引用本文： 欧琴, 赵宗彬, 王耕, 李文仿. 人异黏蛋白在乙肝相关性肝癌组织中的表达及其临床病理意义. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(3): 301-306. doi: 10.7507/1007-9424.20150081 复制
肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第三大癌症死因，其最常见的病因是慢性乙肝及乙醇性肝病；有90.0%的HCC继发于肝硬变，且与慢性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝疾病等有关，但是目前有关其病因及发病的分子机理仍不清楚[1]。临床上由于其临床表现的异质性及缺乏有效的分子诊断指标和治疗策略，使得HCC的治疗尤为困难[2]。通过药物诱导HCC细胞向良性细胞及正常细胞分化是有效的抗肿瘤治疗方向，且癌蛋白靶向治疗在乙肝相关性HCC的治疗中具有一定的治疗前景[3]。人异黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，首先从星形胶质瘤细胞中克隆出来；此外，由于HIV感染后星形胶质瘤细胞中其表达水平升高，故其也被称为胶质瘤升高基因（astrocyte elevated gene 1，AEG-1） [4]。MTDH基因调节着众多信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路及转录激活蛋白-1（AP-1）信号通路，在促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭中发挥重要作用[5]。目前研究发现，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]等众多恶性肿瘤中，MTDH基因的表达上调。然而，在乙肝相关性HCC组织中MTDH基因及其蛋白的表达情况，以及其表达对预后判断的价值如何，研究得较少。本研究检测了乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白的表达情况，同时探讨了乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征的关系。
1 资料和方法
1.1 研究对象
回顾性收集2012年7月至2013年10月期间湖北医药学院附属太和医院保存的72例乙肝相关性HCC患者的标本。乙肝相关性HCC定义为患者在诊断HCC时具有明确的10年以上的乙肝病毒感染史，且血清HbsAg或标本HBV cDNA呈阳性[8]。72例患者术前均未接受化疗或者放疗，包括男35例，女37例；年龄25～63岁、（50.8±12.8）岁；肿瘤直径≤5 cm 36例，>5 cm 36例；肿瘤为单发结节37例，多发结节35例；包膜完整35例，包膜不完整37例；Edmondson分级[9]为Ⅰ级7例，Ⅱ级47例，Ⅲ级18例；巴塞罗纳分期（BCLC分期） [10]为0期10例，A期23例，B期30例，C期9例；存在微血管浸润34例，无微血管浸润38例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移32例。其中10例标本同时具有癌组织和癌旁组织，取癌灶中央组织作为癌组织，取距离肿瘤边缘以远2 cm的组织作为癌旁组织。所有组织标本立即冻存于液氮罐中，以备用于后续检测。
1.2 主要试剂和设备
RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物有限公司，逆转录试剂盒及荧光定量核苷酸胶体染料（SYBR）购自大连Takara生物有限公司，免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福建中杉金桥生物有限公司，Western blot配胶试剂盒及蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物有限公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体及鼠抗兔单克隆二抗均购自武汉博士德生物有限公司，兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体购自美国Abcam公司。设备：Western blot显色仪和T100 PCR仪（美国Bio Rad公司）、BioPhotometer plus核酸蛋白检测仪（德国Eppendorf公司）及MML1500显微镜（德国Kruess公司）。Western blot条带的灰度分析采用Image J 1.46软件（美国National Institutes of Health公司）。
