引用本文： 梁正云, 王萌, 管文贤. 产气荚膜梭菌肠毒素在恶性肿瘤治疗中的进展. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(7): 893-987. doi: 10.7507/1007-9424.20150233 复制
大约85%的恶性肿瘤来源于上皮细胞，上皮细胞间的紧密连接与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤的发生往往伴随着紧密连接功能的降低及紧密连接蛋白表达的改变。Claudin-3、-4作为紧密连接结构的重要组成蛋白，在调节细胞旁渗透性及维持细胞极性中起着重要作用[1]。研究[2]发现，紧密连接蛋白Claudin-3、-4在多种肿瘤细胞中异常表达，因此，作为Claudin-3、-4的配体，产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）成为了潜在的肿瘤靶向药物。体外研究[3]证实，CPE确有靶向作用，且CPE在动物皮下移植瘤模型中取得一定疗效，但是，因其较大的肠毒性等副作用限制了它的临床应用。近年，利用CPE的羧基端多肽片段（C-CPE）的靶向性，将其连上一个其他的具有抗肿瘤效应的分子，改造为一个毒副作用较低的靶向药物的研究取得了一定的进展[4]。现将CPE及C-CPE的一些研究进展综述如下。
1 CPE蛋白
1.1 CPE蛋白简介
产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌，人和牲畜均可作为宿主，主要经粪口传播，可引起气性坏疽、肠道感染等疾病。其分泌的外毒素是主要致病因子，根据其分泌的外毒素不同，将其分为5型（A～E），少部分（不到5%）A型产气荚膜梭菌在形成孢子时还会分泌另外一种外毒素称为产气荚膜梭菌肠毒素（CPE），CPE可引起肠上皮脱落、肠坏疽、肠液吸收障碍等胃肠道疾病，进而导致严重腹泻、腹痛性痉挛等临床症状，这种症状一般12～24 h内恢复，但对老年人或患有药物性便秘的人来说可导致死亡[5]。
1.2 CPE蛋白的结构
CPE由319个氨基酸组成，相对分子质量约为35×103，有3个功能结构区域，分别为区域Ⅰ，区域Ⅱ和区域Ⅲ。其中区域Ⅰ由C端125个氨基酸组成，是介导CPE靶向结合受体的区域；区域Ⅱ和区域Ⅲ称为N端，是CPE毒性区域，可与细胞膜上受体形成多蛋白复合物CH-1，并插入细胞膜形成活化孔，导致钙离子内流，引起细胞胀裂或caspase-3途径的细胞凋亡。在N端还有1个由37个氨基酸组成的未知结构区域，将这个区域去掉后会使得CPE毒性增强2～3倍，可能是由于该区域的去除暴露了区域Ⅱ，促进了CH-1的形成。因此，该区域可能对CPE的齐聚反应起到开关的作用[6]。
由于CPE毒副反应大，其安全剂量、有效剂量及致死剂量之间相差较小，因此，有人[7]将CPE的N端毒性区域去掉，以期利用CPE蛋白C端即C-CPE的靶向效果并取得了成功。C-CPE是CPE的194～319氨基酸残基片段，含有9条β链。C-CPE具有完整的Claudin蛋白靶向性，与某些细胞毒性药物如TNF-α、蛋白合成抑制因子（PSIF）等连接后仍有靶向性[8-9]，故其可作为一个潜在的肿瘤靶向工具。也有研究[3]表明，一定浓度的C-CPE可加强高表达Claudin蛋白的恶性肿瘤对某些化疗药物如紫杉醇、卡铂等的敏感性。
1.3 CPE的细胞毒性
当CPE与其受体结合后，在细胞膜上形成一个相对分子质量约90×103的小复合物，该小复合物对十二烷基硫酸钠（SDS）敏感，其包含了CPE、Claudin受体蛋白和Claudin非受体蛋白，非受体蛋白的作用可能是与其他Claudin蛋白相互作用。6个小复合物聚合形成1个大的对SDS抵抗复合物，称为CPE六聚体（CH-1）。CH-1是相对分子质量约450×103、同样含有CP6分子CPE、受体Claudins和非受体Claudins。CH-1在细胞膜上可形成前孔，37 ℃下可迅速插入细胞膜形成活性孔。活性孔将导致钙离子内流，当CPE剂量大时，在细胞膜上可形成多个CH-1，最终导致大量钙离子内流而造成细胞胀裂死亡，当CPE剂量小时，活化孔只有少量钙离子内流，最终引起经典的caspase-3途径的细胞凋亡[10]。
