引用本文： 肖博, 熊光冰, 肖体先, 肖毅. 儿茶酚胺氧位甲基转移酶在结直肠腺瘤和结直肠癌组织中的表达. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(6): 705-709. doi: 10.7507/1007-9424.20150180 复制
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病率与死亡率都位居于恶性肿瘤的前列[1-2]。我国也是CRC高发的国家之一[3]。现代分子生物学研究[4-5]揭示，CRC的发生及发展是一个多基因参与、多步骤演变的恶性进程，但能够用于CRC辅助诊断、预后判断及干预治疗的新靶点仍是CRC相关研究的热点和难点。儿茶酚胺氧位甲基转移酶（catechol O-methyltransferase，COMT）是儿茶酚雌激素代谢的关键酶，对雌激素诱导的DNA损伤具有保护作用[6]。研究[7]表明，COMT在CRC组织中的表达水平明显高于正常组织。基于此，笔者认为有必要对结直肠腺瘤及CRC组织进行研究，故笔者通过实时定量PCR法和免疫组化方法检测了COMT mRNA及其蛋白在结直肠腺瘤及CRC组织中的表达情况，以探讨其在CRC发生和发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2013年1～11月期间于北京协和医院行电子结肠镜下高频电凝切除的47例结直肠腺瘤患者的结直肠腺瘤组织及其瘤旁组织（距离腺瘤以远5 cm）标本。47例结直肠腺瘤患者中，男30例，女17例；年龄35～83岁，平均63.7岁；包括结肠腺瘤34例，直肠腺瘤13例；管状腺瘤30例，锯齿状、绒毛状及管状绒毛状腺瘤17例，均经术后病理学检查证实。同时回顾性收集2012年7～9月期间于北京协和医院行手术的42例CRC患者的癌组织及其癌旁组织（距离癌灶以远5 cm）标本。42例CRC患者中，男19例，女23例；年龄35～84岁，平均66.3岁；包括结肠癌19例，直肠癌23例；采用《美国癌症联合委员会第七版分期方法》（2010年）[8]进行TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期13例，Ⅲ期23例；分化程度：高分化13例，中分化22例，低分化7例；淋巴结转移23例，淋巴结无转移19例；所有CRC患者术前均未行新辅助治疗，且均经术后病理学检查证实。标本采集后均快速放至液氮中冷冻，-80℃保存。本研究获得北京协和医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和设备
COMT鼠抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG-Fc段抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司，Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶购自Promega公司，FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒购自Roche公司。COMT和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的PCR引物由Invitrogen公司合成，并登陆GeneBank确认无误。COMT mRNA引物：上游5′-ATTGACACCTA-CTGCGAGCA-3′，下游5′-CCACATTC CTCCAAGAG-AAGC-3′，扩增产物长度为388 bp；GAPDH mRNA引物：上游5′-GGCTGCCATTTGCACTGGCAA-3′，下游5′-TGCCDTGAGTGGAGTCATACTG-3′，扩增产物长度为318 bp。设备：5810R/5415D离心机（Eppen-dorf公司，德国）、Roche Lightcycler 480 PCR仪（Roche公司）、BX51T-PHD-J11显微镜（奥林巴斯公司，日本）及DSHZ-300型恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）。
1.3 方法
1.3.1 实时定量PCR法检测组织中COMT mRNA的表达
使用Trizol试剂盒提取组织中的总RNA（操作按试剂盒说明书进行）。使用COMT mRNA和GAPDH mRNA引物逆转录合成cDNA（操作按逆转录试剂盒说明书进行），于Roche Lightcycler 480 PCR仪上进行标准的实时定量PCR。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后1个循环72℃延伸10 min，共30个循环。PCR反应体系同试剂盒说明书。以GAPDH为内参，由Roche Lightcycler 480 PCR仪直接得到各标本中COMT mRNA的相对表达量。
