引用本文： 冯颖, 朱骏, 唐发兵. E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌中的表达及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(4): 455-459. doi: 10.7507/1007-9424.20150120 复制
胆囊腺癌是胆管系统最常见的恶性肿瘤之一，占胆管癌的80%～90%，名列胃肠道肿瘤的第6位[1]。众多研究证实，细胞增殖失控在肿瘤的形成过程中发挥重要作用，而细胞增殖受多种因子调控，如转录因子1（E2F1）[2]、分化抑制因子（inhibitor of diferentiation 1，ID1）[3-4]、凋亡调控因子Bax[5]、p53基因、c-myc基因等。本研究采用免疫组织化学方法检测了E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、腺上皮内瘤变以及胆囊炎症组织中的表达，探讨其在胆囊腺癌组织中的表达及其临床意义。
1 资料和方法
1.1 标本来源
收集兰州大学第一医院病理科自2000～2013年12年期间经手术及病理学检查证实的胆囊腺癌标本70例，年龄37～78岁，中位年龄57岁。按国际病理学分级，高、中、低分化者分别为21例、27例和22例。另取同期20例胆囊高级别腺上皮内瘤变、30例胆囊低级别腺上皮内瘤变及20例胆囊炎症组织标本作为对照。
1.2 主要试剂
一抗E2F1、ID1及Bax购自Santa Cruz公司，羊血清、二抗、链霉素卵白素及DAB购自ZSGB-BIO公司。
1.3 检测指标及方法
取上述石蜡包埋的组织、常规切片，用二甲苯和梯度乙醇各15 min脱蜡，枸橼酸盐缓冲液修复抗原，3% H2O2室温封闭15 min，羊血清(ZSGB-BIO)封闭15 min，分别加E2F1、ID1和Bax一抗，4℃过夜；室温复温30 min，山羊抗兔二抗温室孵育15 min，链霉卵白素孵育15 min，DAB显色，自来水终止反应，苏木精复染，分化返蓝，脱水封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，Santa Cruz公司提供阳性对照片。
1.4 染色结果判断
以细胞质中有棕黄色颗粒者判为阳性细胞。F2F1和ID1均以细胞质或核膜染色为主，Bax则以细胞质染色为主。每张切片随机选择10个视野，在高倍（×400）显微镜下观察染色强度并计数阳性细胞数；然后根据染色强度及阳性细胞所占百分比分别评分。染色强度评分标准：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞计数评分标准：无阳性细胞为0分，阳性细胞所占百分比< 10%为1分，达10%～50%为2分，> 50%为3分。最后将染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分之和分为4级[6]：即0分判为阴性(-)；1～2分判为弱阳性(+)；3～4分判为阳性(++)；5～6分判为强阳性(+++)。染色强度与阳性细胞数得分之和> 3分则判为阳性表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19统计软件进行统计分析。采用四格表的精确概率法，所有数据应用χ2检验；E2F1、ID1和Bax蛋白表达间相关性应用Spearman相关分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同胆囊病变组织中的表达特征
本研究利用免疫组化方法检测E2F1、ID1以及Bax蛋白在胆囊腺癌、高级别胆囊腺上皮内瘤变、低级别胆囊腺上皮内瘤变和胆囊炎症组织中的表达。对其进行细胞定位，结果如图 1～图 3所示，阳性信号呈现棕黄色；ID1和E2F1蛋白表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞核或细胞质，Bax蛋白表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞质。
图1
示E2F1蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。1A:胆囊腺癌组织; 1B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 1C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 1D:胆囊炎症组织 图 2示ID1蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。2A:胆囊腺癌组织; 2B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 2C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 2D:胆囊炎症组织 图 3示Bax蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。3A:胆囊腺癌组织; 3B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 3C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 3D:胆囊炎症组织
2.2 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同胆囊病变组织中表达检测结果
