引用本文： 周培华, 孙学军, 郑见宝, 王炜, 王孝珑, 陈南征, 魏光兵, 范渊, 李孝彬, 王训凯, 禄韶英. 5HRE联合CEAp靶向调控RASSF1A基因对SGC7901胃癌细胞株抑制作用的研究. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(10): 1201-1208. doi: 10.7507/1007-9424.20150312 复制
胃癌是全世界常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康[1-2]。虽然手术、放疗、化疗等传统治疗胃癌的方法取得了一定的进展，但是其预后仍然不理想。肿瘤的基因治疗成为有希望治愈恶性肿瘤的新方法，目前已取得一些进展，但是其靶向性、治疗基因表达的持久性及载体的安全性一直是肿瘤基因治疗面临的困难[3]。本实验构建了5拷贝低氧反应元件（5HRE）联合癌胚抗原启动子（CEAp）双靶向调控元件和调控RAS相关区域家族1A（RASSF1A）基因表达的慢病毒载体，以初步研究其对癌胚抗原（CEA）表达阳性胃癌细胞的靶向性及有效性。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂和设备
前期本课题组[4-5]已构建并保存携带5HRE及CEAp DNA片段的载体，RASSF1A基因片段及慢病毒载体均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，胃腺癌细胞株SGC7901、MKN28及乳腺正常腺上皮细胞株MCF-10A均购自中科院上海细胞库，限制性内切酶、T4DNA连接酶、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、Premix TaqTM试剂盒及RNA逆转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司，细胞活性检测试剂盒-8（CCK-8）购自日本同仁化学研究所，DNA Marker和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，萤光素酶报告基因载体pGL4.20、pGL4.74及双萤光素酶检测试剂盒Dual-Glo®LuciferaseAssay System均购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，细胞培养基RPMI 1640和DMEM/F12均购自美国CORNING公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司，鼠抗人RASSF1A单克隆抗体购自美国eBioscience公司，辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗购自Pierce公司，兔抗人CEA多克隆抗体购自美国Proteintech公司，HRP标记的β-actin单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，细胞免疫组织化学SP法检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CoCl2购自美国SIGMA-ALDRICH公司，TurboFect转染试剂和显影剂SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate均购自美国Thermo公司。引物均由上海生工生物有限公司合成，测序由华大科技公司完成。设备主要包括CFX96TM real-time PCR Detection System qPCR仪（美国伯乐公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和细胞悬液制备
SGC7901和MKN28细胞株均在含10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100μ/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养，MCF-10A细胞株在含15%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素、10μg/mL胰岛素及20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基中培养。所有细胞株均在37℃、含5% CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，每2～3天换液1次。细胞悬液制备：采用90 mm培养皿培养细胞至指数增殖期时，以磷酸缓冲盐溶液（PBS）换液，再以0.25%胰酶消化液消化至贴壁细胞呈圆形时，用含血清的细胞培养基终止消化并吹打细胞呈单细胞悬液，离心（800 r/min，r=10 cm，5 min）后，以PBS液洗细胞1遍，再以同样条件离心。计数细胞后，稀释至1×105个/mL，根据不同的实验目的，稀释细胞至不同的密度再接种至细胞培养板。
1.2.2 CEA及RASSF1A表达的检测
①采用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）法检测3种细胞株中CEA mRNA的表达水平。通过RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒提取细胞的总RNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。按逆转录说明书操作获得cDNA（使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，体系如下：5×PrimeScript Buffer 10μL、总RNA 10μL及RNase Free ddH2O 30μL，共50μL），进行qPCR扩增。qPCR扩增采用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，反应体系如下：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游混合引物（20μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 11.0μL，共25μL；扩增条件为：94℃变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，35个循环。