1.3 方法
1.3.1 RNA提取及逆转录荧光定量检测
分别取已经冻存于液氮罐的乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织100 mg，提取RNA（操作按试剂盒说明书进行）。本实验提取的RNA的浓度和纯度均符合要求，其260 nm和280 nm处的紫外吸光度值（A值）比值在1.80～2.00之间。取2 μg RNA行逆转录，逆转录步骤按试剂盒说明进行。MTDH基因的引物序列：上游，5′-AAGAGGAAAACTGAGCCATCTG-3′；下游，5′-CGGCTAACATCCCACTGATAAT-3′（扩增长度为200 bp）。内参GAPDH基因的引物序列：上游，5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′；下游，5′-AG-AGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（扩增长度为210 bp）。MTDH基因及GAPDH基因引物均由广州瑞博生物有限公司合成。取2 μL逆转录产物DNA行荧光定量PCR（Q-PCR），反应体系同试剂盒说明书；反应条件：95 ℃ 1 min（预变性），94 ℃ 30 s（解聚模板DNA），60 ℃ 30 s（使引物与模板DNA结合），68 ℃ 1 min（扩增模板DNA），反应共计35个循环；70 ℃条件下延伸10 min后结束反应。通过溶解曲线判断产物的特异性后，根据循环阈值（Ct）结果，采用2-ΔCt法计算MTDH mRNA的相对表达水平，其中ΔCt=CtMTDH-CtGAPDH。实验重复3次，每一例组织MTDH mRNA的表达水平为3次实验的均值。
1.3.2 Western blot检测
分别取已经冻存于液氮罐的乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织100 mg，提取总蛋白（操作按试剂盒说明书进行）。取100 μg提取蛋白行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转膜至硝酸纤维薄膜上，以PBS溶液清洗3次，每次15 min；用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体（1∶1 000） 4 ℃过夜后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根过氧化酶标记的鼠抗兔单克隆二抗（1∶2 000）孵育1 h后，以PBS溶液清洗3次，每次10 min；加入显色剂进行显色，再以X光机读片。采用Image J 1.46软件测定MTDH蛋白和GAPDH条带的灰度值，以MTDH蛋白条带和GAPDH条带灰度值的比值作为MTDH蛋白的相对表达水平。
1.3.3 免疫组化染色
将HCC石蜡标本行4 μm厚切片后，置入二甲苯溶液中60 min脱蜡；以梯度乙醇水化后，置入pH值为6的0.01 mol/L枸橼酸钠溶液中进行抗原修复15 min（95 ℃）；加入1∶100兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体，4 ℃过夜孵育后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗（1∶2 000）后，于室温下作用30 min；滴加DAB溶液进行显色，以苏木精复染，再以二甲苯溶液透明，最后以中性树胶封片。通过染色强度及染色百分比结果评价免疫组化结果[11]。染色强度评分定义为：0分，阴性；1分，弱表达；2分，中等表达；3分，强表达。染色百分比定义为：0分，小于21.0%；1分，21.0%～40.0%；2分，41.0%～60.0%；3分，61.0%～80.0%；4分，81.0%～100%。最终染色得分为染色强度评分和染色百分比评分的乘积，7～12分为阳性表达，0～6分为阴性表达。采用PBS溶液代替一抗作为阴性对照，阳性对照采用已知MTDH蛋白呈阳性表达的乳腺癌组织切片。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白表达水平的比较采用配对t检验。在乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达与患者临床病理特征间关系的单因素分析时，计量资料采用两独立样本比较的t检验，计数资料采用成组χ2检验或确切概率法；多因素分析采用非条件logistic回归分析，其中α入=0.10，α出=0.15。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 乙肝相关性HCC组织和癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白的表达