结果见表 1。由表 1可见，E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、高级别腺上皮内瘤变、低级别腺上皮内瘤变和炎症组织中表达的差异均有统计学意义（P < 0.05）。E2F1蛋白在胆囊腺癌组织中表达阳性率高于高级别腺上皮内瘤变组织、低级别腺上皮瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；E2F1蛋白在高级别腺上皮内瘤变组织中表达阳性率高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)。ID1蛋白在胆囊腺癌组织中表达阳性率与高级别腺上皮内瘤变组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）, 但高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)；ID1蛋白在高级别腺上皮内瘤变表达阳性率高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)。Bax蛋白在胆囊腺癌组织中的表达阳性率则低于其他3种组织，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；Bax蛋白在高级别腺上皮内瘤变组织、低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织中的表达阳性率间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05)。
表1
E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、腺上皮内瘤变和炎症增生组织中的表达
2.3 胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白的表达与其临床病理特征间的关系
结果见表 2。由表 2可见，E2F1和ID1蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期组织中的表达阳性率显著高于Ⅳ~Ⅴ期，E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊癌的Nevin分期相关，差异有统计学意义（P < 0.05）。E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊腺癌的分化程度无关（P > 0.05）。高分化胆囊腺癌中Bax蛋白表达阳性率显著高于中、低分化组织，Bax蛋白的表达与胆囊癌的分化程度相关，差异具有统计学意义（P < 0.05）。Bax蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期胆囊癌组织中表达阳性率高于Ⅳ~Ⅴ期，但差异无统计学意义（P > 0.05）。E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌组织中的表达与发病年龄和性别无关（P > 0.05），与胆囊癌的大体类型及肿瘤部位无关（P > 0.05）。
表2
胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白的表达与其临床病理特征间的关系
2.4 胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白表达的相关性分析结果
70例胆囊腺癌患者E2F1蛋白表达阳性59例，Bax蛋白表达阳性18例，二者的表达呈负相关关系（r=-0.375，P < 0.05）；ID1蛋白表达阳性49例，Bax蛋白表达阳性者18例，二者间无相关性（r=-0.185，P > 0.05）E2F1蛋白表达阳性59例，ID1蛋白表达阳性者49例，二者呈正相关关系（r=7.031，P < 0.05）。
3 讨论
胆囊腺癌是胆管系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病呈上升趋势，并且起病隐匿，恶性程度高，预后极差[7]。细胞的无限增殖在肿瘤发生及发展过程中发挥重要的作用。
E2F1作为E2Fs转录因子家族的一员，调控DNA复制及细胞周期进程相关基因的表达[8]，过表达的E2F1促进细胞从G0 /G1期进入S期，促进细胞增殖及恶性转化。国内外研究[9-13]表明，E2F1在胃癌、乳腺浸润性导管癌、膀胱癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤中呈过表达。本研究发现，E2F1蛋白在胆囊腺癌表达阳性率高于胆囊腺上皮内瘤变及胆囊炎症组织，提示E2F1与胆囊腺癌的发生相关。
分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一种亚型，是螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员之一。已有研究证实，ID1与肿瘤血管生成相关[14]，抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖[15-17]，且是淋巴结阴性乳腺癌患者的独立预后因子[18]。Gupta等[19]发现，在人类三阴（ER、PR及HER2均阴性）乳腺癌亚型中ID1是其肺转移的调控者。本研究发现，ID1蛋白在胆囊腺癌的表达阳性率高于低级别胆囊腺上皮内瘤变及胆囊炎症，提示其与胆囊腺癌的发生相关；同时显示，E2F1和ID1蛋白表达均与胆囊腺癌的临床分期有关。该结果提示，E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊腺癌的浸润和转移有关，因此对胆囊腺癌的临床分期可能有重要的指导意义。