CPE膜孔的形成也会导致细胞形态学上的改变，使得细胞基底侧暴露出来，这将使得CPE形成另外一个大的复合物CH-2，它不仅含有CH-1的成分，还含有另外一种紧密连接蛋白occludin。CH-2将导致occludin的内化，同时，CPE处理过的细胞还会发生Claudin内化[11]。这种改变形成的机理尚不清楚，但这种效果可能是CPE破坏紧密连接的机理之一。
2 Claudin蛋白
2.1 Claudin蛋白简介
紧密连接是上皮细胞之间的重要结构，对维持上皮细胞的屏障功能及细胞旁渗透性起着非常重要的作用。在一些研究中，上皮细胞紧密连接的破坏和功能紊乱与肿瘤的发生密切相关[12]；紧密连接由多种蛋白如Claudins蛋白家族、occludin蛋白及连接黏附分子（JAMs） 3种完整的蛋白、闭合小蛋白（ZO-1、ZO-2）等，其中Claudins蛋白最为重要[13]。现在已经发现的Claudins蛋白家族成员有24个，相对分子质量在20×103～27×103之间，含有4个跨膜区域、2个胞外环（ECL-1和ECL-2）、1个胞质尾区及细胞内的氨基端和羧基端[14]。Claudins蛋白在不同组织中表达不一，主要分布于肺、胃、小肠等组织，对维持紧密连接的结构及功能、稳定细胞旁渗透性及细胞极性起着重要作用[15]。
2.2 Claudin蛋白与肿瘤
自Claudin蛋白被发现以来，越来越多的研究表明Claudin蛋白与肿瘤密切相关。1999年Swisshelm等[16]发现，乳腺癌细胞的Claudin-1 mRNA表达比正常乳腺上皮细胞减少；随后的研究[17]在至少12种肿瘤细胞中发现了Claudin表达的改变。Claudins蛋白在肿瘤细胞中表达改变的机理尚不清楚，但有研究[18-19]表明，一些细胞因子会影响Claudins的表达，如肝细胞生长因子和表皮生长因子降低Claudin-7的表达，但会增加Claudin-1、-3、-4的表达，TNF-α、TNF-β及IL-17会引起Claudin-1表达的增加等。另外，高表达Claudin-4的胰腺癌细胞表现出了较低的运动性及侵袭性，在小鼠体内模型试验中，高表达Claudin-4的胰腺癌发生肺转移的可能较低[20]；而Tsutsumi等[21]对100例胰腺导管腺癌的研究发现，高表达Claudin-4的患者比低表达者有更长的生存期；相反，高表达Claudin-3、-4的卵巢癌恶性程度更高，用siRNA抑制Claudin-3、-4后，卵巢癌的侵袭性受到了抑制。在结肠癌小鼠体内模型中，抑制Claudin-1基因及过表达试验均获得同样的结果[22-23]。
Claudin蛋白在胃癌的研究中越来越受到重视。Jung等[24]在对72例胃癌的研究中发现，73.6%的患者高表达Claudin-2，而仅44.4%的患者高表达Claudin-4；在劳伦分型的肠型腺癌的患者显著低表达Claudin-1；淋巴结转移阳性的患者显著低表达Claudin-3、-4，据此推测，Claudin-3、-4可能与胃癌的淋巴转移有关。Zhu等[25]发现仅15.9%的正常胃黏膜高表达Claudin-4，而90%以上的肠上皮化生及胃上皮异型增生患者高表达Claudin-4，而确诊为胃癌的患者约53.2%高表达Claudin-4，说明Claudin-4在胃癌及前期病变中异常表达。Mima等[26]发现，非甾体类抗炎药能通过增加人胃癌细胞的Ca2+内流而诱导Claudin-4表达，且高表达Claudin-4的胃癌细胞降低了细胞的迁移，在琼脂培养基中细胞群体的形成也受到抑制，而用干扰RNA抑制Claudin-4表达后，非甾体类抗炎药则不能抑制细胞迁移力。这些研究表明，Claudin蛋白的异常表达与胃癌的发生及生长密切相关。
2.3 Claudin蛋白与CPE