Q-PCR结果显示，乙肝相关性HCC组织中MTDH mRNA的表达水平为8.50±0.84，癌旁组织为4.55±0.81，前者较高（t=10.797，P=0.000）。Western blot检测结果显示，乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达水平为0.65±0.24，癌旁组织为0.25±0.16，前者较高（t=6.375，P=0.013），见图 1。
图1
示乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH蛋白的电泳结果。1：乙肝相关性HCC组织；2：癌旁组织 图 2 示乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的免疫组化染色结果（SP ×200）。2A：阴性表达；2B：阳性表达
2.2 乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的免疫组化染色结果
显微镜下见乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白主要表达于胞浆，部分表达于细胞核。有42例（58.3%）乙肝相关性HCC组织其MTDH蛋白呈阳性表达，30例（41.7%）呈阴性表达（图 2）。
2.3 乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征的关系
2.3.1 单因素分析结果
单因素分析结果显示，在乙肝相关性HCC患者中，年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤结节数目、包膜完整情况及Edmondson分级均与乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达情况无关（P>0.05），而BCLC分期、微血管浸润和淋巴结转移情况均与MTDH蛋白的表达相关（P<0.05），BCLC分期为C期、有微血管浸润及有淋巴结转移者其MTDH蛋白的表达阳性率较高（表 1）。
表1
乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征关系的单因素分析结果
2.3.2 多因素分析结果
多因素回归分析时纳入因素的赋值情况见表 2。将表 2中的所有变量纳入logistic回归模型（变量筛选方法为向前法）。结果显示，Edmondson分级为Ⅲ级（OR=4.783，95% CI：2.663～11.918，P=0.020）、有微血管浸润（OR=37.790，95% CI：2.227～99.434，P=0.005）及有淋巴结转移者（OR=7.332，95% CI：3.325～30.669，P=0.023）其MTDH蛋白的表达阳性率更高（表 3）。
表2
乙肝相关性HCC患者中MTDH蛋白表达及其影响因素的赋值情况
表3
乙肝相关性HCC患者中MTDH蛋白表达影响因素的logistic回归分析结果
3 讨论
3.1 乙肝病毒感染促进HCC的发生与发展
HCC是世界第五大肿瘤，其发生是多因素相互作用的结果，且其病因复杂，发病人数逐渐增多[12]。据估计，仅有约10.0%～20.0%的HCC患者在诊断时尚可耐受手术，但术后5年生存率为28.6%，且术后复发率高达75.0% [13-14]。故研究HCC的发生机理对其预防和治疗均具有一定的价值。目前认为，病毒感染与HCC的发生有一定关系。已有研究[15]表明，丙肝病毒的Core蛋白可上调DNA甲基化酶1（DNMT1）的表达，并通过甲基化启动子而抑制p16蛋白的表达，从而发挥抑制肿瘤生长的作用。此外，我国的慢性乙肝患病率较高，而长期的乙肝病毒感染被认为是HCC高发的重要因素，在乙肝相关性HCC的发病机理中占据重要地位[16-17]。乙肝病毒感染在我国是HCC发生的重要影响因素，其在促进HCC表型转换及恶性进展中均发挥重要作用，且其逆转录区核苷酸基因的多态性及其HbsAg在HCC的发生过程中均具有一定的作用[18-19]。目前已经明确，乙肝病毒感染是原发性HCC的首要病因，约占50.0% [20-21]。研究[22]表明，乙肝病毒及其编码蛋白对宿主基因（尤其是肿瘤相关调控转录基因）的影响在癌症的发生过程中发挥重要作用。因此，研究乙肝相关性HCC的发病机理及其基因靶向治疗均具有一定的价值。
3.2 MTDH基因及其蛋白在乙肝相关性HCC组织中的表达上调
