引用本文： 黄伯儒, 赵海平, 胡文秀. 髓鞘碱性蛋白、TNF-α和IL-6在实验性大鼠胰性脑病中的水平变化及相关性研究. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(7): 816-821. doi: 10.7507/1007-9424.20150211 复制
胰性脑病（pancIeatic encephalopathy，PE）是重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的严重并发症。SAP患者表现有定向力障碍、烦躁不安、激动伴妄想、嗜睡等异常精神状态的症候群并将其定义为PE [1-3]。PE的病死率高，临床报道逐渐增多，国内外对其关注度也有所提高,查阅国内2004～2014年文献，对文献报道病例进行统计，SAP合并PE患者243例，其中经治疗无效死亡103例，病死率为42.4%。而此前国内学者[4]检索1994 年以来SAP合并PE患者文献，汇总国内文献报道的PE患者 108 例，结果发现，PE发病率占同期SAP的9%～20%，平均为10.6%，病死率达 40.00%～66.67%。说明PE的发生率并不低。通过两次病例统计发现，近年来PE的病死率无明显变化，依然是高病死率，究其原因：①近年我们对PE的研究主要集中在发病机理的研究，而没有进一步去研究PE的诊断及治疗机制；②在动物实验方面没有为临床提供足够的依据。因此我们需要在熟知PE发病机理的基础上，通过动物实验试着去找到治疗途径，最终降低PE的病死率，为广大患者带来光明。
随着大鼠PE模型建立的逐渐成熟，以及对PE发病机理研究的逐渐深入[5-7]，我们得知髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是构成神经髓鞘的主要蛋白质，当MBP暴露或释放至脑脊液中时，可引起免疫应答，刺激机体产生抗MBP抗体，刺激单核细胞产生TNF-α和IL-6，导致PE的发生发展[8-11]。如何利用这些因子的水平变化准确地诊断及治疗PE，降低发病率及病死率，为临床提供准确的实验依据，是我们现在应重点研究的问题。
本研究将在大鼠PE模型上，同过分析病情发展与MBP、TNF-α和IL-6含量变化之间的相关性，旨在为PE的临床诊断及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
5%牛磺胆酸钠，美国SIGMA公司；一次性BD胰岛素注射器，美国BD公司；大鼠MBP、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒，美国Diagnostic Systems Lab-oratories公司；TP-B展片机、HP-B烤片机及组织包埋机，天津久圣医疗电子仪器有限公司；Leica RM2016切片机、LEICA EG 1150H蜡缸及LEICA EG 1150C冷却台，Leica公司；XS-212 002684显微镜，江南显微镜厂；HPX-9082 ME数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 实验动物及分组
健康清洁级SD大鼠40只，购自北京大学动物实验中心，雌雄各半，体质量（260±40）g，购回后适应性喂养1周，应用拆信封法随机分为SO组10只和PE组30只。PE组按照完全随机化原则再分成造模后1 d、3 d及7 d 3个亚组。
1.3 PE动物模型制备
手术器械消毒，操作过程严格无菌，实验大鼠术前禁食24 h，自由饮水。采用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔注射麻醉。待麻醉满意后将大鼠固定于手术台，腹部术区备皮，常规碘伏消毒铺巾，取上腹正中切口入腹，显露十二指肠，辨认胰腺、胆管系统及肝门部胆管。于肝门部辨认肝门部胆总管，用小动脉夹暂时阻闭，于乳头开口内下的肠壁上用一次性BD胰岛素注射器以针头与肠管壁成10º角刺入十二指肠壁内，经乳头部插入胰胆管内，封闭胰胆管十二指肠开口端，以0.3 mL/min的速度匀速向胰胆管内注入5%牛磺胆酸钠2 mL/kg。注射完毕后，去除夹闭的动脉夹，检查见无明显出血即漏胆后关腹。大鼠苏醒后禁食，可饮水，分组进行饲养。SO组大鼠同法经十二指肠乳头逆行胰胆管穿刺注射生理盐水2 mL/kg，速度为0.3 mL/min。