自从1997年Katahira等[27]发现本来对CPE抵抗的成纤维母细胞在转染表达Vero细胞中的一个相对分子质量为22×103的蛋白后变为对CPE敏感后，Claudins蛋白逐渐受到重视。有研究[28]表明，CPE能与Claudin-3、-4、-6、-8、-14结合，而未检测出Claudin-1、-2、-5、-10能作为CPE受体。相关研究[29]表明，成纤维母细胞在转染表达Claudin-1和仅有ECL-2序列的Claudin-4后对CPE仍相当敏感；相反，仅表达Claudin-1的ECL-2序列和Claudin-4的成纤维细胞对CPE同样敏感，这高度提示CPE主要与Claudins蛋白的ECL-2结合而发挥作用。ECL-2有一个螺旋-转角-螺旋结构，该结构中间的天冬氨酸残基对与CPE结合起着非常重要的作用，而其残基上的亮氨酸残基可能参与结合过程[30]。
3 CPE在治疗恶性肿瘤中的应用
3.1 简介
大约85%的恶性肿瘤起源于上皮细胞，针对上皮细胞的靶向治疗受到重视。表达于肿瘤上皮顶端连接间的Claudins蛋白对限制肿瘤细胞的生长起着重要作用。Claudin-3、-4被证实为CPE受体，而这两种蛋白在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜浆乳癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞中高表达，这为这些肿瘤的治疗提供了新的靶点[2]。CPE与Claudin-3、-4受体结合后在5～15 min内可导致细胞肿胀溶解，这为CPE成为Claudins蛋白靶向化疗药物提供了可能。
3.2 CPE与卵巢癌
卵巢癌是最重大的妇科肿瘤之一。除小部分Ⅰ期肿瘤外，其5年生存率不足50%，而且大部分卵巢癌对现有化疗药物不敏感，因此，开发新的化疗药物显得尤为重要。有研究[31]证实，卵巢癌细胞高表达Claudin-3、-4，但在正常卵巢细胞中未检测到Claudins的表达。值得关注的是，对化疗药物抵抗的卵巢癌较敏感者其高表达Claudin-3、-4更明显，这为CPE靶向治疗卵巢癌提供了希望[32]。Santin等[33]成功使用CPE治疗了化疗抵抗的人卵巢癌动物模型，CPE对卵巢癌的细胞毒性呈剂量依赖，且CPE处理的细胞24 h后均死亡；化疗抵抗的卵巢癌异种移植动物模型中，腹腔内注射致死剂量（4～8.5 μg/mL）能显著抑制肿瘤的生长，延长了动物模型的生存时间。研究结果表明，CPE可能成为卵巢癌靶向治疗的新药物。
3.3 CPE与乳腺癌及子宫内膜浆乳癌
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，尽管他莫西芬和芳香酶抑制剂能显著延长早期乳腺癌患者的生存时间，但进展期乳腺癌和转移性乳腺癌仍然难以治愈。Claudin-3、-4在大部分原发乳腺癌及乳腺癌脑转移细胞中高表达，这也为乳腺癌治疗提供了新靶点。Kominsky等[34-35]在严重免疫缺陷的小鼠T47D细胞肿瘤动物模型瘤体内注射CPE，导致了肿瘤生长明显受抑和坏死，并且未引起副作用，但腹腔内注射却显示有毒性反应且对肿瘤生长没有影响；后来他们又发现CPE抑制了2只乳腺癌脑转移模型小鼠的肿瘤生长，延长了生存期，并且未引发明显的副作用和中枢神经系统毒性。这些研究表明，CPE可能对乳腺癌有效。
恶性程度很高的子宫内膜浆乳癌（USPC）同样高表达Claudin-3、-4。Santin等[36]证明了CPE对USPC细胞的杀伤作用呈剂量依赖性，对不表达Claudin-3、-4的细胞没有影响；瘤内注射CPE对USPC异种种植模型和腹腔内注射对化疗抵抗的USPC腹腔内种植模型的治疗均取得较好的效果。
3.4 CPE与胰腺癌及前列腺癌
胰腺癌因其较高的转移率及复发率被认为是最恶性的肿瘤之一。有研究[37]发现，CPE对大部分胰腺癌的裸鼠动物模型及体外肿瘤细胞均有较好的肿瘤抑制效应，CPE对胰腺癌细胞的毒性作用与剂量及Claudin-4表达水平密切相关；同时，TGF-β能抑制Claudin-4的表达及细胞对CPE的敏感性。在胰腺导管腺癌HPAC细胞的实验中，用siRNA抑制Claudin-4基因后，CPE的毒性明显降低，提示CPE对胰腺癌HPAC的毒性作用是因为其表达Claudin-4 [38]。
