引用本文： 李渊, 马家驰, 李一平, 房伟, 郭庆金. PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖和侵袭的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(5): 544-548. doi: 10.7507/1007-9424.20150145 复制
结直肠癌作为最常见的恶性肿瘤之一，在全世界男性的发病率排名第3位，病死率第4位；女性的发病率排名第2位，病死率第3位[1]。近年来，包括中国在内的许多国家或地区结肠癌发病率呈上升的趋势[2-3]。结肠癌术后大约40%的患者在5年内出现复发和转移[4]。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN），又称为MMAC1/TEP1基因，位于人类染色体10q23，具有9个外显子。PTEN是近年来发现的重要抑癌基因，它的失活、缺失与人类十几种癌的发生和转移相关[5]。前期我们的研究[6-7]显示，PTEN的表达与结肠癌的肝转移能力密切相关，并通过IGF1-PI3K-Akt信号途径调节结肠癌的转移。但目前对PTEN基因的沉默影响结直肠癌细胞生物学功能的研究比较少。本研究应用短基因干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术沉默PTEN基因后观察结肠癌细胞生物学特性的变化，从而在功能上了解PTEN基因在肿瘤发生和进展中的分子生物学作用，为结直肠癌的防治和基因治疗提供新的策略和理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要材料
结肠癌细胞株（HT-29、WiDr、CaCo-2及Colo320）均购自金斯瑞生物科技公司。PTEN siRNA，上海吉玛生物工程公司；Lipofectamine2000TM，Invitrogen公司；PTEN siRNA序列：上游5'-AACCCACCACAGC-UAGAACTT-3'，下游5'-AAGUUCUAGCUGUGGUG-GGTT3'。Control siRNA序列：上游5'-UUCUCCG-AACGUGUCACGUTT-3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
HT-29和Colo320用RPMI 1640培养液进行培养；WiDr、CaCo-2用DMEM进行培养，培养液中含10%热灭活胎牛血清(FBS)，存放于37℃、含5% CO2空气的培养箱中培养。
1.2.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
依据Gene Bank报道的基因序列，运用Prime 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物公司合成。采用大连宝生物公司研制的RNA OUT试剂盒提取细胞中的总RNA，用1%甲醛琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性；然后用DNA/RNA Calculator测定总RNA浓度。RT-PCR反应体系依据制造商提供的说明，PTEN引物序列和RT-PCR反应条件见表 1。取PCR扩增产物2.0μL与缓冲液混匀后电泳上样，以DL2000作为maker在1%的琼脂糖凝胶（含核酸染料0.5μg/mL）中电泳30 min，用凝胶成像系统观察并保存。扩增条件为：42℃条件下30 min进行逆转录；94℃变性3 min，1个循环：94℃变性30 s，62℃退火45 s，68℃延伸1 min，共35个循环，产物经2%琼脂糖凝胶电泳和染色用溴化乙锭，蒸馏水为阴性对照，β-肌动蛋白（β-actin）作为阳性对照。
表1
引物序列及PCR条件
1.2.3 Western blot检测PTEN蛋白的表达
Cell-Lysis buffer裂解细胞。加入20 mg/L蛋白酶抑制剂，离心1 h（4℃，13 000 r/min，r=7.7 cm），收集上清液，Brad-ford法测定蛋白浓度，取30μg样品蛋白质与适量IPG胶条溶液混合均匀。10% SDS-PAGE胶电泳2 h，至嗅酚蓝接近凝胶底线。采用半干转印技术（参照设备说明书操作）将双向电泳后的制备胶上的蛋白质转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBS-T冲洗膜3次（10 min/次）。对将转有蛋白的PVDF膜取出，标记方向和蛋白分子量标准印记，然后浸入含有一抗的封闭液中，置于摇摆机室温下孵育2 h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min，将PVDF膜浸入含有辣根过氧化酶标记的二抗的孵育液中4℃过夜，再以TBST洗膜3次，每次10 min。干燥1～2 min。用ECL化学发光试剂盒将PVDF膜进行胶片曝光显影定影，流水冲洗后干燥并照相保存。