SO组大鼠于造模后第1 d用10%水合氯醛（3.3ml/kg）腹腔注射麻醉后，经心脏右心房取血，同时左心房推注35%的甲醛水溶液20 mL。采用微量进样器经硬脊膜穿刺抽取大鼠脑脊液，取完后处死大鼠，取脑组织及胰腺组织。PE组大鼠分别在造模后1 d、3 d及7 d用同法采取血液、脑脊液、脑组织及胰腺组织。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 一般项目观察
造模成功后开始观察大鼠呼吸、进食量、活动量、神经反射以及意识状态。
1.4.2 血清MBP、TNF-α及IL-6水平测定
SO组大鼠于术后1 d和PE组大鼠分别于造模后1 d、3 d及7 d采静脉血2 mL。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.3 脑脊液MBP、TNF-α及IL-6水平测定
SO组大鼠于术后1 d抽取脑脊液标本400 μL和PE组大鼠分别于造模后1 d、3 d及7d抽取脑脊液标本400 μL，采用ELISA法检测脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.4 脑组织含水量测定
将取得的大鼠脑组织用电子天平直接称湿重，然后放在80 ℃烤箱中24 h烤干，再测大鼠脑组织的干重。脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.4.5 脑组织及胰腺组织病理学观察
取大鼠全部脑组织及胰腺组织行常规石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察。另外，在光镜下观察20个脑微血管断面，并计数20个断面内聚集和附壁的白细胞总数，取其均数。
1.5 统计学方法
采用SPSS l3.0统计软件。实验数据用均数±标准差（
2 结果
2.1 大鼠一般情况
SO组大鼠麻醉清醒后（术后约25 min）即开始进食，活动无明显减少。PE组大鼠麻醉苏醒时间明显延长（术后约40 min），造模后第2天，一般情况差，表现为进食减少，少动，弓背，精神萎靡，烦渴，腹胀明显,但至造模后第7天，上述症状无明显加重。
2.2 脑组织含水量检测结果
结果见表 1。由表 1可见，造模后1 d、3 d及7 d PE组大鼠脑组织含水量均明显高于SO组（P<0.05），但PE组造模后各时相间脑组织含水量比较其差异则无统计学意义（P>0.05）。
2.3 血清MBP、TNF-α和IL-6水平检测结果
结果见表 1。由表 1可见，PE组大鼠造模后各时相血清MBP、TNF-α及IL-6水平均明显高于SO组（P<0.05）；PE组大鼠造模后随着时间的延长，血清MBP、TNF-α及IL-6水平均逐渐升高，经单因素方差分析显示，其差异均有统计学意义（P<0.05）。进一步行两两比较，MBP在造模后3个时相间比较其差异均有统计学意义（P<0.05），而TNF-α和IL-6水平在造模后3 d及7 d高于造模后1 d（P<0.05），但造模后3 d与7 d比较其差异则无统计学意义（P>0.05）。
表1
2组大鼠脑组织含水量和血清MBP、TNF-α及IL-6水平检测结果（2.4 脑脊液MBP、TNF-α和IL-6水平检测结果
结果见表 2。由表 2可见，PE组大鼠造模后各时相脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均明显高于SO组（P<0.05）；PE组大鼠造模后随着时间延长，脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均逐渐升高，经单因素方差分析，其差异均有统计学意义（P<0.05）。进一步行两两比较，MBP在造模后7 d明显高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d间比较差异无统计学意义（P>0.05）；TNF-α在造模后7 d明显高于造模后1 d（P<0.05），而造模后3 d与1 d比较和7 d与3 d比较其差异均无统计学意义（P>0.05）；IL-6在造模后7 d明显高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
2组大鼠脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平检测结果（2.5 脑组织病理学改变
