引用本文： 沈宏, 张宁. 亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T和A1298C位点多态性与胃癌易感性的相关性分析. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(3): 351-353. doi: 10.7507/1007-9424.20150094 复制
胃癌是一种最常见的消化系统肿瘤，大部分胃癌被发现时已处进展期，其5年生存率为15%～20% [1]。胃癌的病因至今（至2014年）尚未完全清楚，大多数学者[2-4]认为，饮食、感染、慢性炎症刺激以及遗传因素均起着重要的作用。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因的主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，其包括2个常见的多态性位点：C677T与A1298C位点。有研究[5]发现，MTHFR基因位点的多态性改变可能影响肿瘤的易感性和生物学行为。目前，关于MTHFR基因多态性与胃癌的相关性并未达成共识，故笔者采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）对MTHFR基因C677T与A1298C位点的基因型进行了检测分析，旨在探讨其与胃癌易感性的关系。
1 临床资料
1.1 一般资料
回顾性收集2008年1月至2014年1月期间在笔者所在医院住院的、行MTHFR基因C677T和A1298C位点检测的160例胃癌患者，所有患者均经活组织病理学检查证实为胃癌。同时设立对照组（160例），均为同期自愿接受上述基因检测的健康体检人员。2组患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史及高脂饮食情况比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
胃癌组患者和对照组健康人群的一般资料比较
1.2 主要试剂及设备
DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶5 U MspI（MBI）及其他相关试剂均购自天津赛尔生物技术公司。设备：Bio-Rad热循环仪（T100型，美国Bio-rad伯乐公司）、紫外分光光度计（UV-1750型，广西德尔菲仪器设备有限公司）及凝胶成像系统（Gene Genius，Syngene公司）。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因组DNA的提取
采用酚/氯仿法[6]提取2组患者的外周血基因组DNA。提取的基因组DNA经紫外线分光光度计检测吸光度值（A值），以A260/A280值鉴定基因组DNA的纯度和浓度。2组患者的外周血基因组DNA的A260/A280值均在1.8左右，表明基因组DNA纯度高，无蛋白质、RNA等污染。符合要求后，将基因组DNA用无菌EP管分装，在-80 ℃条件下保存。
1.3.2 多态性位点引物设计
根据MTHFR基因C677T位点和A1298C位点对应的基因序列分别设计PCR扩增引物。C677T位点的上游引物为5′-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3′，下游引物为5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，扩增长度为198 bp。A1298C位点的上游引物为5′-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3′，下游引物为：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′，扩增长度为163 bp。所有的引物均由上海捷瑞公司合成。
1.3.3 PCR反应体系及反应条件
PCR反应体系为25.0 μL体系：取2.0 μL基因组DNA，0.4 μmol/mL的上下游引物各1.0 μL，10×PCR缓冲液2.7 μL，1.5 mmol/mL的MgCl2 2.0 μL，1.5 U Tag酶12.5 μL，100 μmol/mL的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 0.6 μL，再以双蒸水（ddH2O）补足至25.0 μL。采用Bio-Rad热循环仪进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，63 ℃复性55 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后再72 ℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反应体系为25.0 μL体系：PCR产物5.0 μL，10×PCR缓冲液3.5 μL，MBI 5.0 μL，以ddH2O补足至25.0 μL。在37 ℃条件下水浴过夜。将酶切产物行2%琼脂糖凝胶电泳（120 V、30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
1.5 结果
MTHFR基因C677T位点的基因型包括CC、CT及TT型，A1298C位点包括AA、AC及CC型。2组C677T和A1298C位点的基因型分布情况见表 2。由表 2可见，胃癌组C677T和A1298C位点的基因型分布与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示MTHFR基因C677T和A1298C位点与胃癌的易感性均无明显关联。
表2
2组MTHFR基因C677T位点和A1298C位点基因型的分布情况（例）
2 讨论