CEA引物序列（GenBank®/EMBL提取号码：NM_004363.2）和β-actin（GenBank®/EMBL提取号码：NM_001101.3）引物序列见表 1，以β-actin为内参。CEA mRNA的表达水平通过2-ΔΔCt方法计算。每个反应设3个复孔，重复实验3次，取均值。②采用细胞免疫组织化学SP法检测3种细胞株中CEA的表达水平。将细胞接种于24孔细胞培养板中，接种密度为5×104个/mL，每孔500μL；3 d后用PBS溶液清洗细胞3次，每次10 min；以4%多聚甲醛固定30 min后按说明书行SP法免疫组织化学染色。以PBS溶液代替一抗作为阴性对照，DAB显色时间为2 min。当阴性对照结果为阴性时，视检测结果可信。CEA蛋白的阳性表达主要定位在细胞的细胞膜和细胞浆中，以出现棕黄色颗粒为阳性。用Nikon倒置显微镜通过Nikon数码相机和NIS-Elements D采图软件在20倍物镜下按照同一采集参数拍摄，每孔细胞样品随机截取5个不同的阳性部位采集图像（200倍），其测量均值代表该孔细胞测量值。用Image Pro Plus 6图像分析软件随机选取每张图像中的阳性细胞簇作为测量区域（area of interesting，AOI），测量该区域的面积。在该区域内通过分色工具测量棕黄色颗粒的积分光密度（integrated option density，IOD），计算平均密度（mean density，MD）。MD=IOD/AOI的面积。MD值代每个单位面积的染色强度，可以较准确地反映阳性产物的浓度。每种细胞设3个复孔，重复实验3次，取均值。③通过Western blot法[6]检测3种细胞株中RASSF1A蛋白的表达水平（因条带结果较明显，故未定量），以β-actin作为内参。每种细胞设3个复孔，重复实验3次，取均值。
表1
引物序列
1.2.3 载体构建
①萤光素酶报告基因载体pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc的构建。以载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM为模板，采用PCR法扩增CEAp和5HRE-CEAp片段（引物序列见表 1）。反应体系：Premix TaqTM 25μL、cDNA 2μL、混合引物（20μmol/L）1μL、ddH2O 22μL，共50μL。PCR反应条件：94℃变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸7 min。片段经过琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，通过分子克隆技术将各片段分别插入pGL4.20多克隆位点（操作按试剂盒说明书进行），构建pGL-4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc载体。②慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A的构建。首先通过PCR法扩增RASSF1A基因片段（引物序列见表 1），通过分子克隆技术将5HRE-CEAp片段与RASSF1A片段连接并插入慢病毒载体的多克隆位点（操作按试剂盒说明书进行）。将构建的载体送华大科技公司测序验证。
1.2.4 双萤光素酶报告基因实验
以含有萤火虫萤光素酶报告基因的无启动子载体pGL4.20作为阴性对照，以含有海肾萤光素酶报告基因的载体pGL4.74作为共转染表达载体〔该载体含单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（HSV-TKp）〕，以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc载体作为实验对象。各载体结构见图 1。首先开展CoCl2的浓度梯度和时间梯度实验，选择最佳作用浓度和最佳作用时间（作用细胞为SGC7901细胞株）。在浓度梯度实验中，以不同浓度的CoCl2（0、100、200、300、400及500μmol/L）作用12 h，结果300μmol/L的活性倍数最高；在时间梯度实验中，以固定浓度的CoCl2（200μmol/L）作用不同时间（0、4、8、12、24及48 h），结果作用24 h的活性倍数最高。再取对数生长期的细胞株，以5×103个/孔接种于96孔板中，待细胞融合度达70%时，将载体pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc（3种细胞株）、pGL4.20-CEAp-Luc（仅转染SGC7901细胞株）及pGL4.20（3种细胞株）分别与pGL4.74（30 ng）共转染细胞（操作按试剂盒说明书进行，载体均为200 ng）。24 h后更换培养基并按设计加（缺氧组）或不加CoCl2（常氧组），CoCl2浓度为200μmol/L（预实验发现300μmol/L的CoCl2可导致较多的细胞死亡，所以最终选择200μmol/L），作用时长为24 h。活性倍数的检测：终止培养后，按照Dual-Glo®Luciferase Assay System试剂盒说明书操作，在酶标仪（510 nm）上检测萤光素酶活性。为便于比较不同组启动子的启动活性，其结果使用活性倍数进行比较。活性倍数=样本活性比值（萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性）/阴性对照活性比值（萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性）。
图1
双萤光素酶报告基因实验载体的结构示意图。hRluc：海肾萤光素酶报告基因；Luc：萤火虫萤光素酶基因
1.2.5 细胞感染
重组慢病毒载体（pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A）及相应空病毒载体均由吉凯公司包装成病毒颗粒LV-5HC-RASSF1A（感染组）和LV-NC（阴性对照组）。取对数生长期的SGC7901及MKN28细胞，以1×105个/孔接种于96孔板中，培养24 h后感染病毒〔感染复数（MOI）为10〕，操作按试剂盒说明书进行。以未感染任何病毒的细胞作为空白对照组。48 h后根据设计需要加（缺氧组）或不加CoCl2（常氧组），浓度为300μmol/L，作用24 h。每组设3个复孔。在培养24 h后，检测细胞生长抑制率（操作按CCK-8检测试剂盒说明书进行），在酶标仪（450 nm波长）上检测吸光度值（A值）。抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%，其中对照组为不做任何处理的SGC7901及MKN28细胞，实验组为加或不加CoCl2的细胞（感染或未感染病毒颗粒）。同时采用Western blot法检测细胞中RASSF1A蛋白的表达水平（方法同上）。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所得实验结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 内源性CEA和RASSF1A的表达结果
