引用本文： 杨婷, 王凯峰, 孙瑶, 刘彦辉, 王瀚锐, 范东旭, 金松, 窦鹏挥, 刘彦东. 血管内皮生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生机制的研究. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(8): 917-921. doi: 10.7507/1007-9424.20150239 复制
下肢动脉疾病是外科常见的致残性疾病，静息痛、皮肤溃疡或坏疽是下肢缺血性疾病典型的临床表现，以高发生率、高截肢率和高死亡率而严重影响着人们的生活质量[1-3]。目前针对下肢动脉疾病的主要治疗手段是药物、外科手术、腔内介入治疗等[4-5]。但是对于远端流出道严重狭窄的患者往往失去手术机会，目前还缺乏令人满意的治疗方法。本研究以大鼠后肢动脉闭塞模型来研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）联合碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）协同促进血管再生的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SPF级雄性SD大鼠，购自大连医科大学动物实验中心，60只，3个月龄，体质量（260±30）g。按随机数字表法分为4组分别进行治疗：生理盐水组（NS组）、bFGF组、VEGF组及VEGF+bFGF组。
1.2 主要试剂和仪器
氯胺酮、4.0%甲醛，福州迈新公司产品；重组人VEGF（rhVEGF）、重组人bFGF（rhbFGF），美国Sigma公司；电生理压力测定仪、高速冷冻离心机，上海精密仪器仪表公司；PRISM 5700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪和SYBR Green PCR Master Mix，美国应用生物系统公司；DU-600紫外分光光度计和全自动凝胶电泳图像分析系统，日本Olympus公司；Mini-Protean 3电泳系统和Mini Trans-Blot转移系统，北航图像中心；体式手术显微镜及显微手术器械、TS-2000型脱色摇床，江苏太仓实验设备厂；蛋白浓度测定试剂、Trizol试剂、Fermentas K1622逆转录试剂、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺、甘氨酸、β-actin兔抗鼠单克隆抗体，美国Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。
1.3 动物模型建立
用氯胺酮（50 mg/kg）肌肉注射麻醉，待大鼠麻醉后，固定于手术台上。剪去后肢大腿及腹股沟部的毛，皮肤用强力碘和75%乙醇消毒，于双侧腹股沟处取一1 cm切口，在体式显微镜下钝性分离包裹股静脉、股动脉和股神经的动脉鞘。股动脉是淡红色的，在内侧；股静脉颜色略深，居中间；最外侧是股神经。利用显微操作系统结扎并切断股动脉各分支，将股动脉远端近腘窝处连接电生理压力测定仪测其内压，在股动脉中下1/3处结扎使其内压降至原内压的1/5，查无出血点，缝合。
1.4 给药方式
NS组、VEGF组隔天1次于腹腔内分别注射生理盐水1 mL、100μg/L rhVEGF 1 mL；bFGF组隔天1次在后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL；VEGF+bFGF组隔天1次于腹腔内注射100μg/L rhVEGF 1 mL+后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL，共治疗21 d。
1.5 股动脉造影
饲养至第30 d时，各大鼠肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后固定于鼠板；常规术前准备，取下腹部正中切口5～7 cm，找到腹主动脉（肾动脉以下段）并剥离约2 cm，用5号头皮针刺入，置于X光机下，加压快速推入65%复方泛影葡胺6～10 mL拍片。
1.6 实验取材
所有大鼠饲养至第3个月时将大鼠过量麻醉处死，取后肢股内侧肌肉组织，PBS清洗，贴好标签，冻存于-80℃冰箱中，用于Western blot和RT-PCR实验检测。
1.7 Western blot法检测VEGF、bFGF蛋白表达情况
用RIPA裂解液进行蛋白质样本制备，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，电化学发光免疫测定及图像采集和Quantity One 4.5软件半定量分析；以β-actin为内参进行数据标准化，以NS组为参照样本，计算VEGF、bFGF蛋白的相对表达水平，实验重复4次。
1.8 RT-PCR法检测VEGF、bFGF mRNA表达情况