在我国，胃癌的发病率约为29.9/10万，是仅次于肺癌的第二高发肿瘤，其死亡率约为22.3/10万[7]。其中早期胃癌患者约占胃癌患者总数的10%左右，这与早期胃癌的诊断水平和高危人群的筛查水平较低均有着密切的关系[8]。有流行病学研究[9]结果表明，基因易感性在胃癌的发生与发展过程中扮演着重要的角色，而疾病的发生和发展受多基因调控。因此，探索基因多态性与胃癌的关系对胃癌的早期诊断具有重要的意义。
MTHFR基因定位于1p36.3，包括11个外显子和10个内含子，cDNA序列全长2.2 kb；现已发现，MTHFR基因有20多种突变位点，其中以C677T和A1298C位点最为常见[10]。然而，在不同国家、不同地区及不同民族中，C677T和A1298C位点的基因型分布有显著的差异[11]。MTHFR基因的缺陷将导致多种机体基础生化过程的紊乱，包括DNA复制、细胞周期的调控，以及DNA和蛋白质的甲基化修饰，从而引起心血管疾病、神经管缺陷、癌症等多种疾病[12]。Meta分析[13]结果表明，MTHFR基因C677T位点的CT变异与乳腺癌的易感性相关，A1298C位点的AC变异与乳腺癌的易感性无关。然而，其与胃癌的相关性仍处于探索阶段。本研究结果表明，胃癌组患者MTHFR基因C677T位点和A1298C位点的基因型分布与对照组患者比较差异均无统计学意义（P>0.05）。然而，因纳入样本量有限，这一结果并不能说明整个天津地区、中国甚至亚洲人群的整体情况，需进一步研究。
此外，疾病的发生和发展受多基因位点的调控，机理复杂。目前，已有众多学者[14-19]报道了不同基因位点多态性与胃癌发生的潜在联系，主要包括肿瘤坏死因子-α-308 （TNF-α-308）基因、TNF-β基因、端粒酶逆转录酶（hTERT）基因、胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）基因、p53基因、着色性干皮病基因组（xpc）基因等。其中，hTERT基因rs2853676位点多态性与胃癌的遗传易感性有关，其可增加胃癌发生的风险[16]。IGF2R基因codon2020位点多态性可能对中国人群罹患胃癌具有保护作用[17]。p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性与青海地区人群胃癌的易感性存在相关性，携带p53基因Arg72Pro野生型纯合子（Arg/Arg）可能是青海地区人群罹患胃癌的危险因素[18]。目前多认为，TNF-α-308基因、TNF-β基因及xpc基因多态性与胃癌的发生均无显著相关性[14-15, 19]。本研究结果发现，MTHFR基因C677T和A1298C位点的基因型分布与胃癌的易感性亦无显著相关性。在基因水平，胃癌的发生可能受多基因调控，不同的基因位点可能起到协同或拮抗的作用。目前的研究结果仍不能说明某一个基因位点多态性即能导致胃癌的发生，其必然是多基因调控的结果，且其真实的作用机理仍需大量研究证实。
总之，MTHFR基因位点的多态性与多种肿瘤的发生存在关联[20-22]，MTHFR基因不同位点多态性与胃癌易感性的关系仍在探索阶段。本研究结果表明，MTHFR基因C677T和A1298C位点多态性与胃癌易感性不存在相关性。然而，非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此该结论仍需大样本、高质量研究来进一步验证。
胃癌是一种最常见的消化系统肿瘤，大部分胃癌被发现时已处进展期，其5年生存率为15%～20% [1]。胃癌的病因至今（至2014年）尚未完全清楚，大多数学者[2-4]认为，饮食、感染、慢性炎症刺激以及遗传因素均起着重要的作用。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）基因的主要作用是在叶酸代谢通路中将5,10-亚甲基四氢叶酸转化为具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸，其包括2个常见的多态性位点：C677T与A1298C位点。有研究[5]发现，MTHFR基因位点的多态性改变可能影响肿瘤的易感性和生物学行为。目前，关于MTHFR基因多态性与胃癌的相关性并未达成共识，故笔者采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）对MTHFR基因C677T与A1298C位点的基因型进行了检测分析，旨在探讨其与胃癌易感性的关系。
1 临床资料
1.1 一般资料
回顾性收集2008年1月至2014年1月期间在笔者所在医院住院的、行MTHFR基因C677T和A1298C位点检测的160例胃癌患者，所有患者均经活组织病理学检查证实为胃癌。同时设立对照组（160例），均为同期自愿接受上述基因检测的健康体检人员。2组患者的年龄、性别、吸烟史、饮酒史及高脂饮食情况比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性（表 1）。
表1
胃癌组患者和对照组健康人群的一般资料比较
1.2 主要试剂及设备
DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶5 U MspI（MBI）及其他相关试剂均购自天津赛尔生物技术公司。设备：Bio-Rad热循环仪（T100型，美国Bio-rad伯乐公司）、紫外分光光度计（UV-1750型，广西德尔菲仪器设备有限公司）及凝胶成像系统（Gene Genius，Syngene公司）。
1.3 方法
1.3.1 外周血基因组DNA的提取
采用酚/氯仿法[6]提取2组患者的外周血基因组DNA。提取的基因组DNA经紫外线分光光度计检测吸光度值（A值），以A260/A280值鉴定基因组DNA的纯度和浓度。2组患者的外周血基因组DNA的A260/A280值均在1.8左右，表明基因组DNA纯度高，无蛋白质、RNA等污染。符合要求后，将基因组DNA用无菌EP管分装，在-80 ℃条件下保存。
