞增殖率较高，对多种化疗药物耐药[19-20]。即使在早期HER-2阳性乳腺癌患者中，HER-2阳性仍是患者生存率较差的因素[21-22]。多因素分析结果表明，HER-2阳性是患者预后较差的因素，且有对内分泌治疗耐药、术后容易复发等特点[23-24]。本研究发现，HER-2阳性乳腺癌患者较阴性者hMAM mRNA表达阳性率并未明显增高，提示外周血发生微转移概率并未增高, 但可能与本研究样本量较少有关，是否HER-2阳性乳腺癌患者外周血更易检出hMAM值得进一步多中心大样本研究。Koh等[25]研究发现，hMAM在乳腺癌组织中的表达较正常乳腺上皮的表达明显增高，但乳腺癌细胞中过表达的hMAM却抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，表明hMAM并不一定促进乳腺癌细胞的增殖和转移，相反，Koh的研究发现hMAM在一定程度上具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能。因此，乳腺癌中hMAM与HER-2是否具有相互作用及具体的作用机理值得进一步探讨。
总之，本研究结果表明，乳腺癌患者外周血中存在hMAM表达，外周血检出hMAM是乳腺癌患者发生淋巴结、骨髓等脏器转移的标志，提示有较差的预后。因此，乳腺癌患者外周血检出hMAM可能在乳腺癌预后判断、临床治疗效果观察等方面具有重要的临床价值，具体的分子作用机理需进一步研究探讨。
目前乳腺癌被认为是一种全身性疾病，早期即可出现全身转移，该观点被全球乳腺癌专家广泛接受[1]。乳腺癌细胞通过血行转移，到达肝脏、脑、骨髓等重要靶器官，由微转移癌细胞逐步发生增殖，形成具有破坏力的乳腺癌转移灶，并可导致患者的死亡。是否发生血行转移被认为是影响乳腺癌患者生存的重要影响因素[2-3]。组织特异性人乳腺珠蛋白（human mammary gland globin，hMAM）mRNA的表达可以判断乳腺癌存在微转移的可能性，并被用于乳腺癌骨髓微转移的检测[4]，脑脊液中hMAM阳性表达是乳腺癌脑部转移的重要分子指标[5]；乳腺癌患者外周血中检出hMAM被认为预后较差[6]。本研究通过检测hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血的表达情况，以探讨外周血hMAM mRNA与乳腺癌患者的临床病理因素之间的关系。
1 资料和方法
1.1 一般资料
本研究收集2011年6月至2012年10月期间笔者所在医院收治的乳腺癌患者78例以及乳腺良性病变患者30例（乳腺增生症15例，乳腺纤维腺瘤15例）作为研究对象。15例乳腺纤维腺瘤患者均为青年女性，年龄(18.3±3.2)岁（14～25岁）；15例乳腺增生症均为女性患者，年龄（36.3±7.3）岁（28～43岁）。78例乳腺癌患者均为女性，年龄（44.5±6.3）岁（34～55岁），其中≤45岁35例，> 45岁43例；肿瘤临床分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴结转移0～3枚30例，4～9枚37例，> 9枚11例。本组所有乳腺癌患者均检测了雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体-2（Her-2）表达状态，结果ER阳性32例，PR阳性33例，Her-2阳性31例。
1.2 外周血hMAM mRNA表达的检测方法
1.2.1 标本采集
分别于手术后2～3周期后抽取患者肘静脉外周血5 mL，加入1/8体积的柠檬酸钠(武汉博士德生物有限公司)抗凝，采用淋巴细胞分离液(上海研谨生物有限公司，货号：LTS1077)分离单个核细胞, 在倒置显微镜（德国徕卡DMI4000）下计数细胞数在5×106个，用Trizol试剂盒（百泰克生物有限公司）抽提细胞总RNA，具体操作按试剂盒说明书进行。用紫外分光光度计（德国耶拿SPEKOL1300）测定260 nm和280 nm处的吸光度值（A值），A260/A280的比值在1.8～2.0为质量合格RNA，用于后续实验。
1.2.2 引物
hMAM引物序列均由上海生工技术服务有限公司合成[6]，外引物的上游引物为5′-GAAGT-TGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游引物为5′-CTCACCATACCCTGC AGTTCTGTGAGC-3′；内引物的上游引物为5′-CTCCCAGCACTGCTACGCAGGCTC-3′，下游引物为5′-CACCTCAACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′。以GAPDH作为内参物，引物序列上游为5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′，下游为5′-TCTAGACGGCAGGTAAGGTCCACC-3′。