Long等[39]报道了前列腺癌及前列腺上皮内瘤变的上皮细胞均高表达Claudin-3、-4，从1例正在接受抗雄激素治疗的骨髓转移的前列腺癌患者身上获得的转移前列腺癌细胞同样高表达Claudin-3、-4，且对CPE的细胞毒作用有较好的敏感性。CPE对前列腺癌细胞的毒性作用不仅与Claudin-4有关，还与Claudin-4的细胞定位有关，例如在前列腺癌细胞PC3中，Claudin-4分布于整个细胞膜，而在正常前列腺上皮细胞PrEC中，Claudin-4仅分布在紧密连接处。实验证明[40]，CPE对PC3细胞有很好的细胞毒作用，而对PrEC细胞几乎无毒性，且在PC3异种移植的小鼠体内模型中，肿瘤周围注射CPE能明显抑制肿瘤的生长。因前列腺特异性抗原PSA具有蛋白水解作用，2014年Romanov等[41]设计了一个复合物，该复合物包含了一个能被PSA水解的位点和Claudin-3对接位点，将这个复合物连接在CPE的羧基端，获得一个新的复合物CPE-M，该复合物对能分泌PSA的细胞具有毒性作用，而对不分泌PSA的细胞几乎无毒性，这为克服CPE治疗前列腺癌的毒副作用提供了新的思路。
3.5 C-CPE与肿瘤治疗
因为Claudin-3,-4同样表达于肺、胃、小肠等正常组织如中，故CPE对正常组织也具有一定毒性，且CPE作为食物中毒的毒力因子和促炎因子，容易引起各种毒副作用，再加上CPE相关的食物传播疾病非常广发，许多人体内产生了针对CPE的抗体，虽然并没有证明这种抗体对CPE具有中和作用，但CPE已经被证明至少拥有一个中和抗原表位。这些都限制了CPE的临床使用。因此，为克服这些缺点，研究者[42]把CPE的N端毒性区域去掉，获得C端CPE即C-CPE，C-CPE虽然不能导致细胞死亡，但具有良好的靶向性和较小的抗原特性，且与Claudin-3、-4结合后能破坏紧密连接，提高细胞旁通透性，为化疗药物进入细胞提供了新的思路。
一些研究者将C-CPE用作化疗药物传递工具，取得较好的结果。Yuan等[8]用C-CPE与TNF-α结合，获得CPE-TNF，证实C-CPE-TNF在TNF含量较单独TNF低5倍情况下，对高表达Claudin-3、-4的卵巢癌细胞毒性大6.7倍左右，提示C-CPE-TNF可增加TNF疗效并降低TNF的副反应；Saeki等[9]用C-CPE融合从绿脓杆菌中提取出的蛋白合成抑制因子（PSIF）获得C-CPE-PSIF，并用于处理乳腺癌细胞株和乳腺癌小鼠模型瘤内注射，显示了C-CPE-PSIF对乳腺癌生长的显著抑制作用，且未引起明显的副作用。Kakutani等[43]发现，虽然20 μg/mL的白喉毒素（DAT）对过表达Claudin-4的L细胞无毒性，但利用白喉毒素A片段和C-CPE融合获得DAT-C-CPE，却在1 μg/mL时能杀伤L细胞，且DAT-C-CPE仅对过表达Claudin-4的细胞具有毒性，而对过表达Claudin-1、-2及-5的细胞无毒性，且用C-CPE预处理细胞后能能降低DAT-C-CPE毒性，这证明融合蛋白DAT-C-CPE的羧基端的确对Claudin-4具有靶向性。Gao等[44]报道了C-CPE还能增强紫杉醇和卡铂对乳腺癌细胞的毒性作用，在体内模型中，C-CPE和紫杉醇联合用药比单药效果好1.5倍左右；Li等[45]利用荧光染料CF-570标记C-CPE及变异C-CPE （用酪氨酸和亮氨酸分别替换第306和第315位点的丙氨酸），分别处理过表达Claudin-1、-2、-3、-4、-5的L细胞，证明了C-CPE对Claudin-3、-4的靶向作用以及第306及319位点的丙氨酸对C-CPE的靶向性的重要作用。
4 结语