SO组大鼠可见散在的神经元细胞轻度水肿，脑组织内未见炎性细胞聚集，脑组织的微血管内有少数的白细胞附壁。PE组大鼠神经元细胞水肿明显，在术后1 d即出现，随着时间的延长，神经元细胞水肿加重，呈气球样变（图 1）；脑组织中炎性细胞增生和聚集于术后1 d即开始出现，随着时间的延长，炎性细胞数目明显增多（图 2）；小血管内皮细胞出现肿胀，微血管内白细胞发生聚集及附壁，其数目也随着时间的延长而增加（图 3）。
图1
示PE组神经元细胞，可见明显水肿，呈气球样变（HE ×200） 图 2 示PE组，见脑组织炎性细胞浸润，表现为炎细胞聚集（HE ×200） 图 3 示PE组的脑组织微血管，黑箭示炎性细胞的附壁和聚集（HE ×200） 图 4 示PE组大鼠胰腺整体外观，胰腺有明显的出血坏死 图 5 示PE组大鼠大体解剖，胰腺可见出血、水肿及渗出，胰腺周围及肠系膜上可见散在钙化灶 图 6 示胰腺组织的病理改变，见胰腺小叶结构破坏，腺泡空泡变性,有大量炎性细胞浸润（HE ×200）
2.6 胰腺组织病理学变化
SO组大鼠胰腺色泽正常，无肥厚，镜下腺泡及小叶机构正常。PE组大鼠胰腺腺体外观增大，肥厚，呈红紫色（图 4），可见腺体及周围肠系膜上有散在皂化斑（图 5）。镜下可见腺泡严重破坏，血管消化，小叶结构模糊不清，坏死灶外有炎性区围绕（图 6）。
3 讨论
SAP病情危重,变化复杂,早期以胰腺出血坏死为主,晚期多合并胰腺脏器的损伤。当出现中枢神经系统表现时被认为是PE [1, 12-15]。现在尚无特异性检查方法和诊断标准，主要根据急性胰腺炎及其临床表现进行诊断。就临床表现我们应该首先慎重排除类似疾病：①Wernicke脑病。该病多发生在急性胰腺炎确诊后2～3周，由于长时间禁食和高分解代谢，出现记忆力下降，定向力障碍等神经系统改变，但是无局灶性定位体征，并且在给予维生素B1后症状可好转。而PE的发生多集中在SAP发生后2周内，补充维生素B1无明显好转。②急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。ARDS多发生在SAP确诊后1周内，与PE的发病时间比较接近，同PE一样伴有意识障碍，氧分压较低可通过血氧检测及时发现，通过机械通气纠正低氧血症后，症状可好转。③电解质紊乱。由于急性胰腺炎的治疗需要长期禁食，并且在急性期机体神经内分泌激素分泌水平出现异常，很容易出现低钠、低钙血症，临床可表现为嗜睡、淡漠、无力等，容易和PE混淆，但是在纠正电解质紊乱后脑功能障碍则可缓解。④低血糖。当重症胰腺炎并发低血糖时，患者会出现意识障碍、嗜睡等中枢神经系统症状，及时给予高糖可纠正。⑤当患者有脑出血或脑梗塞时，可出现烦躁、谵妄等神经症状，CT和MRI可确诊，比较容易和PE鉴别。通过临床表现我们可以诊断PE的发生，但这是一个很复杂的过程，PE的发展速度较快，预后较差，这就要求我们在PE的诊断上要寻找新思路、新方法，使诊断能更快，这样才能降低中枢神经系统的损伤。为对PE发病机理进行进一步研究，本研究采用逆行胰胆管穿刺注射5%牛磺胆酸钠的方法诱导建立大鼠PE模型，检测在PE发生发展中关键免疫因子的水平，分析其与疾病的相关性，旨在为临床诊治PE提供一种新的手段。
3.1 MBP对PE的影响
在MBP介导脱髓鞘病变时存在免疫忽视，自身抗原的能量效应能致淋巴细胞克隆清除或克隆忽视，是经抗原转基因小鼠证实的。小鼠的实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）就是由对自身MBP的多肽特异应答Th1细胞被活化所致的一种典型的中枢神经系统损伤[16-17]。在实验性对MBP特异性识别的TCR转基因小鼠体内，大部分T淋巴细胞均表达转基因的MBP特异性T淋巴细胞抗原受体（TCR），但不引起EAE，其原因是外周组织MBP的表达量很低，只有在中枢神经系统中MBP表达量才高，但是该处是免疫隔离部位，初始T淋巴细胞不能进入[18]。这些免疫忽视的自身应答性T淋巴细胞，会因感染的病原体与自身抗原的分子模拟作用，使抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）活化，高表达B7等辅助刺激分子，提供第二信号，诱导免疫应答，产生效应T淋巴细胞，伤害相应自身组织细胞。随感染的控制及消失，APC不再活化，这种自身应答细胞又恢复到静止的免疫忽视状态[19-20]。