qRT-PCR结果显示，SGC7901细胞株中CEA mRNA的表达水平高于MKN28及MCF-10A细胞株（P < 0.05），而MKN28及MCF-10A细胞株间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2。免疫组织化学染色结果显示：CEA的表达水平在SGC7901、MKN28及MCF-10A细胞株中依次递减，两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 3和图 4。Western blot结果显示，在SGC7901及MKN28细胞株中均未检测到RASSF1A蛋白的电泳条带，而在MCF-10A细胞株中可检测到（图 5）。依据该结果，本实验确定SGC7901细胞株为实验细胞（CEA mRNA表达阳性，RASSF1A蛋白表达阴性），MKN28细胞株为阴性对照细胞（CEA mRNA表达阴性，RASSF1A蛋白表达阴性）。
图2
示3种细胞株中CEA mRNA表达水平检测结果。与MKN28和MCF-10A细胞株比较，* P < 0.05 图 3 示3种细胞株中CEA蛋白表达水平检测结果。与SGC7901细胞株比较，* P < 0.05；与MKN28细胞株比较，# P < 0.05 图 4 示3种细胞株中CEA的免疫组织化学染色结果（SP×200）。4A：SGC7901细胞株；4B：MKN28细胞株；4C：MCF-10A细胞株 图 5 示RASSF1A蛋白的电泳结果。1：SGC7901细胞株；2：MKN28细胞株；3：MCF-10A细胞株
2.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A载体构建
构建的pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A载体经测序均构建成功。
2.3 梯度试验和双萤光素酶报告基因实验结果
2.3.1 以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc转染SGC7901细胞株后，CoCl2不同作用浓度和不同作用时间的活性倍数结果
在300μmol/L以下，随CoCl2浓度升高，活性倍数相应升高；而在300μmol/L以上，随着CoCl2浓度升高，活性倍数下降，见6A。24 h之前，随着CoCl2作用时间延长，活性倍数相应升高；24 h之后，活性倍数开始下降，见6B。由此确定了300μmol/L为CoCl2的最优浓度，24 h为其最优作用时间。
2.3.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在SGC7901、MKN28及MCF-10A细胞株中的启动活性
双萤光素酶报告基因实验结果显示，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，在SGC7901细胞株及MKN28细胞株中，同种细胞株内与常氧组比较，缺氧组细胞的活性倍数均升高（P < 0.01）；而在MCF-10A细胞株中，常氧组和缺氧组细胞的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 7。在不加入CoCl2条件下，与SGC7901细胞株比较，MKN28及MCF-10A细胞株的活性倍数均较低（P < 0.05）；与MKN28细胞株比较，MCF-10A细胞株的活性倍数较低（P < 0.01），见图 7。在加入CoCl2条件下，与SGC7901细胞株比较，MKN28及MCF-10A细胞株的活性倍数均较低（P < 0.01）；与MKN28细胞株比较，MCF-10A细胞株的活性倍数较低（P < 0.05），见图 7。该结果提示，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有靶向CEA转录阳性细胞及低氧诱导的双重转录调控能力。
图6
示CoCl2不同浓度（6A）和不同作用时间（6B）的活性倍数结果 图 7 示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在3种细胞株中的转录活性。同种细胞株内与常氧组比较，* P < 0.01；同种CoCl2条件下与SGC7901细胞株比较，# P < 0.05，## P < 0.01；同种CoCl2条件下与MKN28细胞株比较，△P < 0.05，△△P < 0.01 图 8 示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc与pGL4.20-CEAp-Luc载体在SGC7901细胞株中的转录活性。同种细胞株内与缺氧组比较，* P < 0.05；同种CoCl2条件下与5HRE-CEAp比较，# P < 0.05 图 9 示SGC7901（9A）和MKN28（9B）细胞株感染慢病毒颗粒后细胞中RASSF1A蛋白表达的电泳结果。1：空白对照组；2：阴性对照组；3：感染组；N：常氧组；H：缺氧组 图 10 示SGC7901细胞的CCK-8检测结果。与其余5组比较，* P < 0.05 图 11 示MKN28细胞的CCK-8检测结果。与空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组比较，* P < 0.05
2.3.3 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc与pGL4.20-CEAp-Luc载体在SGC7901细胞株中的转录活性