1.2.4 细胞转染
将1×105/mL结肠癌细胞接种到12孔的培养板，37℃、5% CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长至80%密度时进行转染。按每孔取50μmol/L的siRNA液2μL，溶于100μL无血清、无抗生素、无核酶的RPMI 1640和DMEM培养液中混匀，按每孔Lipofectamine2000TM液5μL，溶于100μL无血清、无抗生素、无核酶的RPMI 1640和DMEM培养液中混匀，室温静置5 min，混合后再室温静置20 min。弃去12孔板中的培养液，用无血清RPMI 1640或DMEM培养液洗涤细胞2次，每孔换新鲜的上述培养液2 mL，再将上述的混合液加入每孔细胞中，混匀后置培养箱中，37℃培养。转染后6 h，更换为含10% FBS的无抗生素、无核酶的RPMI 1640或DMEM培养液，转染后的细胞用于后续实验。
1.2.5 细胞增殖实验
WST-1细胞增殖实验检测PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖的影响。取对数生长期的PTEN siRNA、Control siRNA及未转染的结肠癌细胞株HT-29、WiDr、CaCo-2、Colo320细胞置于每孔5×103个/100μL加入96孔的培养板上过夜，使细胞贴壁。更换培养液再培养48 h或72 h后，每孔加入100μL的CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent后置于37℃的孵育箱中4 h后，酶标仪上测定波长490 nm吸光度值。
1.2.6 细胞侵袭实验
将Martigel胶按40μL/孔均匀地铺在孔径8μm的transwell小室无聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）多孔滤膜内表面上，在外表面均匀地涂抹10μL/5μg纤维连接蛋白，使之干燥形成一个基底屏障层；成胶30 min后置紫外灯下照射过夜，实验前30 min再次成胶；培养细胞达80%饱和度时，消化、计数，取2.0×104/mL癌细胞接种到成胶带膜的小室内，并将小室置于24孔transwell板内，再培养8 h后取出，用棉签头擦掉未滤过的细胞，PBS洗3次，甲醇固定5 min，Diff-Quick液染色。结果判定：在光镜下（×20）每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数，计算平均每个视野的细胞数。
1.3 统计学方法
使用SAS 7.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
RT-PCR结果显示，PTEN mRNA在4种结肠癌细胞株中均有表达，见图 1。
图1
PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
2.2 Western blot法测定PTEN蛋白在结肠癌细胞株中的表达
与RT-PCR实验结果相同，Western blot结果显示，PTEN蛋白在Colo320、CaCo-2、HT-29及WiDr这4种结肠癌细胞株中均有表达，见图 2。
图2
PTEN蛋白在结肠癌细胞株中的表达
2.3 PTEN siRNA对结肠癌细胞PTEN蛋白表达的影响
结肠癌细胞导入PTEN siRNA后，即PTEN基因沉默后，相对于Control siRNA和β-actin，4种结肠癌细胞中PTEN蛋白的表达明显被抑制，该结果提示PTEN siRNA设计及转染细胞都是成功的，见图 3A。Image对图像进行半定量分析结果显示，与未转染组、Control siRNA组相比，PTEN siRNA组4种结肠癌细胞中PTEN的蛋白表达明显被抑制（P < 0.01），见图 3B。
图3
PTEN siRNA对结肠癌细胞表达PTEN的影响。3A：定性结果。3B：半定量结果。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
2.4 PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖的影响
导入PTEN siRNA和Control siRNA后结肠癌细胞再经72 h的培养，结果显示，PTEN基因沉默后，与未转染组和Control siRNA组比较，PTEN siRNA组癌细胞自身的增殖能力明显增强（P < 0.01），见图 4。