1.3.2 多态性位点引物设计
根据MTHFR基因C677T位点和A1298C位点对应的基因序列分别设计PCR扩增引物。C677T位点的上游引物为5′-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3′，下游引物为5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，扩增长度为198 bp。A1298C位点的上游引物为5′-CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC-3′，下游引物为：5′-CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3′，扩增长度为163 bp。所有的引物均由上海捷瑞公司合成。
1.3.3 PCR反应体系及反应条件
PCR反应体系为25.0 μL体系：取2.0 μL基因组DNA，0.4 μmol/mL的上下游引物各1.0 μL，10×PCR缓冲液2.7 μL，1.5 mmol/mL的MgCl2 2.0 μL，1.5 U Tag酶12.5 μL，100 μmol/mL的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP） 0.6 μL，再以双蒸水（ddH2O）补足至25.0 μL。采用Bio-Rad热循环仪进行PCR扩增。反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性40 s，63 ℃复性55 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；最后再72 ℃延伸7 min。
1.3.4 限制性酶切
酶切反应体系为25.0 μL体系：PCR产物5.0 μL，10×PCR缓冲液3.5 μL，MBI 5.0 μL，以ddH2O补足至25.0 μL。在37 ℃条件下水浴过夜。将酶切产物行2%琼脂糖凝胶电泳（120 V、30 min），根据电泳条带数判断基因型。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
1.5 结果
MTHFR基因C677T位点的基因型包括CC、CT及TT型，A1298C位点包括AA、AC及CC型。2组C677T和A1298C位点的基因型分布情况见表 2。由表 2可见，胃癌组C677T和A1298C位点的基因型分布与对照组比较差异均无统计学意义（P>0.05），提示MTHFR基因C677T和A1298C位点与胃癌的易感性均无明显关联。
表2
2组MTHFR基因C677T位点和A1298C位点基因型的分布情况（例）
2 讨论
在我国，胃癌的发病率约为29.9/10万，是仅次于肺癌的第二高发肿瘤，其死亡率约为22.3/10万[7]。其中早期胃癌患者约占胃癌患者总数的10%左右，这与早期胃癌的诊断水平和高危人群的筛查水平较低均有着密切的关系[8]。有流行病学研究[9]结果表明，基因易感性在胃癌的发生与发展过程中扮演着重要的角色，而疾病的发生和发展受多基因调控。因此，探索基因多态性与胃癌的关系对胃癌的早期诊断具有重要的意义。
MTHFR基因定位于1p36.3，包括11个外显子和10个内含子，cDNA序列全长2.2 kb；现已发现，MTHFR基因有20多种突变位点，其中以C677T和A1298C位点最为常见[10]。然而，在不同国家、不同地区及不同民族中，C677T和A1298C位点的基因型分布有显著的差异[11]。MTHFR基因的缺陷将导致多种机体基础生化过程的紊乱，包括DNA复制、细胞周期的调控，以及DNA和蛋白质的甲基化修饰，从而引起心血管疾病、神经管缺陷、癌症等多种疾病[12]。Meta分析[13]结果表明，MTHFR基因C677T位点的CT变异与乳腺癌的易感性相关，A1298C位点的AC变异与乳腺癌的易感性无关。然而，其与胃癌的相关性仍处于探索阶段。本研究结果表明，胃癌组患者MTHFR基因C677T位点和A1298C位点的基因型分布与对照组患者比较差异均无统计学意义（P>0.05）。然而，因纳入样本量有限，这一结果并不能说明整个天津地区、中国甚至亚洲人群的整体情况，需进一步研究。
此外，疾病的发生和发展受多基因位点的调控，机理复杂。目前，已有众多学者[14-19]报道了不同基因位点多态性与胃癌发生的潜在联系，主要包括肿瘤坏死因子-α-308 （TNF-α-308）基因、TNF-β基因、端粒酶逆转录酶（hTERT）基因、胰岛素样生长因子2受体（IGF2R）基因、p53基因、着色性干皮病基因组（xpc）基因等。其中，hTERT基因rs2853676位点多态性与胃癌的遗传易感性有关，其可增加胃癌发生的风险[16]。IGF2R基因codon2020位点多态性可能对中国人群罹患胃癌具有保护作用[17]。p53基因Arg72Pro单核苷酸多态性与青海地区人群胃癌的易感性存在相关性，携带p53基因Arg72Pro野生型纯合子（Arg/Arg）可能是青海地区人群罹患胃癌的危险因素[18]。目前多认为，TNF-α-308基因、TNF-β基因及xpc基因多态性与胃癌的发生均无显著相关性[14-15, 19]。本研究结果发现，MTHFR基因C677T和A1298C位点的基因型分布与胃癌的易感性亦无显著相关性。在基因水平，胃癌的发生可能受多基因调控，不同的基因位点可能起到协同或拮抗的作用。目前的研究结果仍不能说明某一个基因位点多态性即能导致胃癌的发生，其必然是多基因调控的结果，且其真实的作用机理仍需大量研究证实。
总之，MTHFR基因位点的多态性与多种肿瘤的发生存在关联[20-22]，MTHFR基因不同位点多态性与胃癌易感性的关系仍在探索阶段。本研究结果表明，MTHFR基因C677T和A1298C位点多态性与胃癌易感性不存在相关性。然而，非随机抽样、有限的样本量及肿瘤诱发因素的多样性均会影响结果的准确性与代表性，因此该结论仍需大样本、高质量研究来进一步验证。