将大鼠组织匀浆、分离、离心，Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计检测mRNA纯度并计算其浓度，以大鼠β-actin为内参，所有操作严格按照试剂盒说明书完成。RT-PCR扩增条件：95℃预变性35 s，然后95℃退火5 s，60℃延伸40 s，共35个循环。从GenBank上查得大鼠VEGF、bFGF和内参基因β-actin的基因序列全长，根据序列全长设计PCR引物，选用RT-PCR测试VEGF、bFGF mRNA的表达，β-actin作为内对照，设计引物如下：VEGF引物的上游为5׳-TCATCAGACTGTGCCTCAG-3׳，下游为5׳-CACAGTAACAACGCTGGAAT-3׳，片段大小486 bp，TaqMan探针为5׳-CTAAGCTCCGTACACCATGTC-C-3׳；bFGF引物的上游为5׳-AACTGCAGATGCCA-GCCGGGAGCATC-3׳, 下游为5׳-ACGCGTCGACTA-AGCTCTTAGCAGACA-3׳，片段大小136 bp，TaqMan探针为5׳-CATCTGCCATGTAAGCTAAGCA-3׳；β-actin引物的上游为5׳-GAAGATCAAGATCATTG-CTCCT-3׳，下游为5׳-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3׳，片段大小111 bp，TaqMan探针为5׳-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3׳。反应结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后以凝胶成像系统成像，并采用Quantity One 4.5软件进行扫描半定量分析，以所测得样品光密度积分与β-actin光密度积分的比值为样本半定量值，实验重复4次。
1.9 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量数据用均数±标准差（
2 结果
2.1 股动脉造影检查结果
股动脉造影结果显示，各X射线片均显示股动脉连续性中断，远端股动脉均显影，并出现不同数量的侧支循环血管（图 1～4）。VEGF+bFGF组侧支血管新生数为（10.25±1.006）条，明显高于bFGF组的（6.29±0.957）条（P < 0.05）、VEGF组的（6.49±0.978）条（P < 0.05）及NS组的（4.15±0.876）条（P < 0.001），bFGF组和VEGF组也明显高于NS组（P < 0.05），bFGF组和VEGF组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图1
VEGF+bFGF组，密集的新生血管，呈网状，分别连接在中断的股动脉之间 图 2 VEGF组，较密集紊乱的新生血管 图 3 bFGF组，较密集紊乱的新生血管 图 4 NS组，少量的新生血管
2.2 Western blot检测结果
Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的定性结果见图 5，半定量结果见图 6。从图 6可见，VEGF和bFGF蛋白表达在VEGF+bFGF组均明显高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001）；VEGF组和bFGF组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图5
Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的定性结果 图 6 Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的半定量结果。6A：VEGF；6B：bFGF。与NS组、VEGF组及bFGF组比较，*P < 0.001
2.3 RT-PCR检测结果
RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的定性结果见图 7，半定量结果见图 8。VEGF和bFGF mRNA表达在VEGF+bFGF组明显高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001）；VEGF组和bFGF组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图7
RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的定性结果 图 8 RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的半定量结果。8A：VEGF；8B：bFGF。与NS、VEGF组及bFGF组比较，* P < 0.001
3 讨论