双萤光素酶报告基因实验结果显示，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，经过CoCl2处理24 h后，缺氧组的活性倍数比常氧组升高约1倍（P < 0.05）；而对pGL4.20-CEAp-Luc载体而言，常氧组与缺氧组的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）。在加入CoCl2条件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体组细胞的转录活性高于pGL4.20-CEAp-Luc载体（P < 0.05）；在不加入CoCl2条件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体组细胞的转录活性与pGL4.20-CEAp-Luc载体组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 8。该结果提示，在缺氧条件下的SGC7901细胞株中，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体的转录活性比pGL4.20-CEAp-Luc载体高。
2.4 细胞感染后的增殖抑制率和RASSF1A蛋白表达结果
Western blot结果显示：在SGC7901细胞，空白对照组/阴性对照组细胞在常氧和缺氧条件下其RASSF1A蛋白均呈弱表达，差异不明显；感染组细胞在常氧条件下RASSF1A蛋白呈弱表达，而在缺氧条件下RASSF1A蛋白的表达水平明显增强，见图 9。在MKN28细胞，空白对照组、阴性对照组以及感染组细胞在常氧及缺氧条件下均未见RASSF1A蛋白表达的电泳条带（图 9）。
CCK-8检测结果显示：在SGC7901细胞，与感染-缺氧组比较，其余5组细胞的生长抑制率均较低（P < 0.05），见图 10。在MKN28细胞，与空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组细胞比较，其余4组细胞的生长抑制率均较高（P < 0.05），但该4组细胞间比较差异无统计学意义（P > 0.05），且空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组间比较差异也无统计学意义（P > 0.05）。见图 11。
3 讨论
肿瘤的基因治疗经过20多年的发展，已取得了一些成绩，但仍然无法满足人类对基因治疗的期望值，尚有许多困难需要克服，如治疗载体的靶向性、安全性及治疗基因的有效性。在本实验中，笔者构建了5HRE及CEAp双靶向调控抑癌基因RASSF1A的慢病毒治疗载体，通过双萤光素酶报告基因实验及CCK-8实验初步验证了该治疗载体对CEA表达阳性胃癌细胞的靶向性及有效性。
随着对肿瘤研究的深入，不同的策略被用于肿瘤的基因治疗中。低氧微环境是实体瘤的特征，有50%～60%的局部进展期实体瘤内不均匀分布着低氧区域[7]。研究[8-9]表明，氧浓度依赖性的低氧诱导因子1（HIF-1）通过与靶基因顺式作用元件中的低氧反应元件（HRE）结合而促进靶基因的转录，从而促进恶性肿瘤的发生和发展。利用该特点，不同的团队[10-12]利用不同拷贝的HRE核心元件作为增强子置于治疗基因前面，结果发现在低氧诱导条件下导入治疗载体的肿瘤细胞均表现出高表达治疗基因的特性。CEA是一类在上皮源性恶性肿瘤组织中高表达的糖蛋白，包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌等[13-15]。虽然CEAp的启动活性较弱，但是通过在启动子前加入增强子后，其能表现出较强的针对CEA阳性肿瘤细胞的靶向性及抗肿瘤活性[16-19]。RASSF1A基因是RAS相关结构域家族成员，位于染色体3p21.3。自2000年首次被报道以来，大量的文献资料[20-23]表明，RASSF1A基因是一功能强大的抑癌基因，在大多数实体瘤组织中表达缺失，该基因参与细胞微管动力、细胞周期、凋亡、基因组稳定性、细胞迁移、细胞老化等生物学过程。本课题组设想，通过低氧联合CEAp靶向诱导抑癌基因RASSF1A在CEA阳性肿瘤细胞中的高表达，以实现双重调控、靶向抑制肿瘤的作用。
首先，本课题组通过qRT-PCR、细胞免疫组织化学染色及Western blot技术检测了不同细胞株中CEA mRNA及其蛋白，以及RASSF1A蛋白的表达，结果发现：SGC7901细胞株中CEA mRNA及其蛋白的表达水平均高于MKN28及MCF-10A细胞株（P < 0.05），且在SGC7901及MKN28细胞株中未检测到RASSF1A蛋白的电泳条带。故依据该结果筛选出CEA mRNA表达阳性及RASSF1A蛋白表达阴性的SGC7901胃癌细胞株为实验细胞，CEA mRNA表达阴性及RASSF1A蛋白表达阴性的MKN28胃癌细胞株为阴性对照细胞。在调控基因表达实验方面，本课题组选择灵敏度相对高、干扰小、结果可靠的双萤光素酶报告基因检测系统。结果发现：对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，在SGC7901细胞株中及MKN28细胞株中，同种细胞株内与常氧组比较，缺氧组细胞的活性倍数均升高（P < 0.01），而在MCF-10A细胞株中，常氧组和缺氧组细胞的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）；在SGC7901细胞株中，经过CoCl2处理24 h后，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，缺氧组的活性倍数比常氧组明显升高（P < 0.05），而对GL4.20-CEAp-Luc载体而言，常氧组与缺氧组的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）。该实验结果表明，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有在低氧条件下调控靶基因在CEA转录阳性的肿瘤细胞中高表达的特性，从而使治疗靶基因只在低氧的肿瘤微环境下CEA转录阳性的肿瘤细胞中高表达成为可能。但奇怪的是，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在CEA mRNA表达阴性的MKN28细胞株中也表现出低的启动活性；且免疫组织化学染色结果发现，虽然MKN28细胞中CEA mRNA表达阴性，但CEA蛋白表达阳性，考虑可能是MKN28细胞株中CEA基因的转录效率低、降解快而导致检测不到有关，此外还可能与其复杂的表达调控机理有关[24-25]。此外，梯度实验结果显示：CoCl2的最佳浓度为300μmol/L，最佳处理时间是24 h，这种逐渐升高，到达峰值之后再逐渐下降的模式与文献[26]报道一致，考虑与CoCl2作用时间及浓度依赖的负反馈机理有关。