总的说来，CPE在某些恶性肿瘤治疗的研究中取得一定的进展，但因其毒性作用限制了其临床试验。在去除其毒性区域后获得的C-CPE具有低毒性及很好的靶向作用，为临床治疗肿瘤提供了新的靶向工具。但是因其受体Claudins蛋白在部分正常组织中仍有一定表达，这就使得C-CPE的靶向药物仍存在一定毒副作用。如何更好地保护正常组织及找到一个新的能与其结合的化疗药物成为了新的挑战。
大约85%的恶性肿瘤来源于上皮细胞，上皮细胞间的紧密连接与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，肿瘤的发生往往伴随着紧密连接功能的降低及紧密连接蛋白表达的改变。Claudin-3、-4作为紧密连接结构的重要组成蛋白，在调节细胞旁渗透性及维持细胞极性中起着重要作用[1]。研究[2]发现，紧密连接蛋白Claudin-3、-4在多种肿瘤细胞中异常表达，因此，作为Claudin-3、-4的配体，产气荚膜梭菌肠毒素（CPE）成为了潜在的肿瘤靶向药物。体外研究[3]证实，CPE确有靶向作用，且CPE在动物皮下移植瘤模型中取得一定疗效，但是，因其较大的肠毒性等副作用限制了它的临床应用。近年，利用CPE的羧基端多肽片段（C-CPE）的靶向性，将其连上一个其他的具有抗肿瘤效应的分子，改造为一个毒副作用较低的靶向药物的研究取得了一定的进展[4]。现将CPE及C-CPE的一些研究进展综述如下。
1 CPE蛋白
1.1 CPE蛋白简介
产气荚膜梭菌是一种革兰阳性厌氧菌，人和牲畜均可作为宿主，主要经粪口传播，可引起气性坏疽、肠道感染等疾病。其分泌的外毒素是主要致病因子，根据其分泌的外毒素不同，将其分为5型（A～E），少部分（不到5%）A型产气荚膜梭菌在形成孢子时还会分泌另外一种外毒素称为产气荚膜梭菌肠毒素（CPE），CPE可引起肠上皮脱落、肠坏疽、肠液吸收障碍等胃肠道疾病，进而导致严重腹泻、腹痛性痉挛等临床症状，这种症状一般12～24 h内恢复，但对老年人或患有药物性便秘的人来说可导致死亡[5]。
1.2 CPE蛋白的结构
CPE由319个氨基酸组成，相对分子质量约为35×103，有3个功能结构区域，分别为区域Ⅰ，区域Ⅱ和区域Ⅲ。其中区域Ⅰ由C端125个氨基酸组成，是介导CPE靶向结合受体的区域；区域Ⅱ和区域Ⅲ称为N端，是CPE毒性区域，可与细胞膜上受体形成多蛋白复合物CH-1，并插入细胞膜形成活化孔，导致钙离子内流，引起细胞胀裂或caspase-3途径的细胞凋亡。在N端还有1个由37个氨基酸组成的未知结构区域，将这个区域去掉后会使得CPE毒性增强2～3倍，可能是由于该区域的去除暴露了区域Ⅱ，促进了CH-1的形成。因此，该区域可能对CPE的齐聚反应起到开关的作用[6]。
由于CPE毒副反应大，其安全剂量、有效剂量及致死剂量之间相差较小，因此，有人[7]将CPE的N端毒性区域去掉，以期利用CPE蛋白C端即C-CPE的靶向效果并取得了成功。C-CPE是CPE的194～319氨基酸残基片段，含有9条β链。C-CPE具有完整的Claudin蛋白靶向性，与某些细胞毒性药物如TNF-α、蛋白合成抑制因子（PSIF）等连接后仍有靶向性[8-9]，故其可作为一个潜在的肿瘤靶向工具。也有研究[3]表明，一定浓度的C-CPE可加强高表达Claudin蛋白的恶性肿瘤对某些化疗药物如紫杉醇、卡铂等的敏感性。
1.3 CPE的细胞毒性
当CPE与其受体结合后，在细胞膜上形成一个相对分子质量约90×103的小复合物，该小复合物对十二烷基硫酸钠（SDS）敏感，其包含了CPE、Claudin受体蛋白和Claudin非受体蛋白，非受体蛋白的作用可能是与其他Claudin蛋白相互作用。6个小复合物聚合形成1个大的对SDS抵抗复合物，称为CPE六聚体（CH-1）。CH-1是相对分子质量约450×103、同样含有CP6分子CPE、受体Claudins和非受体Claudins。CH-1在细胞膜上可形成前孔，37 ℃下可迅速插入细胞膜形成活性孔。活性孔将导致钙离子内流，当CPE剂量大时，在细胞膜上可形成多个CH-1，最终导致大量钙离子内流而造成细胞胀裂死亡，当CPE剂量小时，活化孔只有少量钙离子内流，最终引起经典的caspase-3途径的细胞凋亡[10]。