1.3.2 免疫组化法检测组织中COMT的表达
将石蜡切片常规脱蜡水化，以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，以微波炉加热修复抗原3 min；加COMT一抗（1︰400稀释）4℃冰箱过夜后，加二抗37℃静置10 min；以DAB显色、苏木精复染，行脱水透明封片后，在显微镜下观察。免疫组化结果判断采用染色强度和阳性细胞率两项指标。染色强度：阴性，0分；弱阳性，1分；阳性，2分；强阳性，3分。阳性细胞率：< 5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；> 75%，4分。将两项指标相乘，即得到免疫组化得分。以免疫组化得分的中位数值为高表达和低表达的判定界点。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验、Z检验或秩和检验，计数资料比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COMT mRNA的表达水平结果
因部分标本的RNA降解严重，仅有17对结直肠腺瘤及其瘤旁标本可以继续进行后续逆转录定量PCR实验，以测定COMT mRNA的相对表达量。PCR结果表明，结直肠腺瘤组织中COMT mRNA表达水平的中位数为0.109 0，高于瘤旁组织的0.000 5（t=3.02，P=0.01）。因部分标本RNA降解严重，仅有16对CRC及其癌旁标本可以继续进行后续逆转录定量PCR实验，以测定COMT mRNA的表达水平。PCR结果表明，CRC组织中COMT mRNA表达水平的中位数为0.041 8，高于其癌旁组织的0.013 5（t=2.71，P=0.02）。
2.2 COMT的表达水平结果
免疫组化染色结果显示（图 1），在结直肠腺瘤及其瘤旁组织、CRC及其癌旁组织中，COMT阳性染色主要定位于腺体细胞的胞质。结直肠腺瘤组织中COMT的高表达率为72.34%（34/47），高于瘤旁组织的25.53%（12/47），χ2=28.72，P < 0.01；CRC组织中COMT的高表达率为66.67%（28/42），高于癌旁组织的28.57%（12/42），χ2=4.97，P < 0.05。
图1
COMT在结直肠腺瘤组织及其瘤旁组织、CRC组织及其癌旁组织中的表达结果，红箭指示高表达，白箭指示低表达。1A：结直肠腺瘤组织（SP×400）；1B：结直肠腺瘤瘤旁组织（SP×1 000）；1C：CRC组织（SP×400）；1D：CRC癌旁组织（SP×1 000）
2.3 COMT表达与患者临床病理特征的关系
在结直肠腺瘤组织中，COMT高表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位及病理学类型均无关（P > 0.05），见表 1。在CRC组织中，COMT高表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位及分化程度均无关（P > 0.05）；但与TNM分期、T分期及N分期均相关（P < 0.05），TNMⅠ+Ⅱ期、T1+T2期及N0期患者的COMT高表达率较高（表 1）。
表1
OMT表达与结直肠腺瘤和CRC临床病理特征的关系（例）
3 讨论
COMT是体内儿茶酚胺类物质的代谢酶，其可将儿茶酚雌激素——2-羟雌二醇（2-catechol estrogen，2-OHE2）、4-羟雌二醇（4-catechol estrogen，4-OHE2）和16α-羟雌二醇（16α-catechol estrogen，16α-OHE2）甲基化成无活性的甲氧雌激素，以减轻雌激素的致癌效应[6, 9]；其还通过促进儿茶酚雌激素代谢产物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）来抑制肿瘤的增殖和促进凋亡的发生，以及抑制肿瘤血管的生成，从而发挥抑癌作用[10]。COMT的编码基因位于第22号染色体q11.2区域，编码合成膜结合型COMT和细胞质可溶性COMT，人体内细胞质可溶性COMT是其主要的表达形式[11-12]。本组免疫组化染色结果显示，在结直肠腺瘤及其瘤旁组织、CRC及其癌旁组织中，COMT阳性染色主要定位于腺体细胞的胞质。
近年来研究表明，COMT基因及COMT基因多态性与雌激素代谢相关的肿瘤关系密切，如COMT MET158基因型与乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病相关[13-15]；COMT rs4818位点的基因多态性与乳腺癌患者的预后相关[16]；而COMT基因多态性导致的酶活性降低则促进子宫内膜癌的发生[17]，且COMT酶活性低的乳腺癌患者的淋巴结转移率高[18]，同时乳腺癌患者的2-ME生成减少[19]。