图4
PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖能力的影响。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
2.5 PTEN siRNA对结肠癌细胞侵袭能力的影响
结肠癌细胞转染PTEN siRNA和control siRNA后，为了排除细胞增生对侵袭实验的影响，细胞培养时间8 h，结果显示，PTEN基因沉默后，分别与未转染组和Control siRNA组相比较，PTEN siRNA组结肠癌细胞的侵袭能力明显增强（P < 0.01），见图 5。
图5
PTEN siRNA对结肠癌细胞侵袭能力的影响。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
3 讨论
复发和转移是结肠癌预后不良的主要原因，结肠癌的转移是一个多因素、多步骤、多阶段性的选择过程，包含着循环肿瘤细胞与靶器官间复杂的相互作用，特异的器官微环境决定着肿瘤细胞自身增殖、侵袭及血管形成，这种“被选择”肿瘤细胞的特征性、靶器官微环境的特异性以及循环肿瘤细胞向靶器官迁移方式的规律性成为揭示肿瘤转移特征的关键[8]。在结肠癌的进展和转移中抑癌基因的失活是一个关键因素[9]。
PTEN基因是近年来在人体中发现的主要肿瘤抑制基因，也是人体肿瘤中最常发生突变的基因之一，发生种系突变可导致产生肿瘤易感综合征[10-11]。PTEN基因胚系突变发现于Cowden和Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌组织中。近年来，越来越多的证据表明，PTEN作为抑癌基因，主要通过调控细胞的信号传导途径与其他抑癌基因协同发挥抑癌作用。细胞的信号传导是沟通细胞内外以及细胞之间联系的桥梁，控制着细胞内几乎所有的生命活动。信号传导过程的异常将会导致机体的调节紊乱，影响细胞生长、分化和代谢而造成机体疾病。PTEN的抑癌作用主要通过PTEN/PI3K/Akt、PTEN/FAK/P130cas、PTEN/ERK、p53/MDM2、FRAP/mTOR等信号传导途径调控[12-18]。PTEN蛋白的表达与血管内皮生长因子（VEGF）的表达呈负相关，VEGF通过促进肿瘤血管的生成而满足肿瘤的营养需要，而PTEN可通过下调VEGF的表达发挥抑制肿瘤的作用。此外，基底膜的完整性是肿瘤的浸润与转移的关键环节[13, 19]。MMP-9通过破坏基底膜的完整性而促进肿瘤的转移，而PTEN可通过NF-ĸB和AP-1基因下调MMP-9的表达，从而最终对肿瘤起到抑制作用[20-21]。PTEN通过调控这些信号传导途径在协调细胞周期进展、抑制癌细胞增殖和转移、控制细胞黏附、细胞凋亡等方面发挥着重要作用[12]。在癌症的发生、发展中，PTEN的表达与抑癌基因p16、nm23、p73野生型p53基因、p27b等基因的表达有协同作用，共同抑制肿瘤的发生与发展过程；而与survivin、突变型p53、ERK2等基因表达呈负相关关系[22-24]。本研究结果显示，PTEN mRNA及蛋白在4种结肠癌细胞中都有表达，这是后续研究沉默PTEN基因的基础。
RNA干扰技术的靶基因沉默方法已被广泛运用于基础研究和临床研究中，无论是分裂期的细胞还是间歇期的细胞，都能被RNA干扰抑制，且毒副作用较小，因此RNA干扰成为了基础科研以及基因治疗的重要工具之一[25]。本研究运用RNA干扰技术在体外沉默PTEN后检测了结肠癌细胞生物学功能的改变，Western blot结果提示，结肠癌细胞转染PTEN siRNA后抑制了PTEN蛋白表达，表明沉默靶基因的效果显著，这一结果为检测结肠癌细胞自身生物学活性的改变提供了基础；侵袭实验检测显示，转染PTEN siRNA组的结肠癌细胞增殖及侵袭能力与Control siRNA组及未转染组比较明显增强（P < 0.01），这表明PTEN在体外有效抑制结肠癌细胞的增殖和生长，并显著降低其侵袭能力，PTEN的缺失使结肠癌细胞的转移能力增强。PTEN在哺乳动物组织动态平衡的正调节与负调节中起核心作用，PTEN基因表达上调后，可促进癌细胞凋亡[26-27]，这与我们的研究也是相一致的。联合应用野生型PTEN基因转染和5-氟尿嘧啶对癌细胞可获得协同的细胞毒性作用[28]。PTEN基因与西妥昔单抗抗肿瘤活性中具有潜在的协同作用[29]。另一方面，特异性地强化PTEN的活性可能成为治疗结肠癌的有效途径。