在接下来的CCK-8实验中，对SGC7901细胞而言，感染-常氧组细胞表现出最高的生长抑制率（P < 0.05）；而对MKN28细胞而言，阴性对照-常氧组、阴性对照-缺氧组、感染-常氧组及感染-缺氧组间的生长抑制率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot检测结果也证实，对SGC7901细胞株而言，感染组细胞在常氧条件下RASSF1A蛋白呈弱表达，而在缺氧条件下RASSF1A蛋白的表达水平明显增加；而对MKN28细胞株而言，空白对照组、阴性对照组及感染组细胞在常氧及缺氧条件下均未见RASSF1A蛋白表达的电泳条带。考虑由于CEA基因转录能力弱，以及存在复杂的表达调控机理，从而导致感染组的MKN28细胞在缺氧诱导下无RASSF1A蛋白的表达上调。以上实验结果提示，慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A在低氧诱导下具有抑制SGC7901胃癌细胞株增殖的能力。
综上所述，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有低氧诱导及CEA靶向性的双重调控特征；其慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A通过调控抑癌基因RASSF1A的表达，初步显示了其具有在低氧诱导下明显抑制CEA阳性SGC7901胃癌细胞增殖的潜能。本实验为继续开展pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A治疗载体的体内及体外实验奠定了实验基础。
胃癌是全世界常见的恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康[1-2]。虽然手术、放疗、化疗等传统治疗胃癌的方法取得了一定的进展，但是其预后仍然不理想。肿瘤的基因治疗成为有希望治愈恶性肿瘤的新方法，目前已取得一些进展，但是其靶向性、治疗基因表达的持久性及载体的安全性一直是肿瘤基因治疗面临的困难[3]。本实验构建了5拷贝低氧反应元件（5HRE）联合癌胚抗原启动子（CEAp）双靶向调控元件和调控RAS相关区域家族1A（RASSF1A）基因表达的慢病毒载体，以初步研究其对癌胚抗原（CEA）表达阳性胃癌细胞的靶向性及有效性。
1 材料与方法
1.1 主要材料、试剂和设备
前期本课题组[4-5]已构建并保存携带5HRE及CEAp DNA片段的载体，RASSF1A基因片段及慢病毒载体均购自上海吉凯基因化学技术有限公司，胃腺癌细胞株SGC7901、MKN28及乳腺正常腺上皮细胞株MCF-10A均购自中科院上海细胞库，限制性内切酶、T4DNA连接酶、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、Premix TaqTM试剂盒及RNA逆转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司，细胞活性检测试剂盒-8（CCK-8）购自日本同仁化学研究所，DNA Marker和琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，萤光素酶报告基因载体pGL4.20、pGL4.74及双萤光素酶检测试剂盒Dual-Glo®LuciferaseAssay System均购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司，细胞培养基RPMI 1640和DMEM/F12均购自美国CORNING公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司，RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司，鼠抗人RASSF1A单克隆抗体购自美国eBioscience公司，辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗鼠二抗购自Pierce公司，兔抗人CEA多克隆抗体购自美国Proteintech公司，HRP标记的β-actin单克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，细胞免疫组织化学SP法检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CoCl2购自美国SIGMA-ALDRICH公司，TurboFect转染试剂和显影剂SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate均购自美国Thermo公司。引物均由上海生工生物有限公司合成，测序由华大科技公司完成。设备主要包括CFX96TM real-time PCR Detection System qPCR仪（美国伯乐公司）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养和细胞悬液制备
SGC7901和MKN28细胞株均在含10%胎牛血清、100μ/mL青霉素和100μ/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养，MCF-10A细胞株在含15%胎牛血清、100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素、10μg/mL胰岛素及20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基中培养。所有细胞株均在37℃、含5% CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，每2～3天换液1次。细胞悬液制备：采用90 mm培养皿培养细胞至指数增殖期时，以磷酸缓冲盐溶液（PBS）换液，再以0.25%胰酶消化液消化至贴壁细胞呈圆形时，用含血清的细胞培养基终止消化并吹打细胞呈单细胞悬液，离心（800 r/min，r=10 cm，5 min）后，以PBS液洗细胞1遍，再以同样条件离心。计数细胞后，稀释至1×105个/mL，根据不同的实验目的，稀释细胞至不同的密度再接种至细胞培养板。
1.2.2 CEA及RASSF1A表达的检测