CPE膜孔的形成也会导致细胞形态学上的改变，使得细胞基底侧暴露出来，这将使得CPE形成另外一个大的复合物CH-2，它不仅含有CH-1的成分，还含有另外一种紧密连接蛋白occludin。CH-2将导致occludin的内化，同时，CPE处理过的细胞还会发生Claudin内化[11]。这种改变形成的机理尚不清楚，但这种效果可能是CPE破坏紧密连接的机理之一。
2 Claudin蛋白
2.1 Claudin蛋白简介
紧密连接是上皮细胞之间的重要结构，对维持上皮细胞的屏障功能及细胞旁渗透性起着非常重要的作用。在一些研究中，上皮细胞紧密连接的破坏和功能紊乱与肿瘤的发生密切相关[12]；紧密连接由多种蛋白如Claudins蛋白家族、occludin蛋白及连接黏附分子（JAMs） 3种完整的蛋白、闭合小蛋白（ZO-1、ZO-2）等，其中Claudins蛋白最为重要[13]。现在已经发现的Claudins蛋白家族成员有24个，相对分子质量在20×103～27×103之间，含有4个跨膜区域、2个胞外环（ECL-1和ECL-2）、1个胞质尾区及细胞内的氨基端和羧基端[14]。Claudins蛋白在不同组织中表达不一，主要分布于肺、胃、小肠等组织，对维持紧密连接的结构及功能、稳定细胞旁渗透性及细胞极性起着重要作用[15]。
2.2 Claudin蛋白与肿瘤
自Claudin蛋白被发现以来，越来越多的研究表明Claudin蛋白与肿瘤密切相关。1999年Swisshelm等[16]发现，乳腺癌细胞的Claudin-1 mRNA表达比正常乳腺上皮细胞减少；随后的研究[17]在至少12种肿瘤细胞中发现了Claudin表达的改变。Claudins蛋白在肿瘤细胞中表达改变的机理尚不清楚，但有研究[18-19]表明，一些细胞因子会影响Claudins的表达，如肝细胞生长因子和表皮生长因子降低Claudin-7的表达，但会增加Claudin-1、-3、-4的表达，TNF-α、TNF-β及IL-17会引起Claudin-1表达的增加等。另外，高表达Claudin-4的胰腺癌细胞表现出了较低的运动性及侵袭性，在小鼠体内模型试验中，高表达Claudin-4的胰腺癌发生肺转移的可能较低[20]；而Tsutsumi等[21]对100例胰腺导管腺癌的研究发现，高表达Claudin-4的患者比低表达者有更长的生存期；相反，高表达Claudin-3、-4的卵巢癌恶性程度更高，用siRNA抑制Claudin-3、-4后，卵巢癌的侵袭性受到了抑制。在结肠癌小鼠体内模型中，抑制Claudin-1基因及过表达试验均获得同样的结果[22-23]。
Claudin蛋白在胃癌的研究中越来越受到重视。Jung等[24]在对72例胃癌的研究中发现，73.6%的患者高表达Claudin-2，而仅44.4%的患者高表达Claudin-4；在劳伦分型的肠型腺癌的患者显著低表达Claudin-1；淋巴结转移阳性的患者显著低表达Claudin-3、-4，据此推测，Claudin-3、-4可能与胃癌的淋巴转移有关。Zhu等[25]发现仅15.9%的正常胃黏膜高表达Claudin-4，而90%以上的肠上皮化生及胃上皮异型增生患者高表达Claudin-4，而确诊为胃癌的患者约53.2%高表达Claudin-4，说明Claudin-4在胃癌及前期病变中异常表达。Mima等[26]发现，非甾体类抗炎药能通过增加人胃癌细胞的Ca2+内流而诱导Claudin-4表达，且高表达Claudin-4的胃癌细胞降低了细胞的迁移，在琼脂培养基中细胞群体的形成也受到抑制，而用干扰RNA抑制Claudin-4表达后，非甾体类抗炎药则不能抑制细胞迁移力。这些研究表明，Claudin蛋白的异常表达与胃癌的发生及生长密切相关。
2.3 Claudin蛋白与CPE