目前发现多种机制可以调节PTEN的功能，但是其详细的上游调节分子和调节机制还不是非常清楚。未来对PTEN基因调控机制的深入研究，必将会为肿瘤和代谢性疾病的分子诊断、基因治疗以及预后判断方面提供新方法、新途径。本研究应用siRNA技术，转染PTEN siRNA到结肠癌细胞核中，构建的特异性siRNA质粒沉默PTEN后结肠癌细胞的增殖和侵袭能力明显增强，结合我们的前期研究[6-7]，PTEN主要通过抑制癌细胞的增殖、侵袭和新生血管抑制结肠癌的转移，由此预测PTEN抑癌基因在结肠癌中的失活可能是不全性的失活，PTEN功能的复活是今后肿瘤学研究的难点和热点，强化PTEN的作用或应用野生型的PTEN基因可作为治疗结肠癌转移的一个基因靶点。
结直肠癌作为最常见的恶性肿瘤之一，在全世界男性的发病率排名第3位，病死率第4位；女性的发病率排名第2位，病死率第3位[1]。近年来，包括中国在内的许多国家或地区结肠癌发病率呈上升的趋势[2-3]。结肠癌术后大约40%的患者在5年内出现复发和转移[4]。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN），又称为MMAC1/TEP1基因，位于人类染色体10q23，具有9个外显子。PTEN是近年来发现的重要抑癌基因，它的失活、缺失与人类十几种癌的发生和转移相关[5]。前期我们的研究[6-7]显示，PTEN的表达与结肠癌的肝转移能力密切相关，并通过IGF1-PI3K-Akt信号途径调节结肠癌的转移。但目前对PTEN基因的沉默影响结直肠癌细胞生物学功能的研究比较少。本研究应用短基因干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术沉默PTEN基因后观察结肠癌细胞生物学特性的变化，从而在功能上了解PTEN基因在肿瘤发生和进展中的分子生物学作用，为结直肠癌的防治和基因治疗提供新的策略和理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞及主要材料
结肠癌细胞株（HT-29、WiDr、CaCo-2及Colo320）均购自金斯瑞生物科技公司。PTEN siRNA，上海吉玛生物工程公司；Lipofectamine2000TM，Invitrogen公司；PTEN siRNA序列：上游5'-AACCCACCACAGC-UAGAACTT-3'，下游5'-AAGUUCUAGCUGUGGUG-GGTT3'。Control siRNA序列：上游5'-UUCUCCG-AACGUGUCACGUTT-3'，下游5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
HT-29和Colo320用RPMI 1640培养液进行培养；WiDr、CaCo-2用DMEM进行培养，培养液中含10%热灭活胎牛血清(FBS)，存放于37℃、含5% CO2空气的培养箱中培养。
1.2.2 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
依据Gene Bank报道的基因序列，运用Prime 5.0软件设计一对引物，由大连宝生物公司合成。采用大连宝生物公司研制的RNA OUT试剂盒提取细胞中的总RNA，用1%甲醛琼脂糖凝胶进行电泳检测RNA的完整性；然后用DNA/RNA Calculator测定总RNA浓度。RT-PCR反应体系依据制造商提供的说明，PTEN引物序列和RT-PCR反应条件见表 1。取PCR扩增产物2.0μL与缓冲液混匀后电泳上样，以DL2000作为maker在1%的琼脂糖凝胶（含核酸染料0.5μg/mL）中电泳30 min，用凝胶成像系统观察并保存。扩增条件为：42℃条件下30 min进行逆转录；94℃变性3 min，1个循环：94℃变性30 s，62℃退火45 s，68℃延伸1 min，共35个循环，产物经2%琼脂糖凝胶电泳和染色用溴化乙锭，蒸馏水为阴性对照，β-肌动蛋白（β-actin）作为阳性对照。
表1
引物序列及PCR条件
1.2.3 Western blot检测PTEN蛋白的表达
Cell-Lysis buffer裂解细胞。加入20 mg/L蛋白酶抑制剂，离心1 h（4℃，13 000 r/min，r=7.7 cm），收集上清液，Brad-ford法测定蛋白浓度，取30μg样品蛋白质与适量IPG胶条溶液混合均匀。10% SDS-PAGE胶电泳2 h，至嗅酚蓝接近凝胶底线。采用半干转印技术（参照设备说明书操作）将双向电泳后的制备胶上的蛋白质转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBS-T冲洗膜3次（10 min/次）。对将转有蛋白的PVDF膜取出，标记方向和蛋白分子量标准印记，然后浸入含有一抗的封闭液中，置于摇摆机室温下孵育2 h，用TBST缓冲液洗膜3次，每次15 min，将PVDF膜浸入含有辣根过氧化酶标记的二抗的孵育液中4℃过夜，再以TBST洗膜3次，每次10 min。干燥1～2 min。用ECL化学发光试剂盒将PVDF膜进行胶片曝光显影定影，流水冲洗后干燥并照相保存。