1.2.3 巢式-逆转录-聚合酶链反应（Nested-RT-PCR）[6 ]
Trizol抽提细胞总RNA，第1步采用RT-PCR，采用Promega公司提供的试剂盒，反应体系如下：浓度为0.1 U/μL鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）反应缓冲液10μL，浓度为0.5 mmol/L的外上游及外下游引物各1μL，取浓度为0.2 mmol/L的dNTP 1μL，浓度为0.1 U/μL的DNA聚合酶1μL, RNA量为2μg，加去离子水至总反应体积50μL。PCR反应条件为：48℃条件下45 min逆转录，94℃条件下行AMV RT灭活2 min及RNA/cDNA引物变性，PCR反应条件：94℃、3 min预变性，94℃、30 s解聚模板DNA，58℃条件下1 min退火，68℃条件下1.5 min扩增模板DNA，反应共计35个循环，70℃条件下延伸7 min后结束反应。第2步反应体系如下：AMV反应缓冲液10μL，浓度为0.5 mmol/L外上游及外下游引物各1μL，0.2 mmol/L的dNTP 1μL，浓度为0.1 U/μL的DNA聚合酶1μL，反应中取第1次反应产物2μL，加无离子水至总体积50μL。PCR反应条件：94℃、3 min预变性，94℃、30 s解聚模板DNA，59℃条件下1 min退火，68℃条件下1 min扩增模板DNA，共35个循环，然后70℃条件下延伸7 min后结束反应。
1.2.4 结果观察
对PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色显示DNA条带，紫外线下光显像，201 bp处出现DNA条带时判断为阳性结果[6]。
1.3 统计学方法
数据分析采用SPSS 17.0统计分析软件，乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤及乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果先行3组间的χ2检验，如P < 0.05，则再用χ2分割进行两两比较分析；乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果与患者年龄、肿瘤直径、ER、PR及HER-2表达关系的分析采用χ2检验或精确概率分析方法，与肿瘤分期及淋巴结转移情况分析采用Mann-Whitney等级资料的非参数秩和检验方法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 乳腺增生症、乳腺纤维腺瘤和乳腺癌患者外周血hMAM mRNA表达检测结果
15例乳腺增生症及15例乳腺纤维腺瘤患者外周血中均未检测到hMAM mRNA表达，而在78例乳腺癌患者外周血中，共检出hMAM mRNA阳性表达者38例（48.72%），见图 1。乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达阳性率明显高于乳腺增生症及乳腺纤维腺瘤患者，3组间χ2检验结果提示其差异有统计学意义(χ2=22.549，P=0.000），而两两卡方分割检验重新确定检验水准α=0.0167，结果提示乳腺癌患者外周血中的hMAM mRNA表达阳性率与乳腺纤维腺瘤（χ2=12.357，P=0.000）和乳腺增生症（χ2=12.357，P=0.000）患者比较差异仍有统计学意义。
图1
示外周血hMAM mRNA表达的PCR产物凝胶电泳结果（巢式PCR法）。1：表达阳性乳腺癌；2：表达阴性乳腺癌；3：乳腺增生症；4：乳腺纤维腺瘤；M：标记条带
2.2 乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达与其临床病理特征的关系
结果见表 1。由表 1可见，乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA的表达与患者年龄、肿瘤大小、病理学类型以及ER、PR和HER-2表达情况均无关（P > 0.05）；而与淋巴结转移（Z=-2.754，P=0.006）和肿瘤的临床分期（Z=-2.214，P=0.027）有关。
表1
乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA的表达与其临床病理特征的关系