MTDH调节着众多信号通路，包括MAPK/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路和PI3K/AKT信号通路[5]。MTDH基因及其蛋白的高表达可促进癌细胞增殖、抑制凋亡、促进上皮-间质转换及促进侵袭和转移[23]。抑制MTDH基因及其蛋白的表达对一些恶性肿瘤具有一定的治疗价值，如敲除MTDH基因能明显抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移，诱导细胞凋亡[24]。研究[25]表明，MTDH蛋白与HCC的发生密切相关，HCC组织中高表达MTDH蛋白是患者预后较差的指标之一。Gong等[26]报道，MTDH蛋白在正常肝组织、乙肝病毒感染肝组织及乙肝相关性HCC组织中的表达阳性率分别为0、46.7%和64.4%。MTDH蛋白在乙肝相关性HCC组织中的表达阳性率明显高于乙肝病毒感染肝组织及正常肝组织，提示MTDH蛋白参与了乙肝相关性HCC的发生与发展，表明乙肝病毒感染可能导致肝细胞中MTDH基因的表达水平异常增高，从而导致肿瘤进展，但具体作用机理目前并不清楚。本研究结果表明，乙肝相关性HCC患者的MTDH mRNA及其蛋白的表达水平均高于癌旁组织，且在乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白阳性表达者占58.3%，提示MTDH可能与乙肝相关性HCC的发生有关。
3.3 MTDH蛋白促进乙肝相关性HCC组织的生长、侵袭和转移
有研究[27]表明，HCC患者的诸多临床病理特征，包括区域淋巴结转移、肿瘤分期、微血管浸润情况等均与HCC患者的预后密切相关。本研究通过免疫组化染色方法检测了72例乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达情况，并探索了其表达与患者临床病理特征的关系。结果发现，在乙肝相关性HCC患者中，Edmondson分级、微血管浸润及淋巴结转移均与MTDH蛋白的表达相关（P<0.05）。这表明，MTDH蛋白可能在预测乙肝相关性HCC患者的预后方面具有重要的意义；乙肝病毒感染可能促进乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达，从而促进乙肝相关性HCC组织的生长、侵袭和转移。
总之，本研究结果表明，乙肝相关性HCC组织中存在MTDH mRNA及其蛋白的异常表达；而且在乙肝相关性HCC患者中，Edmondson分级、淋巴结转移及微血管浸润情况均与MTDH蛋白的表达相关。该结果提示，MTDH mRNA及其蛋白的高表达可能是乙肝相关性HCC发生的重要机理之一，这对进一步研究乙肝相关性HCC发生的分子机理具有一定的价值。然而，本研究的样本量较小，乙肝病毒感染是否可以促进MTDH基因及其蛋白的表达及其具体作用机理尚需要大样本研究进一步探讨。
肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界第三大癌症死因，其最常见的病因是慢性乙肝及乙醇性肝病；有90.0%的HCC继发于肝硬变，且与慢性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝疾病等有关，但是目前有关其病因及发病的分子机理仍不清楚[1]。临床上由于其临床表现的异质性及缺乏有效的分子诊断指标和治疗策略，使得HCC的治疗尤为困难[2]。通过药物诱导HCC细胞向良性细胞及正常细胞分化是有效的抗肿瘤治疗方向，且癌蛋白靶向治疗在乙肝相关性HCC的治疗中具有一定的治疗前景[3]。人异黏蛋白（metaherin，MTDH）基因定位于8q22，首先从星形胶质瘤细胞中克隆出来；此外，由于HIV感染后星形胶质瘤细胞中其表达水平升高，故其也被称为胶质瘤升高基因（astrocyte elevated gene 1，AEG-1） [4]。MTDH基因调节着众多信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、三磷酸酰肌醇蛋白激酶（PI3K/AKT）信号通路及转录激活蛋白-1（AP-1）信号通路，在促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭中发挥重要作用[5]。目前研究发现，在乳腺癌[6]、膀胱癌[7]等众多恶性肿瘤中，MTDH基因的表达上调。然而，在乙肝相关性HCC组织中MTDH基因及其蛋白的表达情况，以及其表达对预后判断的价值如何，研究得较少。本研究检测了乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白的表达情况，同时探讨了乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征的关系。