近年来，下肢动脉疾病的治疗主要包括手术治疗（动脉旁路转流术[6]、大隐静脉旁路转流术、动静脉转流术等）、腔内介入治疗[7-8]（包括经皮腔内血管成形术、支架置入术等）和非手术治疗（干细胞治疗[9-10]、药物治疗等），但均存在治疗后再闭塞的问题[11]，尤其是对于远端血管无流出道、多节段、长段闭塞、严重狭窄、膝下小动脉病变的患者尚无确切的治疗方法；而非手术治疗所用的药物（抗凝、扩张血管、溶栓等药物）效果均不理想。通过各种方法或手段促进缺血肢体新生血管生成和侧支循环的建立，可能是治疗此类患者有效的方法之一。
由于动脉狭窄或闭塞而引起组织、器官处于缺血状态，机体会形成代偿性的侧支血管，此为生理性的血管新生[12]。血管新生疗法[13]是指通过应用外源性血管生长因子，如VEGF、bFGF等或其基因，以促进缺血组织内血管新生和侧支血管的形成，使缺血组织的缺血状态获得改善的治疗方法。初步实验[14-18]结果显示，VEGF及bFGF可刺激新生血管的生成，但到目前为止还缺少大宗安慰剂对照、双盲、大样本病例的临床研究。
bFGF和VEGF及其受体在正常肌肉及血管壁中极少表达或不表达；在缺血和缺氧下能促进其表达的增强，使局部内源性bFGF和VEGF表达增加，促进血管再生以适应缺血的变化，但非常缓慢，而且bFGF和VEGF增加的量不足且时间短暂，不能促使足够的血管新生以改善缺血状态[19-20]。因此，在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量，将会加快血管新生的速度和加大血管新生的幅度，这可能成为一条新的治疗缺血性疾病的途径[21-22]。随着rhbFGF和rhVEGF的出现，应用rhbFGF和rhVEGF治疗下肢缺血性疾病更安全可靠。
在新的侧支循环生长过程中bFGF对血管平滑肌的刺激作用强于VEGF，且bFGF有强烈的促进动脉生成的作用[23]。有研究[24-27]表明，动脉多次给予bFGF蛋白和静脉多次给予bFGF蛋白均能促进血管新生，改善组织缺血状态，且动脉给药优于静脉给药。
本实验在建立大鼠后肢动脉闭塞模型基础上，采用安慰剂生理盐水对照、双盲法证明VEGF和bFGF联合应用能促进大鼠缺血后肢侧支血管新生，缺血状态得到改善；血管造影显示VEGF+bFGF组X射线片上均出现密集的新生血管，呈网状，分别连接在中断的股动脉之间；VEGF组、bFGF组显示较密集紊乱的新生血管；NS组少量的侧支血管；Western blot和RT-PCR结果均显示，VEGF和bFGF蛋白和mRNA表达在VEGF+bFGF组均显著高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001），VEGF组和bFGF组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。本实验结果提示，应用外源性rhbFGF和rhVEGF蛋白可加快缺血组织内血管内皮细胞增殖，同时提高血管通透性和改变细胞外基质，从而促进血管的增殖，加快缺血组织内毛细血管的新生速度。
总之，VEGF和bFGF联合应用能有效促进大鼠缺血后肢侧支血管新生，为临床治疗下肢动脉疾病提供一种可能的新方法。
下肢动脉疾病是外科常见的致残性疾病，静息痛、皮肤溃疡或坏疽是下肢缺血性疾病典型的临床表现，以高发生率、高截肢率和高死亡率而严重影响着人们的生活质量[1-3]。目前针对下肢动脉疾病的主要治疗手段是药物、外科手术、腔内介入治疗等[4-5]。但是对于远端流出道严重狭窄的患者往往失去手术机会，目前还缺乏令人满意的治疗方法。本研究以大鼠后肢动脉闭塞模型来研究血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）联合碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）协同促进血管再生的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
SPF级雄性SD大鼠，购自大连医科大学动物实验中心，60只，3个月龄，体质量（260±30）g。按随机数字表法分为4组分别进行治疗：生理盐水组（NS组）、bFGF组、VEGF组及VEGF+bFGF组。
1.2 主要试剂和仪器
氯胺酮、4.0%甲醛，福州迈新公司产品；重组人VEGF（rhVEGF）、重组人bFGF（rhbFGF），美国Sigma公司；电生理压力测定仪、高速冷冻离心机，上海精密仪器仪表公司；PRISM 5700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪和SYBR Green PCR Master Mix，美国应用生物系统公司；DU-600紫外分光光度计和全自动凝胶电泳图像分析系统，日本Olympus公司；Mini-Protean 3电泳系统和Mini Trans-Blot转移系统，北航图像中心；体式手术显微镜及显微手术器械、TS-2000型脱色摇床，江苏太仓实验设备厂；蛋白浓度测定试剂、Trizol试剂、Fermentas K1622逆转录试剂、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸钠、丙烯酰胺、甘氨酸、β-actin兔抗鼠单克隆抗体，美国Sigma公司；其他试剂为国产分析纯。
1.3 动物模型建立