①采用实时定量RT-PCR（qRT-PCR）法检测3种细胞株中CEA mRNA的表达水平。通过RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒提取细胞的总RNA，具体操作步骤见试剂盒说明书。按逆转录说明书操作获得cDNA（使用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，体系如下：5×PrimeScript Buffer 10μL、总RNA 10μL及RNase Free ddH2O 30μL，共50μL），进行qPCR扩增。qPCR扩增采用SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，反应体系如下：SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，上下游混合引物（20μmol/L）0.5μL，cDNA 1.0μL，ddH2O 11.0μL，共25μL；扩增条件为：94℃变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，35个循环。CEA引物序列（GenBank®/EMBL提取号码：NM_004363.2）和β-actin（GenBank®/EMBL提取号码：NM_001101.3）引物序列见表 1，以β-actin为内参。CEA mRNA的表达水平通过2-ΔΔCt方法计算。每个反应设3个复孔，重复实验3次，取均值。②采用细胞免疫组织化学SP法检测3种细胞株中CEA的表达水平。将细胞接种于24孔细胞培养板中，接种密度为5×104个/mL，每孔500μL；3 d后用PBS溶液清洗细胞3次，每次10 min；以4%多聚甲醛固定30 min后按说明书行SP法免疫组织化学染色。以PBS溶液代替一抗作为阴性对照，DAB显色时间为2 min。当阴性对照结果为阴性时，视检测结果可信。CEA蛋白的阳性表达主要定位在细胞的细胞膜和细胞浆中，以出现棕黄色颗粒为阳性。用Nikon倒置显微镜通过Nikon数码相机和NIS-Elements D采图软件在20倍物镜下按照同一采集参数拍摄，每孔细胞样品随机截取5个不同的阳性部位采集图像（200倍），其测量均值代表该孔细胞测量值。用Image Pro Plus 6图像分析软件随机选取每张图像中的阳性细胞簇作为测量区域（area of interesting，AOI），测量该区域的面积。在该区域内通过分色工具测量棕黄色颗粒的积分光密度（integrated option density，IOD），计算平均密度（mean density，MD）。MD=IOD/AOI的面积。MD值代每个单位面积的染色强度，可以较准确地反映阳性产物的浓度。每种细胞设3个复孔，重复实验3次，取均值。③通过Western blot法[6]检测3种细胞株中RASSF1A蛋白的表达水平（因条带结果较明显，故未定量），以β-actin作为内参。每种细胞设3个复孔，重复实验3次，取均值。
表1
引物序列
1.2.3 载体构建
①萤光素酶报告基因载体pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc的构建。以载体pLEGFP-N1-5HRE-CEAp-TSST-1-linker-CD80TM为模板，采用PCR法扩增CEAp和5HRE-CEAp片段（引物序列见表 1）。反应体系：Premix TaqTM 25μL、cDNA 2μL、混合引物（20μmol/L）1μL、ddH2O 22μL，共50μL。PCR反应条件：94℃变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸7 min。片段经过琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收，通过分子克隆技术将各片段分别插入pGL4.20多克隆位点（操作按试剂盒说明书进行），构建pGL-4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc载体。②慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A的构建。首先通过PCR法扩增RASSF1A基因片段（引物序列见表 1），通过分子克隆技术将5HRE-CEAp片段与RASSF1A片段连接并插入慢病毒载体的多克隆位点（操作按试剂盒说明书进行）。将构建的载体送华大科技公司测序验证。
1.2.4 双萤光素酶报告基因实验
以含有萤火虫萤光素酶报告基因的无启动子载体pGL4.20作为阴性对照，以含有海肾萤光素酶报告基因的载体pGL4.74作为共转染表达载体〔该载体含单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（HSV-TKp）〕，以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc和pGL4.20-CEAp-Luc载体作为实验对象。各载体结构见图 1。首先开展CoCl2的浓度梯度和时间梯度实验，选择最佳作用浓度和最佳作用时间（作用细胞为SGC7901细胞株）。在浓度梯度实验中，以不同浓度的CoCl2（0、100、200、300、400及500μmol/L）作用12 h，结果300μmol/L的活性倍数最高；在时间梯度实验中，以固定浓度的CoCl2（200μmol/L）作用不同时间（0、4、8、12、24及48 h），结果作用24 h的活性倍数最高。再取对数生长期的细胞株，以5×103个/孔接种于96孔板中，待细胞融合度达70%时，将载体pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc（3种细胞株）、pGL4.20-CEAp-Luc（仅转染SGC7901细胞株）及pGL4.20（3种细胞株）分别与pGL4.74（30 ng）共转染细胞（操作按试剂盒说明书进行，载体均为200 ng）。24 h后更换培养基并按设计加（缺氧组）或不加CoCl2（常氧组），CoCl2浓度为200μmol/L（预实验发现300μmol/L的CoCl2可导致较多的细胞死亡，所以最终选择200μmol/L），作用时长为24 h。活性倍数的检测：终止培养后，按照Dual-Glo®Luciferase Assay System试剂盒说明书操作，在酶标仪（510 nm）上检测萤光素酶活性。为便于比较不同组启动子的启动活性，其结果使用活性倍数进行比较。活性倍数=样本活性比值（萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性）/阴性对照活性比值（萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性）。
图1
双萤光素酶报告基因实验载体的结构示意图。hRluc：海肾萤光素酶报告基因；Luc：萤火虫萤光素酶基因
1.2.5 细胞感染