Bax和bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡[20]，抑制细胞增殖。本研究结果显示，Bax蛋白在胆囊炎症及胆囊腺上皮内瘤变中的表达阳性率高于胆囊腺癌组织，这和张力等[21]的观察结果一致，推测炎症组织及上皮内瘤变组织中高表达的Bax使其形成同源二聚体的可能性增加[22-25]，促进细胞凋亡，防止胆囊癌的发生。
本研究还发现，胆囊腺癌组织中，E2F1蛋白表达与Bax蛋白表达呈负相关关系，ID1蛋白表达与Bax蛋白表达无关，E2F1蛋白表达与ID1蛋白表达正相关。提示联合检测E2F1、ID1和Bax蛋白的表达可能有助于胆囊腺癌的辅助诊断。
胆囊腺癌是胆管系统最常见的恶性肿瘤之一，占胆管癌的80%～90%，名列胃肠道肿瘤的第6位[1]。众多研究证实，细胞增殖失控在肿瘤的形成过程中发挥重要作用，而细胞增殖受多种因子调控，如转录因子1（E2F1）[2]、分化抑制因子（inhibitor of diferentiation 1，ID1）[3-4]、凋亡调控因子Bax[5]、p53基因、c-myc基因等。本研究采用免疫组织化学方法检测了E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、腺上皮内瘤变以及胆囊炎症组织中的表达，探讨其在胆囊腺癌组织中的表达及其临床意义。
1 资料和方法
1.1 标本来源
收集兰州大学第一医院病理科自2000～2013年12年期间经手术及病理学检查证实的胆囊腺癌标本70例，年龄37～78岁，中位年龄57岁。按国际病理学分级，高、中、低分化者分别为21例、27例和22例。另取同期20例胆囊高级别腺上皮内瘤变、30例胆囊低级别腺上皮内瘤变及20例胆囊炎症组织标本作为对照。
1.2 主要试剂
一抗E2F1、ID1及Bax购自Santa Cruz公司，羊血清、二抗、链霉素卵白素及DAB购自ZSGB-BIO公司。
1.3 检测指标及方法
取上述石蜡包埋的组织、常规切片，用二甲苯和梯度乙醇各15 min脱蜡，枸橼酸盐缓冲液修复抗原，3% H2O2室温封闭15 min，羊血清(ZSGB-BIO)封闭15 min，分别加E2F1、ID1和Bax一抗，4℃过夜；室温复温30 min，山羊抗兔二抗温室孵育15 min，链霉卵白素孵育15 min，DAB显色，自来水终止反应，苏木精复染，分化返蓝，脱水封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，Santa Cruz公司提供阳性对照片。
1.4 染色结果判断
以细胞质中有棕黄色颗粒者判为阳性细胞。F2F1和ID1均以细胞质或核膜染色为主，Bax则以细胞质染色为主。每张切片随机选择10个视野，在高倍（×400）显微镜下观察染色强度并计数阳性细胞数；然后根据染色强度及阳性细胞所占百分比分别评分。染色强度评分标准：不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞计数评分标准：无阳性细胞为0分，阳性细胞所占百分比< 10%为1分，达10%～50%为2分，> 50%为3分。最后将染色强度评分与阳性细胞所占百分比评分之和分为4级[6]：即0分判为阴性(-)；1～2分判为弱阳性(+)；3～4分判为阳性(++)；5～6分判为强阳性(+++)。染色强度与阳性细胞数得分之和> 3分则判为阳性表达。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19统计软件进行统计分析。采用四格表的精确概率法，所有数据应用χ2检验；E2F1、ID1和Bax蛋白表达间相关性应用Spearman相关分析。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同胆囊病变组织中的表达特征
本研究利用免疫组化方法检测E2F1、ID1以及Bax蛋白在胆囊腺癌、高级别胆囊腺上皮内瘤变、低级别胆囊腺上皮内瘤变和胆囊炎症组织中的表达。对其进行细胞定位，结果如图 1～图 3所示，阳性信号呈现棕黄色；ID1和E2F1蛋白表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞核或细胞质，Bax蛋白表达于胆囊腺上皮及癌细胞的细胞质。
图1
示E2F1蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。1A:胆囊腺癌组织; 1B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 1C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 1D:胆囊炎症组织 图 2示ID1蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。2A:胆囊腺癌组织; 2B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 2C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 2D:胆囊炎症组织 图 3示Bax蛋白在不同胆囊病变组织中的表达。3A:胆囊腺癌组织; 3B:胆囊高级别腺上皮内瘤变组织; 3C:胆囊低级别腺上皮内瘤变组织; 3D:胆囊炎症组织
2.2 E2F1、ID1和Bax蛋白在不同胆囊病变组织中表达检测结果