结直肠虽不像乳腺、子宫内膜一样与雌激素有着十分直接明显的关系，但是对于CRC与雌激素的关系，自20世纪80年代以来就持续受到关注。流行病学研究[20]表明，女性的CRC发病率比男性低35%。绝经后妇女服用大豆以进行雌激素替代治疗（HRT）相关研究[21]表明，雌激素可明显降低CRC的发病率。一项针对SW480结肠癌细胞株的研究[22]表明，雌激素受体β能抑制结肠癌细胞的细胞周期途径，进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。Cleveland等[23]的针对Apc小鼠的研究显示，雌激素受体α和雌激素受体β可以参与调节CRC的发生，雌激素受体α还可以部分调节Wnt/beta-catenin途径的活性，而Wnt/beta-catenin信号通路的异常激活被认为是结直肠黏膜发生腺瘤的关键启动因素。研究[24]证实，雌激素和雌激素受体与CRC细胞的癌变、凋亡和转移，以及CRC的病理学类型、疾病进展和预后均存在密切的联系。在存在相同错配修复缺陷的结肠癌患者中，女性患者所占的比例要低于男性[25]，表明甾体类激素可能会影响CRC的发生。抗雌激素药物tamoxifen可以增加CRC的患病风险，而HRT可以将绝经后妇女的CRC发病率降低40%，并且还可以减小结直肠腺瘤的发病率及其瘤体体积[20]。因此，雌激素对CRC的保护作用被广泛认可。但是WHI干预试验结果[26]显示，对于绝经后妇女给予雌激素+孕酮的HRT，虽然可以降低CRC的发病风险，但是却提高了罹患乳腺癌以及心血管疾病的风险，所以目前仍然没有作为临床推荐的干预措施。而对于HRT的前景，有学者[26]考虑，是否可以采用联合用药方式，使药物相互协同作用，以避免各自的副作用或不良后果。
北京协和医院吴文铭等[7]在此前的研究中发现，COMT在CRC组织中的表达水平明显高于正常组织，这与COMT在乳腺癌、子宫内膜癌及胰腺癌组织中的表达情况报道[27-29]相一致。本组资料结果也表明，结直肠腺瘤和CRC组织中COMT mRNA及其蛋白的表达水平均高于相应的癌（瘤）旁组织；COMT高表达与CRC的TNM分期、T分期及N分期相关，提示COMT参与了CRC的发生和发展，但具体机理尚不清楚。另一方面，绝经后女性行HRT可以降低CRC的发病风险，同时COMT基因的多态性与绝经后女性CRC患者的预后相关[30-31]。因此，笔者猜想，结直肠腺瘤及CRC组织中COMT mRNA及其蛋白表达上调的原因是细胞的应激反应或主动防御机制，以减少细胞内儿茶酚雌激素的蓄积或产生更多的2-ME。
综上所述，COMT在CRC的发生和发展中可能发挥一定的作用，对其表达水平的检测可以作为CRC早期诊断的标志物，这为CRC的诊断提供了一种思路。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界范围内常见的恶性肿瘤，其发病率与死亡率都位居于恶性肿瘤的前列[1-2]。我国也是CRC高发的国家之一[3]。现代分子生物学研究[4-5]揭示，CRC的发生及发展是一个多基因参与、多步骤演变的恶性进程，但能够用于CRC辅助诊断、预后判断及干预治疗的新靶点仍是CRC相关研究的热点和难点。儿茶酚胺氧位甲基转移酶（catechol O-methyltransferase，COMT）是儿茶酚雌激素代谢的关键酶，对雌激素诱导的DNA损伤具有保护作用[6]。研究[7]表明，COMT在CRC组织中的表达水平明显高于正常组织。基于此，笔者认为有必要对结直肠腺瘤及CRC组织进行研究，故笔者通过实时定量PCR法和免疫组化方法检测了COMT mRNA及其蛋白在结直肠腺瘤及CRC组织中的表达情况，以探讨其在CRC发生和发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集2013年1～11月期间于北京协和医院行电子结肠镜下高频电凝切除的47例结直肠腺瘤患者的结直肠腺瘤组织及其瘤旁组织（距离腺瘤以远5 cm）标本。47例结直肠腺瘤患者中，男30例，女17例；年龄35～83岁，平均63.7岁；包括结肠腺瘤34例，直肠腺瘤13例；管状腺瘤30例，锯齿状、绒毛状及管状绒毛状腺瘤17例，均经术后病理学检查证实。同时回顾性收集2012年7～9月期间于北京协和医院行手术的42例CRC患者的癌组织及其癌旁组织（距离癌灶以远5 cm）标本。42例CRC患者中，男19例，女23例；年龄35～84岁，平均66.3岁；包括结肠癌19例，直肠癌23例；采用《美国癌症联合委员会第七版分期方法》（2010年）[8]进行TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期13例，Ⅲ期23例；分化程度：高分化13例，中分化22例，低分化7例；淋巴结转移23例，淋巴结无转移19例；所有CRC患者术前均未行新辅助治疗，且均经术后病理学检查证实。标本采集后均快速放至液氮中冷冻，-80℃保存。本研究获得北京协和医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和设备