重组慢病毒载体（pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A）及相应空病毒载体均由吉凯公司包装成病毒颗粒LV-5HC-RASSF1A（感染组）和LV-NC（阴性对照组）。取对数生长期的SGC7901及MKN28细胞，以1×105个/孔接种于96孔板中，培养24 h后感染病毒〔感染复数（MOI）为10〕，操作按试剂盒说明书进行。以未感染任何病毒的细胞作为空白对照组。48 h后根据设计需要加（缺氧组）或不加CoCl2（常氧组），浓度为300μmol/L，作用24 h。每组设3个复孔。在培养24 h后，检测细胞生长抑制率（操作按CCK-8检测试剂盒说明书进行），在酶标仪（450 nm波长）上检测吸光度值（A值）。抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%，其中对照组为不做任何处理的SGC7901及MKN28细胞，实验组为加或不加CoCl2的细胞（感染或未感染病毒颗粒）。同时采用Western blot法检测细胞中RASSF1A蛋白的表达水平（方法同上）。
1.3 统计学方法
数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。所得实验结果以均数±标准差（
2 结果
2.1 内源性CEA和RASSF1A的表达结果
qRT-PCR结果显示，SGC7901细胞株中CEA mRNA的表达水平高于MKN28及MCF-10A细胞株（P < 0.05），而MKN28及MCF-10A细胞株间比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2。免疫组织化学染色结果显示：CEA的表达水平在SGC7901、MKN28及MCF-10A细胞株中依次递减，两两比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 3和图 4。Western blot结果显示，在SGC7901及MKN28细胞株中均未检测到RASSF1A蛋白的电泳条带，而在MCF-10A细胞株中可检测到（图 5）。依据该结果，本实验确定SGC7901细胞株为实验细胞（CEA mRNA表达阳性，RASSF1A蛋白表达阴性），MKN28细胞株为阴性对照细胞（CEA mRNA表达阴性，RASSF1A蛋白表达阴性）。
图2
示3种细胞株中CEA mRNA表达水平检测结果。与MKN28和MCF-10A细胞株比较，* P < 0.05 图 3 示3种细胞株中CEA蛋白表达水平检测结果。与SGC7901细胞株比较，* P < 0.05；与MKN28细胞株比较，# P < 0.05 图 4 示3种细胞株中CEA的免疫组织化学染色结果（SP×200）。4A：SGC7901细胞株；4B：MKN28细胞株；4C：MCF-10A细胞株 图 5 示RASSF1A蛋白的电泳结果。1：SGC7901细胞株；2：MKN28细胞株；3：MCF-10A细胞株
2.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A载体构建
构建的pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc、pGL4.20-CEAp-Luc及pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A载体经测序均构建成功。
2.3 梯度试验和双萤光素酶报告基因实验结果
2.3.1 以pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc转染SGC7901细胞株后，CoCl2不同作用浓度和不同作用时间的活性倍数结果
在300μmol/L以下，随CoCl2浓度升高，活性倍数相应升高；而在300μmol/L以上，随着CoCl2浓度升高，活性倍数下降，见6A。24 h之前，随着CoCl2作用时间延长，活性倍数相应升高；24 h之后，活性倍数开始下降，见6B。由此确定了300μmol/L为CoCl2的最优浓度，24 h为其最优作用时间。
2.3.2 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在SGC7901、MKN28及MCF-10A细胞株中的启动活性
双萤光素酶报告基因实验结果显示，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，在SGC7901细胞株及MKN28细胞株中，同种细胞株内与常氧组比较，缺氧组细胞的活性倍数均升高（P < 0.01）；而在MCF-10A细胞株中，常氧组和缺氧组细胞的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 7。在不加入CoCl2条件下，与SGC7901细胞株比较，MKN28及MCF-10A细胞株的活性倍数均较低（P < 0.05）；与MKN28细胞株比较，MCF-10A细胞株的活性倍数较低（P < 0.01），见图 7。在加入CoCl2条件下，与SGC7901细胞株比较，MKN28及MCF-10A细胞株的活性倍数均较低（P < 0.01）；与MKN28细胞株比较，MCF-10A细胞株的活性倍数较低（P < 0.05），见图 7。该结果提示，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有靶向CEA转录阳性细胞及低氧诱导的双重转录调控能力。
图6
示CoCl2不同浓度（6A）和不同作用时间（6B）的活性倍数结果 图 7 示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在3种细胞株中的转录活性。同种细胞株内与常氧组比较，* P < 0.01；同种CoCl2条件下与SGC7901细胞株比较，# P < 0.05，## P < 0.01；同种CoCl2条件下与MKN28细胞株比较，△P < 0.05，△△P < 0.01 图 8 示pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc与pGL4.20-CEAp-Luc载体在SGC7901细胞株中的转录活性。同种细胞株内与缺氧组比较，* P < 0.05；同种CoCl2条件下与5HRE-CEAp比较，# P < 0.05 图 9 示SGC7901（9A）和MKN28（9B）细胞株感染慢病毒颗粒后细胞中RASSF1A蛋白表达的电泳结果。1：空白对照组；2：阴性对照组；3：感染组；N：常氧组；H：缺氧组 图 10 示SGC7901细胞的CCK-8检测结果。与其余5组比较，* P < 0.05 图 11 示MKN28细胞的CCK-8检测结果。与空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组比较，* P < 0.05
2.3.3 pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc与pGL4.20-CEAp-Luc载体在SGC7901细胞株中的转录活性