SAP发病时，胰腺出现出血坏死，诱导其产生大量脂酶，其中可溶性磷脂酶A2（soluble phospholipase A2，S-PLA2）是胰腺的产物。PLA2被蛋白酶、离子激活后，催化断裂卵磷脂的第2位脂键，使胰液中的卵磷脂和脑磷脂其转变为溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine）和溶血性脑磷脂（lysocephalin），使细胞膜分解，具有高度的细胞毒性和嗜神经性。当破坏了脑细胞的功能后引起脑组织损伤。它可以影响细胞膜的通透性，破坏血脑脊液的屏障。此时中枢神经系统MBP的免疫忽视状态被打破。在APC表面，同时表达MHC-ⅡAg、MBP等抗原的表位，而在T淋巴细胞中有MBP抗原致敏T淋巴细胞，T淋巴细胞对其进行双识别后，自身抗原肽段MHC-Ⅱ类抗原复合物刺激CD4+ Th1细胞分化为致敏CD4+ Thl细胞，当它们与特异抗原再次结合后可释放多种细胞因子，介导细胞免疫，在PE中枢神经系统的脱髓鞘破坏中起主要作用[21-23]。T淋巴细胞增殖与干扰素-γ（IFN-γ）的量相互作用，Thl决定了每个亚群的免疫效应功能,还调控各亚群的形成及扩增，IFN-γ反作用于Th1,促使其进一步分化，产生更多的Th1细胞[24]。此外，特异性T淋巴细胞克隆增殖并形成记忆性T淋巴细胞，当再次遇到同一抗原时将引起记忆性T淋巴细胞的激活进行免疫应答[25-27]，这样就形成了“瀑布”样级联反应，加重PE的发展。
3.2 TNF-α对PE的影响
TNF-α是一种单核因子，生物活性占TNF总活性的70%～80%，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在活化的巨噬细胞内以膜结合型存在，并多以旁分泌或自分泌的方式释放，脂多糖是诱导其产生的强效刺激剂[24, 28]。TNF-α参与机体免疫应答和炎性反应，是血管源性脑水肿的触发因素，并参与神经元的凋亡。其介导SAP脑损伤的机理主要是：①TNF-α对毛细血管有直接损伤作用,导致微小动脉痉挛，毛细血管通透性增加，使血脑屏障大量开放，抗原抗体结合机会增加，加重PE脑组织的损伤。②TNF-α可损伤内皮细胞，上调金属蛋白酶（MMP）的表达，使基底膜上蛋白水解，进一步增加血脑屏障的通透性。③在TNF-α作用下，血小板活化因子合成表达，Ⅷ因子释放，抑制抗凝功能，形成凝血前活性状态，加重PE脑缺血损伤。④激活中性粒细胞，增加白细胞-内皮细胞黏附分子的表达，增加白细胞黏附到血管壁并随之进入脑组织，刺激释放有效的血管激活因子，导致血管收缩和舒张，降低血容量，增加BBB的通透性，加重PE症状。⑤TNF-α与增强毛细血管通透性的细胞介质形成“瀑布”样级联反应。⑥TNF-α介导髓鞘的炎性损伤，也可直接对髓鞘产生毒性破坏作用。本研究也进一步证明，在建模成功后的24 h，出现TNF-α的明显增高，此期间脑组织的损伤也达高峰期。因此，降低TNF-α含量，抑制它与其他因子的联级反应，可以减轻脑组织的损伤，降低PE发病率及死亡率。
3.3 IL-6对PE的影响
IL-6是脑损伤炎症反应中一个重要的炎性细胞因子，它的产生途径主要有两种：①直接产生。多种有核细胞都可以直接产生IL-6，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等。②诱导产生，部分TNF-α和IL-1能诱导IL-6的合成[29-31]。在正常情况下，血液和脑脊液中IL-6的表达很低，但是在炎症或损伤时其表达显著增加。IL-6在中枢神经系统中的生理功能很复杂，主要表现在两个方面，即介导炎症和促进神经变性。PE发病时其损伤机理主要是：①可以促进细胞间黏附因子（ICAM-1）的表达，而ICAM-1是中性粒细胞黏附所必需的，使炎性细胞黏附与聚集，加重脑组织损伤。②IL-6激活MMP，导致血脑屏障的破坏，通透性增加。③IL-6刺激内皮细胞合成内皮素，促进血小板生成素活性与C反应蛋白的增加，使血液凝固性增加，加重脑损伤。④IL-6可诱导和调剂急性时相反应（acute phase reaction，APR），改变血管通透性及急性时相蛋白，介导PE的发生发展。
本实验中，PE大鼠模型建立后，血清及脑脊液中MBP、TNF-α和IL-6水平在造模后1 d即明显升高，并且随着时间的延长一直维持在很高的水平，同时在不同时间点各因子有其增高的趋势，说明在PE发病的7 d内各因子对脑组织的损害一直在起作用，它们相互之间既可能存在协同作用，又有彼此不同的损伤高峰，而脑组织损害也逐渐加强，表现为白细胞附壁数目增由和神经纤维脱髓鞘改变的加重。