用氯胺酮（50 mg/kg）肌肉注射麻醉，待大鼠麻醉后，固定于手术台上。剪去后肢大腿及腹股沟部的毛，皮肤用强力碘和75%乙醇消毒，于双侧腹股沟处取一1 cm切口，在体式显微镜下钝性分离包裹股静脉、股动脉和股神经的动脉鞘。股动脉是淡红色的，在内侧；股静脉颜色略深，居中间；最外侧是股神经。利用显微操作系统结扎并切断股动脉各分支，将股动脉远端近腘窝处连接电生理压力测定仪测其内压，在股动脉中下1/3处结扎使其内压降至原内压的1/5，查无出血点，缝合。
1.4 给药方式
NS组、VEGF组隔天1次于腹腔内分别注射生理盐水1 mL、100μg/L rhVEGF 1 mL；bFGF组隔天1次在后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL；VEGF+bFGF组隔天1次于腹腔内注射100μg/L rhVEGF 1 mL+后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhbFGF 1 mL，共治疗21 d。
1.5 股动脉造影
饲养至第30 d时，各大鼠肌肉注射氯胺酮（50 mg/kg）麻醉成功后固定于鼠板；常规术前准备，取下腹部正中切口5～7 cm，找到腹主动脉（肾动脉以下段）并剥离约2 cm，用5号头皮针刺入，置于X光机下，加压快速推入65%复方泛影葡胺6～10 mL拍片。
1.6 实验取材
所有大鼠饲养至第3个月时将大鼠过量麻醉处死，取后肢股内侧肌肉组织，PBS清洗，贴好标签，冻存于-80℃冰箱中，用于Western blot和RT-PCR实验检测。
1.7 Western blot法检测VEGF、bFGF蛋白表达情况
用RIPA裂解液进行蛋白质样本制备，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行总蛋白定量，配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样，电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，电化学发光免疫测定及图像采集和Quantity One 4.5软件半定量分析；以β-actin为内参进行数据标准化，以NS组为参照样本，计算VEGF、bFGF蛋白的相对表达水平，实验重复4次。
1.8 RT-PCR法检测VEGF、bFGF mRNA表达情况
将大鼠组织匀浆、分离、离心，Trizol一步法提取总RNA，紫外分光光度计检测mRNA纯度并计算其浓度，以大鼠β-actin为内参，所有操作严格按照试剂盒说明书完成。RT-PCR扩增条件：95℃预变性35 s，然后95℃退火5 s，60℃延伸40 s，共35个循环。从GenBank上查得大鼠VEGF、bFGF和内参基因β-actin的基因序列全长，根据序列全长设计PCR引物，选用RT-PCR测试VEGF、bFGF mRNA的表达，β-actin作为内对照，设计引物如下：VEGF引物的上游为5׳-TCATCAGACTGTGCCTCAG-3׳，下游为5׳-CACAGTAACAACGCTGGAAT-3׳，片段大小486 bp，TaqMan探针为5׳-CTAAGCTCCGTACACCATGTC-C-3׳；bFGF引物的上游为5׳-AACTGCAGATGCCA-GCCGGGAGCATC-3׳, 下游为5׳-ACGCGTCGACTA-AGCTCTTAGCAGACA-3׳，片段大小136 bp，TaqMan探针为5׳-CATCTGCCATGTAAGCTAAGCA-3׳；β-actin引物的上游为5׳-GAAGATCAAGATCATTG-CTCCT-3׳，下游为5׳-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3׳，片段大小111 bp，TaqMan探针为5׳-CTGTCCACCTTCCAGCAGA-3׳。反应结束后，取5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后以凝胶成像系统成像，并采用Quantity One 4.5软件进行扫描半定量分析，以所测得样品光密度积分与β-actin光密度积分的比值为样本半定量值，实验重复4次。
1.9 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量数据用均数±标准差（
2 结果
2.1 股动脉造影检查结果
股动脉造影结果显示，各X射线片均显示股动脉连续性中断，远端股动脉均显影，并出现不同数量的侧支循环血管（图 1～4）。VEGF+bFGF组侧支血管新生数为（10.25±1.006）条，明显高于bFGF组的（6.29±0.957）条（P < 0.05）、VEGF组的（6.49±0.978）条（P < 0.05）及NS组的（4.15±0.876）条（P < 0.001），bFGF组和VEGF组也明显高于NS组（P < 0.05），bFGF组和VEGF组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图1