1 资料和方法
1.1 研究对象
回顾性收集2012年7月至2013年10月期间湖北医药学院附属太和医院保存的72例乙肝相关性HCC患者的标本。乙肝相关性HCC定义为患者在诊断HCC时具有明确的10年以上的乙肝病毒感染史，且血清HbsAg或标本HBV cDNA呈阳性[8]。72例患者术前均未接受化疗或者放疗，包括男35例，女37例；年龄25～63岁、（50.8±12.8）岁；肿瘤直径≤5 cm 36例，>5 cm 36例；肿瘤为单发结节37例，多发结节35例；包膜完整35例，包膜不完整37例；Edmondson分级[9]为Ⅰ级7例，Ⅱ级47例，Ⅲ级18例；巴塞罗纳分期（BCLC分期） [10]为0期10例，A期23例，B期30例，C期9例；存在微血管浸润34例，无微血管浸润38例；有淋巴结转移40例，无淋巴结转移32例。其中10例标本同时具有癌组织和癌旁组织，取癌灶中央组织作为癌组织，取距离肿瘤边缘以远2 cm的组织作为癌旁组织。所有组织标本立即冻存于液氮罐中，以备用于后续检测。
1.2 主要试剂和设备
RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物有限公司，逆转录试剂盒及荧光定量核苷酸胶体染料（SYBR）购自大连Takara生物有限公司，免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福建中杉金桥生物有限公司，Western blot配胶试剂盒及蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物有限公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体及鼠抗兔单克隆二抗均购自武汉博士德生物有限公司，兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体购自美国Abcam公司。设备：Western blot显色仪和T100 PCR仪（美国Bio Rad公司）、BioPhotometer plus核酸蛋白检测仪（德国Eppendorf公司）及MML1500显微镜（德国Kruess公司）。Western blot条带的灰度分析采用Image J 1.46软件（美国National Institutes of Health公司）。
1.3 方法
1.3.1 RNA提取及逆转录荧光定量检测
分别取已经冻存于液氮罐的乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织100 mg，提取RNA（操作按试剂盒说明书进行）。本实验提取的RNA的浓度和纯度均符合要求，其260 nm和280 nm处的紫外吸光度值（A值）比值在1.80～2.00之间。取2 μg RNA行逆转录，逆转录步骤按试剂盒说明进行。MTDH基因的引物序列：上游，5′-AAGAGGAAAACTGAGCCATCTG-3′；下游，5′-CGGCTAACATCCCACTGATAAT-3′（扩增长度为200 bp）。内参GAPDH基因的引物序列：上游，5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′；下游，5′-AG-AGGCAGGGATGATGTTCTG-3′（扩增长度为210 bp）。MTDH基因及GAPDH基因引物均由广州瑞博生物有限公司合成。取2 μL逆转录产物DNA行荧光定量PCR（Q-PCR），反应体系同试剂盒说明书；反应条件：95 ℃ 1 min（预变性），94 ℃ 30 s（解聚模板DNA），60 ℃ 30 s（使引物与模板DNA结合），68 ℃ 1 min（扩增模板DNA），反应共计35个循环；70 ℃条件下延伸10 min后结束反应。通过溶解曲线判断产物的特异性后，根据循环阈值（Ct）结果，采用2-ΔCt法计算MTDH mRNA的相对表达水平，其中ΔCt=CtMTDH-CtGAPDH。实验重复3次，每一例组织MTDH mRNA的表达水平为3次实验的均值。
1.3.2 Western blot检测
分别取已经冻存于液氮罐的乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织100 mg，提取总蛋白（操作按试剂盒说明书进行）。取100 μg提取蛋白行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转膜至硝酸纤维薄膜上，以PBS溶液清洗3次，每次15 min；用5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体（1∶1 000） 4 ℃过夜后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根过氧化酶标记的鼠抗兔单克隆二抗（1∶2 000）孵育1 h后，以PBS溶液清洗3次，每次10 min；加入显色剂进行显色，再以X光机读片。采用Image J 1.46软件测定MTDH蛋白和GAPDH条带的灰度值，以MTDH蛋白条带和GAPDH条带灰度值的比值作为MTDH蛋白的相对表达水平。