3 讨论
乳腺癌是高度恶性的肿瘤，转移是乳腺癌的重要特点，即使在诊断早期，也可有血液、肝、脑等脏器微转移，是乳腺癌术后复发和转移的重要因素[7-8]。而目前认为腋窝淋巴结转移与否是乳腺癌患者是否需行腋窝淋巴结清扫的重要指标[9]。hMAM是第1个应用差异筛选分离到的新的乳腺组织相关基因，位于11号染色体q13上，具有两大特点：①表达仅限于成人乳腺组织；②在乳腺癌细胞株和乳腺肿瘤中过度表达[10]。hMAM是一种应用前景良好的乳腺癌标志物，在乳腺癌的筛选、诊断、疗效检测、预后判断、转移检测等方面都具有重要意义。Zhao等[11]通过RT-PCR方法检测98例乳腺癌患者外周血hMAM，发现在68例（69.4%）患者中可检测到hMAM，而且外周血hMAM阳性患者具有较低的无病生存率及无复发生存率。另一研究[12]发现，66例行手术后的乳腺癌患者外周血中hMAM阳性率为13.6%，但其中26例明确有转移患者的外周血hMAM阳性率却达到30.8%。本研究发现，乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表达阳性率为48.72%，而乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症患者外周血中未检出hMAM mRNA表达，表明外周血检出hMAM mRNA具有一定的乳腺癌诊断特异性，与乳腺癌是否发生血性转移有关。笔者认为，乳腺癌患者外周血hMAM表达阳性率的差异性与不同研究纳入患者存在差异有一定关系，也可能与纳入样本量偏小有关。
影响乳腺癌预后的因素包括肿瘤大小、临床分期、腋窝淋巴结转移情况以及ER、PR和HER-2状况[13-14]。Ferro等[15]报道，外周血中hMAM的阳性表达与乳腺癌预后较差相关。Liu等[16]的研究表明，在乳腺癌骨髓微转移患者中可检测出hMAM，而且hMAM阳性患者更易发生远处转移，伴有较差的预后。淋巴结状态一直是乳腺癌预后的重要参数之一，Lee等[10]报道乳腺癌外周血中hMAM阳性表达与淋巴结转移密切相关。本研究结果也表明，在乳腺癌淋巴结转移患者中更易检出hMAM，提示外周血中hMAM表达阳性与患者的肿瘤是否发生转移存在一定的关系。本研究还发现，外周血hMAM的表达与患者的年龄、肿瘤大小、病理学类型以及ER、PR和HER-2状态无明显关系。ER及PR阳性乳腺癌细胞对以他莫西芬为基础的内分泌治疗效果较好，ER、PR和HER-2均阴性的三阴性乳腺癌对内分泌治疗一般认为无效，同时对化疗耐药，是乳腺癌相对预后较差的分子生物学标志物[17-18]。Lee等[10]报道，乳腺癌外周血中hMAM表达与ER和PR有关，但本研究中乳腺癌患者外周血hMAM的表达与患者的ER及PR表达情况无关，这可能与病例选择数量和hMAM表达检测方法，以及ER和PR阳性判断方法存在一定的差异有关。因此，外周血hMAM的表达与乳腺癌患者ER及PR表达的关系需要大样本、多中心研究来进一步确定，外周血hMAM表达与乳腺癌患者内分泌治疗及化疗敏感性是否有明确关系也需要进一步明确。
HER-2阳性是乳腺癌预后较差的指标，HER-2阳性乳腺癌细胞增殖率较高，对多种化疗药物耐药[19-20]。即使在早期HER-2阳性乳腺癌患者中，HER-2阳性仍是患者生存率较差的因素[21-22]。多因素分析结果表明，HER-2阳性是患者预后较差的因素，且有对内分泌治疗耐药、术后容易复发等特点[23-24]。本研究发现，HER-2阳性乳腺癌患者较阴性者hMAM mRNA表达阳性率并未明显增高，提示外周血发生微转移概率并未增高, 但可能与本研究样本量较少有关，是否HER-2阳性乳腺癌患者外周血更易检出hMAM值得进一步多中心大样本研究。Koh等[25]研究发现，hMAM在乳腺癌组织中的表达较正常乳腺上皮的表达明显增高，但乳腺癌细胞中过表达的hMAM却抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，表明hMAM并不一定促进乳腺癌细胞的增殖和转移，相反，Koh的研究发现hMAM在一定程度上具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能。因此，乳腺癌中hMAM与HER-2是否具有相互作用及具体的作用机理值得进一步探讨。
总之，本研究结果表明，乳腺癌患者外周血中存在hMAM表达，外周血检出hMAM是乳腺癌患者发生淋巴结、骨髓等脏器转移的标志，提示有较差的预后。因此，乳腺癌患者外周血检出hMAM可能在乳腺癌预后判断、临床治疗效果观察等方面具有重要的临床价值，具体的分子作用机理需进一步研究探讨。