自从1997年Katahira等[27]发现本来对CPE抵抗的成纤维母细胞在转染表达Vero细胞中的一个相对分子质量为22×103的蛋白后变为对CPE敏感后，Claudins蛋白逐渐受到重视。有研究[28]表明，CPE能与Claudin-3、-4、-6、-8、-14结合，而未检测出Claudin-1、-2、-5、-10能作为CPE受体。相关研究[29]表明，成纤维母细胞在转染表达Claudin-1和仅有ECL-2序列的Claudin-4后对CPE仍相当敏感；相反，仅表达Claudin-1的ECL-2序列和Claudin-4的成纤维细胞对CPE同样敏感，这高度提示CPE主要与Claudins蛋白的ECL-2结合而发挥作用。ECL-2有一个螺旋-转角-螺旋结构，该结构中间的天冬氨酸残基对与CPE结合起着非常重要的作用，而其残基上的亮氨酸残基可能参与结合过程[30]。
3 CPE在治疗恶性肿瘤中的应用
3.1 简介
大约85%的恶性肿瘤起源于上皮细胞，针对上皮细胞的靶向治疗受到重视。表达于肿瘤上皮顶端连接间的Claudins蛋白对限制肿瘤细胞的生长起着重要作用。Claudin-3、-4被证实为CPE受体，而这两种蛋白在卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜浆乳癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤细胞中高表达，这为这些肿瘤的治疗提供了新的靶点[2]。CPE与Claudin-3、-4受体结合后在5～15 min内可导致细胞肿胀溶解，这为CPE成为Claudins蛋白靶向化疗药物提供了可能。
3.2 CPE与卵巢癌
卵巢癌是最重大的妇科肿瘤之一。除小部分Ⅰ期肿瘤外，其5年生存率不足50%，而且大部分卵巢癌对现有化疗药物不敏感，因此，开发新的化疗药物显得尤为重要。有研究[31]证实，卵巢癌细胞高表达Claudin-3、-4，但在正常卵巢细胞中未检测到Claudins的表达。值得关注的是，对化疗药物抵抗的卵巢癌较敏感者其高表达Claudin-3、-4更明显，这为CPE靶向治疗卵巢癌提供了希望[32]。Santin等[33]成功使用CPE治疗了化疗抵抗的人卵巢癌动物模型，CPE对卵巢癌的细胞毒性呈剂量依赖，且CPE处理的细胞24 h后均死亡；化疗抵抗的卵巢癌异种移植动物模型中，腹腔内注射致死剂量（4～8.5 μg/mL）能显著抑制肿瘤的生长，延长了动物模型的生存时间。研究结果表明，CPE可能成为卵巢癌靶向治疗的新药物。
3.3 CPE与乳腺癌及子宫内膜浆乳癌
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，尽管他莫西芬和芳香酶抑制剂能显著延长早期乳腺癌患者的生存时间，但进展期乳腺癌和转移性乳腺癌仍然难以治愈。Claudin-3、-4在大部分原发乳腺癌及乳腺癌脑转移细胞中高表达，这也为乳腺癌治疗提供了新靶点。Kominsky等[34-35]在严重免疫缺陷的小鼠T47D细胞肿瘤动物模型瘤体内注射CPE，导致了肿瘤生长明显受抑和坏死，并且未引起副作用，但腹腔内注射却显示有毒性反应且对肿瘤生长没有影响；后来他们又发现CPE抑制了2只乳腺癌脑转移模型小鼠的肿瘤生长，延长了生存期，并且未引发明显的副作用和中枢神经系统毒性。这些研究表明，CPE可能对乳腺癌有效。
恶性程度很高的子宫内膜浆乳癌（USPC）同样高表达Claudin-3、-4。Santin等[36]证明了CPE对USPC细胞的杀伤作用呈剂量依赖性，对不表达Claudin-3、-4的细胞没有影响；瘤内注射CPE对USPC异种种植模型和腹腔内注射对化疗抵抗的USPC腹腔内种植模型的治疗均取得较好的效果。
3.4 CPE与胰腺癌及前列腺癌
胰腺癌因其较高的转移率及复发率被认为是最恶性的肿瘤之一。有研究[37]发现，CPE对大部分胰腺癌的裸鼠动物模型及体外肿瘤细胞均有较好的肿瘤抑制效应，CPE对胰腺癌细胞的毒性作用与剂量及Claudin-4表达水平密切相关；同时，TGF-β能抑制Claudin-4的表达及细胞对CPE的敏感性。在胰腺导管腺癌HPAC细胞的实验中，用siRNA抑制Claudin-4基因后，CPE的毒性明显降低，提示CPE对胰腺癌HPAC的毒性作用是因为其表达Claudin-4 [38]。