综上所述，在PE大鼠模型中，MBP、TNF-α和IL-6参与了大鼠PE脑组织损害的发生、发展，MBP、TNF-α和IL-6水平的增高与脑组织的病理损害相平行；在疾病的发生早期可以对它们的含量进行检测，以诊断PE的发生及其严重程度，并及时给予治疗以降低疾病的病死率。
胰性脑病（pancIeatic encephalopathy，PE）是重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）患者的严重并发症。SAP患者表现有定向力障碍、烦躁不安、激动伴妄想、嗜睡等异常精神状态的症候群并将其定义为PE [1-3]。PE的病死率高，临床报道逐渐增多，国内外对其关注度也有所提高,查阅国内2004～2014年文献，对文献报道病例进行统计，SAP合并PE患者243例，其中经治疗无效死亡103例，病死率为42.4%。而此前国内学者[4]检索1994 年以来SAP合并PE患者文献，汇总国内文献报道的PE患者 108 例，结果发现，PE发病率占同期SAP的9%～20%，平均为10.6%，病死率达 40.00%～66.67%。说明PE的发生率并不低。通过两次病例统计发现，近年来PE的病死率无明显变化，依然是高病死率，究其原因：①近年我们对PE的研究主要集中在发病机理的研究，而没有进一步去研究PE的诊断及治疗机制；②在动物实验方面没有为临床提供足够的依据。因此我们需要在熟知PE发病机理的基础上，通过动物实验试着去找到治疗途径，最终降低PE的病死率，为广大患者带来光明。
随着大鼠PE模型建立的逐渐成熟，以及对PE发病机理研究的逐渐深入[5-7]，我们得知髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)是构成神经髓鞘的主要蛋白质，当MBP暴露或释放至脑脊液中时，可引起免疫应答，刺激机体产生抗MBP抗体，刺激单核细胞产生TNF-α和IL-6，导致PE的发生发展[8-11]。如何利用这些因子的水平变化准确地诊断及治疗PE，降低发病率及病死率，为临床提供准确的实验依据，是我们现在应重点研究的问题。
本研究将在大鼠PE模型上，同过分析病情发展与MBP、TNF-α和IL-6含量变化之间的相关性，旨在为PE的临床诊断及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
5%牛磺胆酸钠，美国SIGMA公司；一次性BD胰岛素注射器，美国BD公司；大鼠MBP、TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒，美国Diagnostic Systems Lab-oratories公司；TP-B展片机、HP-B烤片机及组织包埋机，天津久圣医疗电子仪器有限公司；Leica RM2016切片机、LEICA EG 1150H蜡缸及LEICA EG 1150C冷却台，Leica公司；XS-212 002684显微镜，江南显微镜厂；HPX-9082 ME数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2 实验动物及分组
健康清洁级SD大鼠40只，购自北京大学动物实验中心，雌雄各半，体质量（260±40）g，购回后适应性喂养1周，应用拆信封法随机分为SO组10只和PE组30只。PE组按照完全随机化原则再分成造模后1 d、3 d及7 d 3个亚组。
1.3 PE动物模型制备
手术器械消毒，操作过程严格无菌，实验大鼠术前禁食24 h，自由饮水。采用10%水合氯醛3.3 mL/kg腹腔注射麻醉。待麻醉满意后将大鼠固定于手术台，腹部术区备皮，常规碘伏消毒铺巾，取上腹正中切口入腹，显露十二指肠，辨认胰腺、胆管系统及肝门部胆管。于肝门部辨认肝门部胆总管，用小动脉夹暂时阻闭，于乳头开口内下的肠壁上用一次性BD胰岛素注射器以针头与肠管壁成10º角刺入十二指肠壁内，经乳头部插入胰胆管内，封闭胰胆管十二指肠开口端，以0.3 mL/min的速度匀速向胰胆管内注入5%牛磺胆酸钠2 mL/kg。注射完毕后，去除夹闭的动脉夹，检查见无明显出血即漏胆后关腹。大鼠苏醒后禁食，可饮水，分组进行饲养。SO组大鼠同法经十二指肠乳头逆行胰胆管穿刺注射生理盐水2 mL/kg，速度为0.3 mL/min。