结果见表 1。由表 1可见，E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、高级别腺上皮内瘤变、低级别腺上皮内瘤变和炎症组织中表达的差异均有统计学意义（P < 0.05）。E2F1蛋白在胆囊腺癌组织中表达阳性率高于高级别腺上皮内瘤变组织、低级别腺上皮瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；E2F1蛋白在高级别腺上皮内瘤变组织中表达阳性率高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)。ID1蛋白在胆囊腺癌组织中表达阳性率与高级别腺上皮内瘤变组织比较，差异无统计学意义（P > 0.05）, 但高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)；ID1蛋白在高级别腺上皮内瘤变表达阳性率高于低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织，其差异有统计学意义（P < 0.05)。Bax蛋白在胆囊腺癌组织中的表达阳性率则低于其他3种组织，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；Bax蛋白在高级别腺上皮内瘤变组织、低级别腺上皮内瘤变组织及胆囊炎症组织中的表达阳性率间比较，差异均无统计学意义（P > 0.05)。
表1
E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌、腺上皮内瘤变和炎症增生组织中的表达
2.3 胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白的表达与其临床病理特征间的关系
结果见表 2。由表 2可见，E2F1和ID1蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期组织中的表达阳性率显著高于Ⅳ~Ⅴ期，E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊癌的Nevin分期相关，差异有统计学意义（P < 0.05）。E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊腺癌的分化程度无关（P > 0.05）。高分化胆囊腺癌中Bax蛋白表达阳性率显著高于中、低分化组织，Bax蛋白的表达与胆囊癌的分化程度相关，差异具有统计学意义（P < 0.05）。Bax蛋白在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期胆囊癌组织中表达阳性率高于Ⅳ~Ⅴ期，但差异无统计学意义（P > 0.05）。E2F1、ID1和Bax蛋白在胆囊腺癌组织中的表达与发病年龄和性别无关（P > 0.05），与胆囊癌的大体类型及肿瘤部位无关（P > 0.05）。
表2
胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白的表达与其临床病理特征间的关系
2.4 胆囊腺癌组织中E2F1、ID1和Bax蛋白表达的相关性分析结果
70例胆囊腺癌患者E2F1蛋白表达阳性59例，Bax蛋白表达阳性18例，二者的表达呈负相关关系（r=-0.375，P < 0.05）；ID1蛋白表达阳性49例，Bax蛋白表达阳性者18例，二者间无相关性（r=-0.185，P > 0.05）E2F1蛋白表达阳性59例，ID1蛋白表达阳性者49例，二者呈正相关关系（r=7.031，P < 0.05）。
3 讨论
胆囊腺癌是胆管系统最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病呈上升趋势，并且起病隐匿，恶性程度高，预后极差[7]。细胞的无限增殖在肿瘤发生及发展过程中发挥重要的作用。
E2F1作为E2Fs转录因子家族的一员，调控DNA复制及细胞周期进程相关基因的表达[8]，过表达的E2F1促进细胞从G0 /G1期进入S期，促进细胞增殖及恶性转化。国内外研究[9-13]表明，E2F1在胃癌、乳腺浸润性导管癌、膀胱癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤中呈过表达。本研究发现，E2F1蛋白在胆囊腺癌表达阳性率高于胆囊腺上皮内瘤变及胆囊炎症组织，提示E2F1与胆囊腺癌的发生相关。
分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一种亚型，是螺旋-环-螺旋转录因子家族的成员之一。已有研究证实，ID1与肿瘤血管生成相关[14]，抑制细胞凋亡、促进肿瘤细胞增殖[15-17]，且是淋巴结阴性乳腺癌患者的独立预后因子[18]。Gupta等[19]发现，在人类三阴（ER、PR及HER2均阴性）乳腺癌亚型中ID1是其肺转移的调控者。本研究发现，ID1蛋白在胆囊腺癌的表达阳性率高于低级别胆囊腺上皮内瘤变及胆囊炎症，提示其与胆囊腺癌的发生相关；同时显示，E2F1和ID1蛋白表达均与胆囊腺癌的临床分期有关。该结果提示，E2F1和ID1蛋白的表达与胆囊腺癌的浸润和转移有关，因此对胆囊腺癌的临床分期可能有重要的指导意义。
Bax和bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡[20]，抑制细胞增殖。本研究结果显示，Bax蛋白在胆囊炎症及胆囊腺上皮内瘤变中的表达阳性率高于胆囊腺癌组织，这和张力等[21]的观察结果一致，推测炎症组织及上皮内瘤变组织中高表达的Bax使其形成同源二聚体的可能性增加[22-25]，促进细胞凋亡，防止胆囊癌的发生。
本研究还发现，胆囊腺癌组织中，E2F1蛋白表达与Bax蛋白表达呈负相关关系，ID1蛋白表达与Bax蛋白表达无关，E2F1蛋白表达与ID1蛋白表达正相关。提示联合检测E2F1、ID1和Bax蛋白的表达可能有助于胆囊腺癌的辅助诊断。