Long等[39]报道了前列腺癌及前列腺上皮内瘤变的上皮细胞均高表达Claudin-3、-4，从1例正在接受抗雄激素治疗的骨髓转移的前列腺癌患者身上获得的转移前列腺癌细胞同样高表达Claudin-3、-4，且对CPE的细胞毒作用有较好的敏感性。CPE对前列腺癌细胞的毒性作用不仅与Claudin-4有关，还与Claudin-4的细胞定位有关，例如在前列腺癌细胞PC3中，Claudin-4分布于整个细胞膜，而在正常前列腺上皮细胞PrEC中，Claudin-4仅分布在紧密连接处。实验证明[40]，CPE对PC3细胞有很好的细胞毒作用，而对PrEC细胞几乎无毒性，且在PC3异种移植的小鼠体内模型中，肿瘤周围注射CPE能明显抑制肿瘤的生长。因前列腺特异性抗原PSA具有蛋白水解作用，2014年Romanov等[41]设计了一个复合物，该复合物包含了一个能被PSA水解的位点和Claudin-3对接位点，将这个复合物连接在CPE的羧基端，获得一个新的复合物CPE-M，该复合物对能分泌PSA的细胞具有毒性作用，而对不分泌PSA的细胞几乎无毒性，这为克服CPE治疗前列腺癌的毒副作用提供了新的思路。
3.5 C-CPE与肿瘤治疗
因为Claudin-3,-4同样表达于肺、胃、小肠等正常组织如中，故CPE对正常组织也具有一定毒性，且CPE作为食物中毒的毒力因子和促炎因子，容易引起各种毒副作用，再加上CPE相关的食物传播疾病非常广发，许多人体内产生了针对CPE的抗体，虽然并没有证明这种抗体对CPE具有中和作用，但CPE已经被证明至少拥有一个中和抗原表位。这些都限制了CPE的临床使用。因此，为克服这些缺点，研究者[42]把CPE的N端毒性区域去掉，获得C端CPE即C-CPE，C-CPE虽然不能导致细胞死亡，但具有良好的靶向性和较小的抗原特性，且与Claudin-3、-4结合后能破坏紧密连接，提高细胞旁通透性，为化疗药物进入细胞提供了新的思路。
一些研究者将C-CPE用作化疗药物传递工具，取得较好的结果。Yuan等[8]用C-CPE与TNF-α结合，获得CPE-TNF，证实C-CPE-TNF在TNF含量较单独TNF低5倍情况下，对高表达Claudin-3、-4的卵巢癌细胞毒性大6.7倍左右，提示C-CPE-TNF可增加TNF疗效并降低TNF的副反应；Saeki等[9]用C-CPE融合从绿脓杆菌中提取出的蛋白合成抑制因子（PSIF）获得C-CPE-PSIF，并用于处理乳腺癌细胞株和乳腺癌小鼠模型瘤内注射，显示了C-CPE-PSIF对乳腺癌生长的显著抑制作用，且未引起明显的副作用。Kakutani等[43]发现，虽然20 μg/mL的白喉毒素（DAT）对过表达Claudin-4的L细胞无毒性，但利用白喉毒素A片段和C-CPE融合获得DAT-C-CPE，却在1 μg/mL时能杀伤L细胞，且DAT-C-CPE仅对过表达Claudin-4的细胞具有毒性，而对过表达Claudin-1、-2及-5的细胞无毒性，且用C-CPE预处理细胞后能能降低DAT-C-CPE毒性，这证明融合蛋白DAT-C-CPE的羧基端的确对Claudin-4具有靶向性。Gao等[44]报道了C-CPE还能增强紫杉醇和卡铂对乳腺癌细胞的毒性作用，在体内模型中，C-CPE和紫杉醇联合用药比单药效果好1.5倍左右；Li等[45]利用荧光染料CF-570标记C-CPE及变异C-CPE （用酪氨酸和亮氨酸分别替换第306和第315位点的丙氨酸），分别处理过表达Claudin-1、-2、-3、-4、-5的L细胞，证明了C-CPE对Claudin-3、-4的靶向作用以及第306及319位点的丙氨酸对C-CPE的靶向性的重要作用。
4 结语
总的说来，CPE在某些恶性肿瘤治疗的研究中取得一定的进展，但因其毒性作用限制了其临床试验。在去除其毒性区域后获得的C-CPE具有低毒性及很好的靶向作用，为临床治疗肿瘤提供了新的靶向工具。但是因其受体Claudins蛋白在部分正常组织中仍有一定表达，这就使得C-CPE的靶向药物仍存在一定毒副作用。如何更好地保护正常组织及找到一个新的能与其结合的化疗药物成为了新的挑战。