SO组大鼠于造模后第1 d用10%水合氯醛（3.3ml/kg）腹腔注射麻醉后，经心脏右心房取血，同时左心房推注35%的甲醛水溶液20 mL。采用微量进样器经硬脊膜穿刺抽取大鼠脑脊液，取完后处死大鼠，取脑组织及胰腺组织。PE组大鼠分别在造模后1 d、3 d及7 d用同法采取血液、脑脊液、脑组织及胰腺组织。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 一般项目观察
造模成功后开始观察大鼠呼吸、进食量、活动量、神经反射以及意识状态。
1.4.2 血清MBP、TNF-α及IL-6水平测定
SO组大鼠于术后1 d和PE组大鼠分别于造模后1 d、3 d及7 d采静脉血2 mL。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.3 脑脊液MBP、TNF-α及IL-6水平测定
SO组大鼠于术后1 d抽取脑脊液标本400 μL和PE组大鼠分别于造模后1 d、3 d及7d抽取脑脊液标本400 μL，采用ELISA法检测脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平。
1.4.4 脑组织含水量测定
将取得的大鼠脑组织用电子天平直接称湿重，然后放在80 ℃烤箱中24 h烤干，再测大鼠脑组织的干重。脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重×100%。
1.4.5 脑组织及胰腺组织病理学观察
取大鼠全部脑组织及胰腺组织行常规石蜡包埋、切片、HE染色,光镜下观察。另外，在光镜下观察20个脑微血管断面，并计数20个断面内聚集和附壁的白细胞总数，取其均数。
1.5 统计学方法
采用SPSS l3.0统计软件。实验数据用均数±标准差（
2 结果
2.1 大鼠一般情况
SO组大鼠麻醉清醒后（术后约25 min）即开始进食，活动无明显减少。PE组大鼠麻醉苏醒时间明显延长（术后约40 min），造模后第2天，一般情况差，表现为进食减少，少动，弓背，精神萎靡，烦渴，腹胀明显,但至造模后第7天，上述症状无明显加重。
2.2 脑组织含水量检测结果
结果见表 1。由表 1可见，造模后1 d、3 d及7 d PE组大鼠脑组织含水量均明显高于SO组（P<0.05），但PE组造模后各时相间脑组织含水量比较其差异则无统计学意义（P>0.05）。
2.3 血清MBP、TNF-α和IL-6水平检测结果
结果见表 1。由表 1可见，PE组大鼠造模后各时相血清MBP、TNF-α及IL-6水平均明显高于SO组（P<0.05）；PE组大鼠造模后随着时间的延长，血清MBP、TNF-α及IL-6水平均逐渐升高，经单因素方差分析显示，其差异均有统计学意义（P<0.05）。进一步行两两比较，MBP在造模后3个时相间比较其差异均有统计学意义（P<0.05），而TNF-α和IL-6水平在造模后3 d及7 d高于造模后1 d（P<0.05），但造模后3 d与7 d比较其差异则无统计学意义（P>0.05）。
表1
2组大鼠脑组织含水量和血清MBP、TNF-α及IL-6水平检测结果（2.4 脑脊液MBP、TNF-α和IL-6水平检测结果
结果见表 2。由表 2可见，PE组大鼠造模后各时相脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均明显高于SO组（P<0.05）；PE组大鼠造模后随着时间延长，脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平均逐渐升高，经单因素方差分析，其差异均有统计学意义（P<0.05）。进一步行两两比较，MBP在造模后7 d明显高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d间比较差异无统计学意义（P>0.05）；TNF-α在造模后7 d明显高于造模后1 d（P<0.05），而造模后3 d与1 d比较和7 d与3 d比较其差异均无统计学意义（P>0.05）；IL-6在造模后7 d明显高于造模后1 d及3 d（P<0.05），而造模后1 d及3 d间比较差异无统计学意义（P>0.05）。
表2
2组大鼠脑脊液中MBP、TNF-α及IL-6水平检测结果（2.5 脑组织病理学改变
SO组大鼠可见散在的神经元细胞轻度水肿，脑组织内未见炎性细胞聚集，脑组织的微血管内有少数的白细胞附壁。PE组大鼠神经元细胞水肿明显，在术后1 d即出现，随着时间的延长，神经元细胞水肿加重，呈气球样变（图 1）；脑组织中炎性细胞增生和聚集于术后1 d即开始出现，随着时间的延长，炎性细胞数目明显增多（图 2）；小血管内皮细胞出现肿胀，微血管内白细胞发生聚集及附壁，其数目也随着时间的延长而增加（图 3）。