COMT鼠抗人多克隆抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG-Fc段抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，总RNA抽提试剂Trizol购自Invitrogen公司，Moloney小鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶购自Promega公司，FastStart Universal SYBR Green Master试剂盒购自Roche公司。COMT和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的PCR引物由Invitrogen公司合成，并登陆GeneBank确认无误。COMT mRNA引物：上游5′-ATTGACACCTA-CTGCGAGCA-3′，下游5′-CCACATTC CTCCAAGAG-AAGC-3′，扩增产物长度为388 bp；GAPDH mRNA引物：上游5′-GGCTGCCATTTGCACTGGCAA-3′，下游5′-TGCCDTGAGTGGAGTCATACTG-3′，扩增产物长度为318 bp。设备：5810R/5415D离心机（Eppen-dorf公司，德国）、Roche Lightcycler 480 PCR仪（Roche公司）、BX51T-PHD-J11显微镜（奥林巴斯公司，日本）及DSHZ-300型恒温水浴箱（江苏太仓医用仪器厂）。
1.3 方法
1.3.1 实时定量PCR法检测组织中COMT mRNA的表达
使用Trizol试剂盒提取组织中的总RNA（操作按试剂盒说明书进行）。使用COMT mRNA和GAPDH mRNA引物逆转录合成cDNA（操作按逆转录试剂盒说明书进行），于Roche Lightcycler 480 PCR仪上进行标准的实时定量PCR。PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后1个循环72℃延伸10 min，共30个循环。PCR反应体系同试剂盒说明书。以GAPDH为内参，由Roche Lightcycler 480 PCR仪直接得到各标本中COMT mRNA的相对表达量。
1.3.2 免疫组化法检测组织中COMT的表达
将石蜡切片常规脱蜡水化，以3% H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，以微波炉加热修复抗原3 min；加COMT一抗（1︰400稀释）4℃冰箱过夜后，加二抗37℃静置10 min；以DAB显色、苏木精复染，行脱水透明封片后，在显微镜下观察。免疫组化结果判断采用染色强度和阳性细胞率两项指标。染色强度：阴性，0分；弱阳性，1分；阳性，2分；强阳性，3分。阳性细胞率：< 5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；> 75%，4分。将两项指标相乘，即得到免疫组化得分。以免疫组化得分的中位数值为高表达和低表达的判定界点。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验、Z检验或秩和检验，计数资料比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COMT mRNA的表达水平结果
因部分标本的RNA降解严重，仅有17对结直肠腺瘤及其瘤旁标本可以继续进行后续逆转录定量PCR实验，以测定COMT mRNA的相对表达量。PCR结果表明，结直肠腺瘤组织中COMT mRNA表达水平的中位数为0.109 0，高于瘤旁组织的0.000 5（t=3.02，P=0.01）。因部分标本RNA降解严重，仅有16对CRC及其癌旁标本可以继续进行后续逆转录定量PCR实验，以测定COMT mRNA的表达水平。PCR结果表明，CRC组织中COMT mRNA表达水平的中位数为0.041 8，高于其癌旁组织的0.013 5（t=2.71，P=0.02）。
2.2 COMT的表达水平结果
免疫组化染色结果显示（图 1），在结直肠腺瘤及其瘤旁组织、CRC及其癌旁组织中，COMT阳性染色主要定位于腺体细胞的胞质。结直肠腺瘤组织中COMT的高表达率为72.34%（34/47），高于瘤旁组织的25.53%（12/47），χ2=28.72，P < 0.01；CRC组织中COMT的高表达率为66.67%（28/42），高于癌旁组织的28.57%（12/42），χ2=4.97，P < 0.05。
图1
COMT在结直肠腺瘤组织及其瘤旁组织、CRC组织及其癌旁组织中的表达结果，红箭指示高表达，白箭指示低表达。1A：结直肠腺瘤组织（SP×400）；1B：结直肠腺瘤瘤旁组织（SP×1 000）；1C：CRC组织（SP×400）；1D：CRC癌旁组织（SP×1 000）