1.2.4 细胞转染
将1×105/mL结肠癌细胞接种到12孔的培养板，37℃、5% CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长至80%密度时进行转染。按每孔取50μmol/L的siRNA液2μL，溶于100μL无血清、无抗生素、无核酶的RPMI 1640和DMEM培养液中混匀，按每孔Lipofectamine2000TM液5μL，溶于100μL无血清、无抗生素、无核酶的RPMI 1640和DMEM培养液中混匀，室温静置5 min，混合后再室温静置20 min。弃去12孔板中的培养液，用无血清RPMI 1640或DMEM培养液洗涤细胞2次，每孔换新鲜的上述培养液2 mL，再将上述的混合液加入每孔细胞中，混匀后置培养箱中，37℃培养。转染后6 h，更换为含10% FBS的无抗生素、无核酶的RPMI 1640或DMEM培养液，转染后的细胞用于后续实验。
1.2.5 细胞增殖实验
WST-1细胞增殖实验检测PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖的影响。取对数生长期的PTEN siRNA、Control siRNA及未转染的结肠癌细胞株HT-29、WiDr、CaCo-2、Colo320细胞置于每孔5×103个/100μL加入96孔的培养板上过夜，使细胞贴壁。更换培养液再培养48 h或72 h后，每孔加入100μL的CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent后置于37℃的孵育箱中4 h后，酶标仪上测定波长490 nm吸光度值。
1.2.6 细胞侵袭实验
将Martigel胶按40μL/孔均匀地铺在孔径8μm的transwell小室无聚碳酸脂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）多孔滤膜内表面上，在外表面均匀地涂抹10μL/5μg纤维连接蛋白，使之干燥形成一个基底屏障层；成胶30 min后置紫外灯下照射过夜，实验前30 min再次成胶；培养细胞达80%饱和度时，消化、计数，取2.0×104/mL癌细胞接种到成胶带膜的小室内，并将小室置于24孔transwell板内，再培养8 h后取出，用棉签头擦掉未滤过的细胞，PBS洗3次，甲醇固定5 min，Diff-Quick液染色。结果判定：在光镜下（×20）每个滤膜分别计数5个视野的穿膜细胞数，计算平均每个视野的细胞数。
1.3 统计学方法
使用SAS 7.0软件进行统计学分析，结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
RT-PCR结果显示，PTEN mRNA在4种结肠癌细胞株中均有表达，见图 1。
图1
PTEN mRNA在结肠癌细胞株中的表达
2.2 Western blot法测定PTEN蛋白在结肠癌细胞株中的表达
与RT-PCR实验结果相同，Western blot结果显示，PTEN蛋白在Colo320、CaCo-2、HT-29及WiDr这4种结肠癌细胞株中均有表达，见图 2。
图2
PTEN蛋白在结肠癌细胞株中的表达
2.3 PTEN siRNA对结肠癌细胞PTEN蛋白表达的影响
结肠癌细胞导入PTEN siRNA后，即PTEN基因沉默后，相对于Control siRNA和β-actin，4种结肠癌细胞中PTEN蛋白的表达明显被抑制，该结果提示PTEN siRNA设计及转染细胞都是成功的，见图 3A。Image对图像进行半定量分析结果显示，与未转染组、Control siRNA组相比，PTEN siRNA组4种结肠癌细胞中PTEN的蛋白表达明显被抑制（P < 0.01），见图 3B。
图3
PTEN siRNA对结肠癌细胞表达PTEN的影响。3A：定性结果。3B：半定量结果。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
2.4 PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖的影响
导入PTEN siRNA和Control siRNA后结肠癌细胞再经72 h的培养，结果显示，PTEN基因沉默后，与未转染组和Control siRNA组比较，PTEN siRNA组癌细胞自身的增殖能力明显增强（P < 0.01），见图 4。
图4
PTEN siRNA对结肠癌细胞增殖能力的影响。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
2.5 PTEN siRNA对结肠癌细胞侵袭能力的影响