图1
示PE组神经元细胞，可见明显水肿，呈气球样变（HE ×200） 图 2 示PE组，见脑组织炎性细胞浸润，表现为炎细胞聚集（HE ×200） 图 3 示PE组的脑组织微血管，黑箭示炎性细胞的附壁和聚集（HE ×200） 图 4 示PE组大鼠胰腺整体外观，胰腺有明显的出血坏死 图 5 示PE组大鼠大体解剖，胰腺可见出血、水肿及渗出，胰腺周围及肠系膜上可见散在钙化灶 图 6 示胰腺组织的病理改变，见胰腺小叶结构破坏，腺泡空泡变性,有大量炎性细胞浸润（HE ×200）
2.6 胰腺组织病理学变化
SO组大鼠胰腺色泽正常，无肥厚，镜下腺泡及小叶机构正常。PE组大鼠胰腺腺体外观增大，肥厚，呈红紫色（图 4），可见腺体及周围肠系膜上有散在皂化斑（图 5）。镜下可见腺泡严重破坏，血管消化，小叶结构模糊不清，坏死灶外有炎性区围绕（图 6）。
3 讨论
SAP病情危重,变化复杂,早期以胰腺出血坏死为主,晚期多合并胰腺脏器的损伤。当出现中枢神经系统表现时被认为是PE [1, 12-15]。现在尚无特异性检查方法和诊断标准，主要根据急性胰腺炎及其临床表现进行诊断。就临床表现我们应该首先慎重排除类似疾病：①Wernicke脑病。该病多发生在急性胰腺炎确诊后2～3周，由于长时间禁食和高分解代谢，出现记忆力下降，定向力障碍等神经系统改变，但是无局灶性定位体征，并且在给予维生素B1后症状可好转。而PE的发生多集中在SAP发生后2周内，补充维生素B1无明显好转。②急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。ARDS多发生在SAP确诊后1周内，与PE的发病时间比较接近，同PE一样伴有意识障碍，氧分压较低可通过血氧检测及时发现，通过机械通气纠正低氧血症后，症状可好转。③电解质紊乱。由于急性胰腺炎的治疗需要长期禁食，并且在急性期机体神经内分泌激素分泌水平出现异常，很容易出现低钠、低钙血症，临床可表现为嗜睡、淡漠、无力等，容易和PE混淆，但是在纠正电解质紊乱后脑功能障碍则可缓解。④低血糖。当重症胰腺炎并发低血糖时，患者会出现意识障碍、嗜睡等中枢神经系统症状，及时给予高糖可纠正。⑤当患者有脑出血或脑梗塞时，可出现烦躁、谵妄等神经症状，CT和MRI可确诊，比较容易和PE鉴别。通过临床表现我们可以诊断PE的发生，但这是一个很复杂的过程，PE的发展速度较快，预后较差，这就要求我们在PE的诊断上要寻找新思路、新方法，使诊断能更快，这样才能降低中枢神经系统的损伤。为对PE发病机理进行进一步研究，本研究采用逆行胰胆管穿刺注射5%牛磺胆酸钠的方法诱导建立大鼠PE模型，检测在PE发生发展中关键免疫因子的水平，分析其与疾病的相关性，旨在为临床诊治PE提供一种新的手段。
3.1 MBP对PE的影响
在MBP介导脱髓鞘病变时存在免疫忽视，自身抗原的能量效应能致淋巴细胞克隆清除或克隆忽视，是经抗原转基因小鼠证实的。小鼠的实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）就是由对自身MBP的多肽特异应答Th1细胞被活化所致的一种典型的中枢神经系统损伤[16-17]。在实验性对MBP特异性识别的TCR转基因小鼠体内，大部分T淋巴细胞均表达转基因的MBP特异性T淋巴细胞抗原受体（TCR），但不引起EAE，其原因是外周组织MBP的表达量很低，只有在中枢神经系统中MBP表达量才高，但是该处是免疫隔离部位，初始T淋巴细胞不能进入[18]。这些免疫忽视的自身应答性T淋巴细胞，会因感染的病原体与自身抗原的分子模拟作用，使抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）活化，高表达B7等辅助刺激分子，提供第二信号，诱导免疫应答，产生效应T淋巴细胞，伤害相应自身组织细胞。随感染的控制及消失，APC不再活化，这种自身应答细胞又恢复到静止的免疫忽视状态[19-20]。