1.3.3 免疫组化染色
将HCC石蜡标本行4 μm厚切片后，置入二甲苯溶液中60 min脱蜡；以梯度乙醇水化后，置入pH值为6的0.01 mol/L枸橼酸钠溶液中进行抗原修复15 min（95 ℃）；加入1∶100兔抗人MTDH蛋白单克隆抗体，4 ℃过夜孵育后，以PBS溶液清洗3次，每次5 min；加入辣根过氧化物标记的羊抗兔二抗（1∶2 000）后，于室温下作用30 min；滴加DAB溶液进行显色，以苏木精复染，再以二甲苯溶液透明，最后以中性树胶封片。通过染色强度及染色百分比结果评价免疫组化结果[11]。染色强度评分定义为：0分，阴性；1分，弱表达；2分，中等表达；3分，强表达。染色百分比定义为：0分，小于21.0%；1分，21.0%～40.0%；2分，41.0%～60.0%；3分，61.0%～80.0%；4分，81.0%～100%。最终染色得分为染色强度评分和染色百分比评分的乘积，7～12分为阳性表达，0～6分为阴性表达。采用PBS溶液代替一抗作为阴性对照，阳性对照采用已知MTDH蛋白呈阳性表达的乳腺癌组织切片。
1.4 统计学方法
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白表达水平的比较采用配对t检验。在乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达与患者临床病理特征间关系的单因素分析时，计量资料采用两独立样本比较的t检验，计数资料采用成组χ2检验或确切概率法；多因素分析采用非条件logistic回归分析，其中α入=0.10，α出=0.15。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 乙肝相关性HCC组织和癌旁组织中MTDH mRNA及其蛋白的表达
Q-PCR结果显示，乙肝相关性HCC组织中MTDH mRNA的表达水平为8.50±0.84，癌旁组织为4.55±0.81，前者较高（t=10.797，P=0.000）。Western blot检测结果显示，乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达水平为0.65±0.24，癌旁组织为0.25±0.16，前者较高（t=6.375，P=0.013），见图 1。
图1
示乙肝相关性HCC组织及其癌旁组织中MTDH蛋白的电泳结果。1：乙肝相关性HCC组织；2：癌旁组织 图 2 示乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的免疫组化染色结果（SP ×200）。2A：阴性表达；2B：阳性表达
2.2 乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的免疫组化染色结果
显微镜下见乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白主要表达于胞浆，部分表达于细胞核。有42例（58.3%）乙肝相关性HCC组织其MTDH蛋白呈阳性表达，30例（41.7%）呈阴性表达（图 2）。
2.3 乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征的关系
2.3.1 单因素分析结果
单因素分析结果显示，在乙肝相关性HCC患者中，年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤结节数目、包膜完整情况及Edmondson分级均与乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达情况无关（P>0.05），而BCLC分期、微血管浸润和淋巴结转移情况均与MTDH蛋白的表达相关（P<0.05），BCLC分期为C期、有微血管浸润及有淋巴结转移者其MTDH蛋白的表达阳性率较高（表 1）。
表1
乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白表达与患者临床病理特征关系的单因素分析结果
2.3.2 多因素分析结果