结肠癌细胞转染PTEN siRNA和control siRNA后，为了排除细胞增生对侵袭实验的影响，细胞培养时间8 h，结果显示，PTEN基因沉默后，分别与未转染组和Control siRNA组相比较，PTEN siRNA组结肠癌细胞的侵袭能力明显增强（P < 0.01），见图 5。
图5
PTEN siRNA对结肠癌细胞侵袭能力的影响。与未转染组和Control siRNA组比较，* P < 0.01
3 讨论
复发和转移是结肠癌预后不良的主要原因，结肠癌的转移是一个多因素、多步骤、多阶段性的选择过程，包含着循环肿瘤细胞与靶器官间复杂的相互作用，特异的器官微环境决定着肿瘤细胞自身增殖、侵袭及血管形成，这种“被选择”肿瘤细胞的特征性、靶器官微环境的特异性以及循环肿瘤细胞向靶器官迁移方式的规律性成为揭示肿瘤转移特征的关键[8]。在结肠癌的进展和转移中抑癌基因的失活是一个关键因素[9]。
PTEN基因是近年来在人体中发现的主要肿瘤抑制基因，也是人体肿瘤中最常发生突变的基因之一，发生种系突变可导致产生肿瘤易感综合征[10-11]。PTEN基因胚系突变发现于Cowden和Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌组织中。近年来，越来越多的证据表明，PTEN作为抑癌基因，主要通过调控细胞的信号传导途径与其他抑癌基因协同发挥抑癌作用。细胞的信号传导是沟通细胞内外以及细胞之间联系的桥梁，控制着细胞内几乎所有的生命活动。信号传导过程的异常将会导致机体的调节紊乱，影响细胞生长、分化和代谢而造成机体疾病。PTEN的抑癌作用主要通过PTEN/PI3K/Akt、PTEN/FAK/P130cas、PTEN/ERK、p53/MDM2、FRAP/mTOR等信号传导途径调控[12-18]。PTEN蛋白的表达与血管内皮生长因子（VEGF）的表达呈负相关，VEGF通过促进肿瘤血管的生成而满足肿瘤的营养需要，而PTEN可通过下调VEGF的表达发挥抑制肿瘤的作用。此外，基底膜的完整性是肿瘤的浸润与转移的关键环节[13, 19]。MMP-9通过破坏基底膜的完整性而促进肿瘤的转移，而PTEN可通过NF-ĸB和AP-1基因下调MMP-9的表达，从而最终对肿瘤起到抑制作用[20-21]。PTEN通过调控这些信号传导途径在协调细胞周期进展、抑制癌细胞增殖和转移、控制细胞黏附、细胞凋亡等方面发挥着重要作用[12]。在癌症的发生、发展中，PTEN的表达与抑癌基因p16、nm23、p73野生型p53基因、p27b等基因的表达有协同作用，共同抑制肿瘤的发生与发展过程；而与survivin、突变型p53、ERK2等基因表达呈负相关关系[22-24]。本研究结果显示，PTEN mRNA及蛋白在4种结肠癌细胞中都有表达，这是后续研究沉默PTEN基因的基础。
RNA干扰技术的靶基因沉默方法已被广泛运用于基础研究和临床研究中，无论是分裂期的细胞还是间歇期的细胞，都能被RNA干扰抑制，且毒副作用较小，因此RNA干扰成为了基础科研以及基因治疗的重要工具之一[25]。本研究运用RNA干扰技术在体外沉默PTEN后检测了结肠癌细胞生物学功能的改变，Western blot结果提示，结肠癌细胞转染PTEN siRNA后抑制了PTEN蛋白表达，表明沉默靶基因的效果显著，这一结果为检测结肠癌细胞自身生物学活性的改变提供了基础；侵袭实验检测显示，转染PTEN siRNA组的结肠癌细胞增殖及侵袭能力与Control siRNA组及未转染组比较明显增强（P < 0.01），这表明PTEN在体外有效抑制结肠癌细胞的增殖和生长，并显著降低其侵袭能力，PTEN的缺失使结肠癌细胞的转移能力增强。PTEN在哺乳动物组织动态平衡的正调节与负调节中起核心作用，PTEN基因表达上调后，可促进癌细胞凋亡[26-27]，这与我们的研究也是相一致的。联合应用野生型PTEN基因转染和5-氟尿嘧啶对癌细胞可获得协同的细胞毒性作用[28]。PTEN基因与西妥昔单抗抗肿瘤活性中具有潜在的协同作用[29]。另一方面，特异性地强化PTEN的活性可能成为治疗结肠癌的有效途径。
目前发现多种机制可以调节PTEN的功能，但是其详细的上游调节分子和调节机制还不是非常清楚。未来对PTEN基因调控机制的深入研究，必将会为肿瘤和代谢性疾病的分子诊断、基因治疗以及预后判断方面提供新方法、新途径。本研究应用siRNA技术，转染PTEN siRNA到结肠癌细胞核中，构建的特异性siRNA质粒沉默PTEN后结肠癌细胞的增殖和侵袭能力明显增强，结合我们的前期研究[6-7]，PTEN主要通过抑制癌细胞的增殖、侵袭和新生血管抑制结肠癌的转移，由此预测PTEN抑癌基因在结肠癌中的失活可能是不全性的失活，PTEN功能的复活是今后肿瘤学研究的难点和热点，强化PTEN的作用或应用野生型的PTEN基因可作为治疗结肠癌转移的一个基因靶点。