SAP发病时，胰腺出现出血坏死，诱导其产生大量脂酶，其中可溶性磷脂酶A2（soluble phospholipase A2，S-PLA2）是胰腺的产物。PLA2被蛋白酶、离子激活后，催化断裂卵磷脂的第2位脂键，使胰液中的卵磷脂和脑磷脂其转变为溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine）和溶血性脑磷脂（lysocephalin），使细胞膜分解，具有高度的细胞毒性和嗜神经性。当破坏了脑细胞的功能后引起脑组织损伤。它可以影响细胞膜的通透性，破坏血脑脊液的屏障。此时中枢神经系统MBP的免疫忽视状态被打破。在APC表面，同时表达MHC-ⅡAg、MBP等抗原的表位，而在T淋巴细胞中有MBP抗原致敏T淋巴细胞，T淋巴细胞对其进行双识别后，自身抗原肽段MHC-Ⅱ类抗原复合物刺激CD4+ Th1细胞分化为致敏CD4+ Thl细胞，当它们与特异抗原再次结合后可释放多种细胞因子，介导细胞免疫，在PE中枢神经系统的脱髓鞘破坏中起主要作用[21-23]。T淋巴细胞增殖与干扰素-γ（IFN-γ）的量相互作用，Thl决定了每个亚群的免疫效应功能,还调控各亚群的形成及扩增，IFN-γ反作用于Th1,促使其进一步分化，产生更多的Th1细胞[24]。此外，特异性T淋巴细胞克隆增殖并形成记忆性T淋巴细胞，当再次遇到同一抗原时将引起记忆性T淋巴细胞的激活进行免疫应答[25-27]，这样就形成了“瀑布”样级联反应，加重PE的发展。
3.2 TNF-α对PE的影响
TNF-α是一种单核因子，生物活性占TNF总活性的70%～80%，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在活化的巨噬细胞内以膜结合型存在，并多以旁分泌或自分泌的方式释放，脂多糖是诱导其产生的强效刺激剂[24, 28]。TNF-α参与机体免疫应答和炎性反应，是血管源性脑水肿的触发因素，并参与神经元的凋亡。其介导SAP脑损伤的机理主要是：①TNF-α对毛细血管有直接损伤作用,导致微小动脉痉挛，毛细血管通透性增加，使血脑屏障大量开放，抗原抗体结合机会增加，加重PE脑组织的损伤。②TNF-α可损伤内皮细胞，上调金属蛋白酶（MMP）的表达，使基底膜上蛋白水解，进一步增加血脑屏障的通透性。③在TNF-α作用下，血小板活化因子合成表达，Ⅷ因子释放，抑制抗凝功能，形成凝血前活性状态，加重PE脑缺血损伤。④激活中性粒细胞，增加白细胞-内皮细胞黏附分子的表达，增加白细胞黏附到血管壁并随之进入脑组织，刺激释放有效的血管激活因子，导致血管收缩和舒张，降低血容量，增加BBB的通透性，加重PE症状。⑤TNF-α与增强毛细血管通透性的细胞介质形成“瀑布”样级联反应。⑥TNF-α介导髓鞘的炎性损伤，也可直接对髓鞘产生毒性破坏作用。本研究也进一步证明，在建模成功后的24 h，出现TNF-α的明显增高，此期间脑组织的损伤也达高峰期。因此，降低TNF-α含量，抑制它与其他因子的联级反应，可以减轻脑组织的损伤，降低PE发病率及死亡率。
3.3 IL-6对PE的影响
IL-6是脑损伤炎症反应中一个重要的炎性细胞因子，它的产生途径主要有两种：①直接产生。多种有核细胞都可以直接产生IL-6，如B淋巴细胞、T淋巴细胞、内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞等。②诱导产生，部分TNF-α和IL-1能诱导IL-6的合成[29-31]。在正常情况下，血液和脑脊液中IL-6的表达很低，但是在炎症或损伤时其表达显著增加。IL-6在中枢神经系统中的生理功能很复杂，主要表现在两个方面，即介导炎症和促进神经变性。PE发病时其损伤机理主要是：①可以促进细胞间黏附因子（ICAM-1）的表达，而ICAM-1是中性粒细胞黏附所必需的，使炎性细胞黏附与聚集，加重脑组织损伤。②IL-6激活MMP，导致血脑屏障的破坏，通透性增加。③IL-6刺激内皮细胞合成内皮素，促进血小板生成素活性与C反应蛋白的增加，使血液凝固性增加，加重脑损伤。④IL-6可诱导和调剂急性时相反应（acute phase reaction，APR），改变血管通透性及急性时相蛋白，介导PE的发生发展。
本实验中，PE大鼠模型建立后，血清及脑脊液中MBP、TNF-α和IL-6水平在造模后1 d即明显升高，并且随着时间的延长一直维持在很高的水平，同时在不同时间点各因子有其增高的趋势，说明在PE发病的7 d内各因子对脑组织的损害一直在起作用，它们相互之间既可能存在协同作用，又有彼此不同的损伤高峰，而脑组织损害也逐渐加强，表现为白细胞附壁数目增由和神经纤维脱髓鞘改变的加重。
综上所述，在PE大鼠模型中，MBP、TNF-α和IL-6参与了大鼠PE脑组织损害的发生、发展，MBP、TNF-α和IL-6水平的增高与脑组织的病理损害相平行；在疾病的发生早期可以对它们的含量进行检测，以诊断PE的发生及其严重程度，并及时给予治疗以降低疾病的病死率。