多因素回归分析时纳入因素的赋值情况见表 2。将表 2中的所有变量纳入logistic回归模型（变量筛选方法为向前法）。结果显示，Edmondson分级为Ⅲ级（OR=4.783，95% CI：2.663～11.918，P=0.020）、有微血管浸润（OR=37.790，95% CI：2.227～99.434，P=0.005）及有淋巴结转移者（OR=7.332，95% CI：3.325～30.669，P=0.023）其MTDH蛋白的表达阳性率更高（表 3）。
表2
乙肝相关性HCC患者中MTDH蛋白表达及其影响因素的赋值情况
表3
乙肝相关性HCC患者中MTDH蛋白表达影响因素的logistic回归分析结果
3 讨论
3.1 乙肝病毒感染促进HCC的发生与发展
HCC是世界第五大肿瘤，其发生是多因素相互作用的结果，且其病因复杂，发病人数逐渐增多[12]。据估计，仅有约10.0%～20.0%的HCC患者在诊断时尚可耐受手术，但术后5年生存率为28.6%，且术后复发率高达75.0% [13-14]。故研究HCC的发生机理对其预防和治疗均具有一定的价值。目前认为，病毒感染与HCC的发生有一定关系。已有研究[15]表明，丙肝病毒的Core蛋白可上调DNA甲基化酶1（DNMT1）的表达，并通过甲基化启动子而抑制p16蛋白的表达，从而发挥抑制肿瘤生长的作用。此外，我国的慢性乙肝患病率较高，而长期的乙肝病毒感染被认为是HCC高发的重要因素，在乙肝相关性HCC的发病机理中占据重要地位[16-17]。乙肝病毒感染在我国是HCC发生的重要影响因素，其在促进HCC表型转换及恶性进展中均发挥重要作用，且其逆转录区核苷酸基因的多态性及其HbsAg在HCC的发生过程中均具有一定的作用[18-19]。目前已经明确，乙肝病毒感染是原发性HCC的首要病因，约占50.0% [20-21]。研究[22]表明，乙肝病毒及其编码蛋白对宿主基因（尤其是肿瘤相关调控转录基因）的影响在癌症的发生过程中发挥重要作用。因此，研究乙肝相关性HCC的发病机理及其基因靶向治疗均具有一定的价值。
3.2 MTDH基因及其蛋白在乙肝相关性HCC组织中的表达上调
MTDH调节着众多信号通路，包括MAPK/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路和PI3K/AKT信号通路[5]。MTDH基因及其蛋白的高表达可促进癌细胞增殖、抑制凋亡、促进上皮-间质转换及促进侵袭和转移[23]。抑制MTDH基因及其蛋白的表达对一些恶性肿瘤具有一定的治疗价值，如敲除MTDH基因能明显抑制非小细胞肺癌的侵袭和转移，诱导细胞凋亡[24]。研究[25]表明，MTDH蛋白与HCC的发生密切相关，HCC组织中高表达MTDH蛋白是患者预后较差的指标之一。Gong等[26]报道，MTDH蛋白在正常肝组织、乙肝病毒感染肝组织及乙肝相关性HCC组织中的表达阳性率分别为0、46.7%和64.4%。MTDH蛋白在乙肝相关性HCC组织中的表达阳性率明显高于乙肝病毒感染肝组织及正常肝组织，提示MTDH蛋白参与了乙肝相关性HCC的发生与发展，表明乙肝病毒感染可能导致肝细胞中MTDH基因的表达水平异常增高，从而导致肿瘤进展，但具体作用机理目前并不清楚。本研究结果表明，乙肝相关性HCC患者的MTDH mRNA及其蛋白的表达水平均高于癌旁组织，且在乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白阳性表达者占58.3%，提示MTDH可能与乙肝相关性HCC的发生有关。
3.3 MTDH蛋白促进乙肝相关性HCC组织的生长、侵袭和转移
有研究[27]表明，HCC患者的诸多临床病理特征，包括区域淋巴结转移、肿瘤分期、微血管浸润情况等均与HCC患者的预后密切相关。本研究通过免疫组化染色方法检测了72例乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达情况，并探索了其表达与患者临床病理特征的关系。结果发现，在乙肝相关性HCC患者中，Edmondson分级、微血管浸润及淋巴结转移均与MTDH蛋白的表达相关（P<0.05）。这表明，MTDH蛋白可能在预测乙肝相关性HCC患者的预后方面具有重要的意义；乙肝病毒感染可能促进乙肝相关性HCC组织中MTDH蛋白的表达，从而促进乙肝相关性HCC组织的生长、侵袭和转移。
总之，本研究结果表明，乙肝相关性HCC组织中存在MTDH mRNA及其蛋白的异常表达；而且在乙肝相关性HCC患者中，Edmondson分级、淋巴结转移及微血管浸润情况均与MTDH蛋白的表达相关。该结果提示，MTDH mRNA及其蛋白的高表达可能是乙肝相关性HCC发生的重要机理之一，这对进一步研究乙肝相关性HCC发生的分子机理具有一定的价值。然而，本研究的样本量较小，乙肝病毒感染是否可以促进MTDH基因及其蛋白的表达及其具体作用机理尚需要大样本研究进一步探讨。