2.3 COMT表达与患者临床病理特征的关系
在结直肠腺瘤组织中，COMT高表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位及病理学类型均无关（P > 0.05），见表 1。在CRC组织中，COMT高表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位及分化程度均无关（P > 0.05）；但与TNM分期、T分期及N分期均相关（P < 0.05），TNMⅠ+Ⅱ期、T1+T2期及N0期患者的COMT高表达率较高（表 1）。
表1
OMT表达与结直肠腺瘤和CRC临床病理特征的关系（例）
3 讨论
COMT是体内儿茶酚胺类物质的代谢酶，其可将儿茶酚雌激素——2-羟雌二醇（2-catechol estrogen，2-OHE2）、4-羟雌二醇（4-catechol estrogen，4-OHE2）和16α-羟雌二醇（16α-catechol estrogen，16α-OHE2）甲基化成无活性的甲氧雌激素，以减轻雌激素的致癌效应[6, 9]；其还通过促进儿茶酚雌激素代谢产物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME）来抑制肿瘤的增殖和促进凋亡的发生，以及抑制肿瘤血管的生成，从而发挥抑癌作用[10]。COMT的编码基因位于第22号染色体q11.2区域，编码合成膜结合型COMT和细胞质可溶性COMT，人体内细胞质可溶性COMT是其主要的表达形式[11-12]。本组免疫组化染色结果显示，在结直肠腺瘤及其瘤旁组织、CRC及其癌旁组织中，COMT阳性染色主要定位于腺体细胞的胞质。
近年来研究表明，COMT基因及COMT基因多态性与雌激素代谢相关的肿瘤关系密切，如COMT MET158基因型与乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的发病相关[13-15]；COMT rs4818位点的基因多态性与乳腺癌患者的预后相关[16]；而COMT基因多态性导致的酶活性降低则促进子宫内膜癌的发生[17]，且COMT酶活性低的乳腺癌患者的淋巴结转移率高[18]，同时乳腺癌患者的2-ME生成减少[19]。
结直肠虽不像乳腺、子宫内膜一样与雌激素有着十分直接明显的关系，但是对于CRC与雌激素的关系，自20世纪80年代以来就持续受到关注。流行病学研究[20]表明，女性的CRC发病率比男性低35%。绝经后妇女服用大豆以进行雌激素替代治疗（HRT）相关研究[21]表明，雌激素可明显降低CRC的发病率。一项针对SW480结肠癌细胞株的研究[22]表明，雌激素受体β能抑制结肠癌细胞的细胞周期途径，进而抑制肿瘤细胞的增殖和转移。Cleveland等[23]的针对Apc小鼠的研究显示，雌激素受体α和雌激素受体β可以参与调节CRC的发生，雌激素受体α还可以部分调节Wnt/beta-catenin途径的活性，而Wnt/beta-catenin信号通路的异常激活被认为是结直肠黏膜发生腺瘤的关键启动因素。研究[24]证实，雌激素和雌激素受体与CRC细胞的癌变、凋亡和转移，以及CRC的病理学类型、疾病进展和预后均存在密切的联系。在存在相同错配修复缺陷的结肠癌患者中，女性患者所占的比例要低于男性[25]，表明甾体类激素可能会影响CRC的发生。抗雌激素药物tamoxifen可以增加CRC的患病风险，而HRT可以将绝经后妇女的CRC发病率降低40%，并且还可以减小结直肠腺瘤的发病率及其瘤体体积[20]。因此，雌激素对CRC的保护作用被广泛认可。但是WHI干预试验结果[26]显示，对于绝经后妇女给予雌激素+孕酮的HRT，虽然可以降低CRC的发病风险，但是却提高了罹患乳腺癌以及心血管疾病的风险，所以目前仍然没有作为临床推荐的干预措施。而对于HRT的前景，有学者[26]考虑，是否可以采用联合用药方式，使药物相互协同作用，以避免各自的副作用或不良后果。
北京协和医院吴文铭等[7]在此前的研究中发现，COMT在CRC组织中的表达水平明显高于正常组织，这与COMT在乳腺癌、子宫内膜癌及胰腺癌组织中的表达情况报道[27-29]相一致。本组资料结果也表明，结直肠腺瘤和CRC组织中COMT mRNA及其蛋白的表达水平均高于相应的癌（瘤）旁组织；COMT高表达与CRC的TNM分期、T分期及N分期相关，提示COMT参与了CRC的发生和发展，但具体机理尚不清楚。另一方面，绝经后女性行HRT可以降低CRC的发病风险，同时COMT基因的多态性与绝经后女性CRC患者的预后相关[30-31]。因此，笔者猜想，结直肠腺瘤及CRC组织中COMT mRNA及其蛋白表达上调的原因是细胞的应激反应或主动防御机制，以减少细胞内儿茶酚雌激素的蓄积或产生更多的2-ME。
综上所述，COMT在CRC的发生和发展中可能发挥一定的作用，对其表达水平的检测可以作为CRC早期诊断的标志物，这为CRC的诊断提供了一种思路。