VEGF+bFGF组，密集的新生血管，呈网状，分别连接在中断的股动脉之间 图 2 VEGF组，较密集紊乱的新生血管 图 3 bFGF组，较密集紊乱的新生血管 图 4 NS组，少量的新生血管
2.2 Western blot检测结果
Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的定性结果见图 5，半定量结果见图 6。从图 6可见，VEGF和bFGF蛋白表达在VEGF+bFGF组均明显高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001）；VEGF组和bFGF组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图5
Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的定性结果 图 6 Western blot检测VEGF和bFGF蛋白表达的半定量结果。6A：VEGF；6B：bFGF。与NS组、VEGF组及bFGF组比较，*P < 0.001
2.3 RT-PCR检测结果
RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的定性结果见图 7，半定量结果见图 8。VEGF和bFGF mRNA表达在VEGF+bFGF组明显高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001）；VEGF组和bFGF组组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图7
RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的定性结果 图 8 RT-PCR检测VEGF和bFGF mRNA表达的半定量结果。8A：VEGF；8B：bFGF。与NS、VEGF组及bFGF组比较，* P < 0.001
3 讨论
近年来，下肢动脉疾病的治疗主要包括手术治疗（动脉旁路转流术[6]、大隐静脉旁路转流术、动静脉转流术等）、腔内介入治疗[7-8]（包括经皮腔内血管成形术、支架置入术等）和非手术治疗（干细胞治疗[9-10]、药物治疗等），但均存在治疗后再闭塞的问题[11]，尤其是对于远端血管无流出道、多节段、长段闭塞、严重狭窄、膝下小动脉病变的患者尚无确切的治疗方法；而非手术治疗所用的药物（抗凝、扩张血管、溶栓等药物）效果均不理想。通过各种方法或手段促进缺血肢体新生血管生成和侧支循环的建立，可能是治疗此类患者有效的方法之一。
由于动脉狭窄或闭塞而引起组织、器官处于缺血状态，机体会形成代偿性的侧支血管，此为生理性的血管新生[12]。血管新生疗法[13]是指通过应用外源性血管生长因子，如VEGF、bFGF等或其基因，以促进缺血组织内血管新生和侧支血管的形成，使缺血组织的缺血状态获得改善的治疗方法。初步实验[14-18]结果显示，VEGF及bFGF可刺激新生血管的生成，但到目前为止还缺少大宗安慰剂对照、双盲、大样本病例的临床研究。
bFGF和VEGF及其受体在正常肌肉及血管壁中极少表达或不表达；在缺血和缺氧下能促进其表达的增强，使局部内源性bFGF和VEGF表达增加，促进血管再生以适应缺血的变化，但非常缓慢，而且bFGF和VEGF增加的量不足且时间短暂，不能促使足够的血管新生以改善缺血状态[19-20]。因此，在缺血组织内适时适量地增加局部外源性bFGF和VEGF的量，将会加快血管新生的速度和加大血管新生的幅度，这可能成为一条新的治疗缺血性疾病的途径[21-22]。随着rhbFGF和rhVEGF的出现，应用rhbFGF和rhVEGF治疗下肢缺血性疾病更安全可靠。
在新的侧支循环生长过程中bFGF对血管平滑肌的刺激作用强于VEGF，且bFGF有强烈的促进动脉生成的作用[23]。有研究[24-27]表明，动脉多次给予bFGF蛋白和静脉多次给予bFGF蛋白均能促进血管新生，改善组织缺血状态，且动脉给药优于静脉给药。
本实验在建立大鼠后肢动脉闭塞模型基础上，采用安慰剂生理盐水对照、双盲法证明VEGF和bFGF联合应用能促进大鼠缺血后肢侧支血管新生，缺血状态得到改善；血管造影显示VEGF+bFGF组X射线片上均出现密集的新生血管，呈网状，分别连接在中断的股动脉之间；VEGF组、bFGF组显示较密集紊乱的新生血管；NS组少量的侧支血管；Western blot和RT-PCR结果均显示，VEGF和bFGF蛋白和mRNA表达在VEGF+bFGF组均显著高于NS组（P < 0.001），且明显高于VEGF组（P < 0.001）和bFGF组（P < 0.001），VEGF组和bFGF组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。本实验结果提示，应用外源性rhbFGF和rhVEGF蛋白可加快缺血组织内血管内皮细胞增殖，同时提高血管通透性和改变细胞外基质，从而促进血管的增殖，加快缺血组织内毛细血管的新生速度。
总之，VEGF和bFGF联合应用能有效促进大鼠缺血后肢侧支血管新生，为临床治疗下肢动脉疾病提供一种可能的新方法。