双萤光素酶报告基因实验结果显示，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，经过CoCl2处理24 h后，缺氧组的活性倍数比常氧组升高约1倍（P < 0.05）；而对pGL4.20-CEAp-Luc载体而言，常氧组与缺氧组的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）。在加入CoCl2条件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体组细胞的转录活性高于pGL4.20-CEAp-Luc载体（P < 0.05）；在不加入CoCl2条件下，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体组细胞的转录活性与pGL4.20-CEAp-Luc载体组比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图 8。该结果提示，在缺氧条件下的SGC7901细胞株中，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体的转录活性比pGL4.20-CEAp-Luc载体高。
2.4 细胞感染后的增殖抑制率和RASSF1A蛋白表达结果
Western blot结果显示：在SGC7901细胞，空白对照组/阴性对照组细胞在常氧和缺氧条件下其RASSF1A蛋白均呈弱表达，差异不明显；感染组细胞在常氧条件下RASSF1A蛋白呈弱表达，而在缺氧条件下RASSF1A蛋白的表达水平明显增强，见图 9。在MKN28细胞，空白对照组、阴性对照组以及感染组细胞在常氧及缺氧条件下均未见RASSF1A蛋白表达的电泳条带（图 9）。
CCK-8检测结果显示：在SGC7901细胞，与感染-缺氧组比较，其余5组细胞的生长抑制率均较低（P < 0.05），见图 10。在MKN28细胞，与空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组细胞比较，其余4组细胞的生长抑制率均较高（P < 0.05），但该4组细胞间比较差异无统计学意义（P > 0.05），且空白对照-常氧组和空白对照-缺氧组间比较差异也无统计学意义（P > 0.05）。见图 11。
3 讨论
肿瘤的基因治疗经过20多年的发展，已取得了一些成绩，但仍然无法满足人类对基因治疗的期望值，尚有许多困难需要克服，如治疗载体的靶向性、安全性及治疗基因的有效性。在本实验中，笔者构建了5HRE及CEAp双靶向调控抑癌基因RASSF1A的慢病毒治疗载体，通过双萤光素酶报告基因实验及CCK-8实验初步验证了该治疗载体对CEA表达阳性胃癌细胞的靶向性及有效性。
随着对肿瘤研究的深入，不同的策略被用于肿瘤的基因治疗中。低氧微环境是实体瘤的特征，有50%～60%的局部进展期实体瘤内不均匀分布着低氧区域[7]。研究[8-9]表明，氧浓度依赖性的低氧诱导因子1（HIF-1）通过与靶基因顺式作用元件中的低氧反应元件（HRE）结合而促进靶基因的转录，从而促进恶性肿瘤的发生和发展。利用该特点，不同的团队[10-12]利用不同拷贝的HRE核心元件作为增强子置于治疗基因前面，结果发现在低氧诱导条件下导入治疗载体的肿瘤细胞均表现出高表达治疗基因的特性。CEA是一类在上皮源性恶性肿瘤组织中高表达的糖蛋白，包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌等[13-15]。虽然CEAp的启动活性较弱，但是通过在启动子前加入增强子后，其能表现出较强的针对CEA阳性肿瘤细胞的靶向性及抗肿瘤活性[16-19]。RASSF1A基因是RAS相关结构域家族成员，位于染色体3p21.3。自2000年首次被报道以来，大量的文献资料[20-23]表明，RASSF1A基因是一功能强大的抑癌基因，在大多数实体瘤组织中表达缺失，该基因参与细胞微管动力、细胞周期、凋亡、基因组稳定性、细胞迁移、细胞老化等生物学过程。本课题组设想，通过低氧联合CEAp靶向诱导抑癌基因RASSF1A在CEA阳性肿瘤细胞中的高表达，以实现双重调控、靶向抑制肿瘤的作用。
首先，本课题组通过qRT-PCR、细胞免疫组织化学染色及Western blot技术检测了不同细胞株中CEA mRNA及其蛋白，以及RASSF1A蛋白的表达，结果发现：SGC7901细胞株中CEA mRNA及其蛋白的表达水平均高于MKN28及MCF-10A细胞株（P < 0.05），且在SGC7901及MKN28细胞株中未检测到RASSF1A蛋白的电泳条带。故依据该结果筛选出CEA mRNA表达阳性及RASSF1A蛋白表达阴性的SGC7901胃癌细胞株为实验细胞，CEA mRNA表达阴性及RASSF1A蛋白表达阴性的MKN28胃癌细胞株为阴性对照细胞。在调控基因表达实验方面，本课题组选择灵敏度相对高、干扰小、结果可靠的双萤光素酶报告基因检测系统。结果发现：对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，在SGC7901细胞株中及MKN28细胞株中，同种细胞株内与常氧组比较，缺氧组细胞的活性倍数均升高（P < 0.01），而在MCF-10A细胞株中，常氧组和缺氧组细胞的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）；在SGC7901细胞株中，经过CoCl2处理24 h后，对pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体而言，缺氧组的活性倍数比常氧组明显升高（P < 0.05），而对GL4.20-CEAp-Luc载体而言，常氧组与缺氧组的活性倍数比较差异无统计学意义（P > 0.05）。该实验结果表明，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有在低氧条件下调控靶基因在CEA转录阳性的肿瘤细胞中高表达的特性，从而使治疗靶基因只在低氧的肿瘤微环境下CEA转录阳性的肿瘤细胞中高表达成为可能。但奇怪的是，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体在CEA mRNA表达阴性的MKN28细胞株中也表现出低的启动活性；且免疫组织化学染色结果发现，虽然MKN28细胞中CEA mRNA表达阴性，但CEA蛋白表达阳性，考虑可能是MKN28细胞株中CEA基因的转录效率低、降解快而导致检测不到有关，此外还可能与其复杂的表达调控机理有关[24-25]。此外，梯度实验结果显示：CoCl2的最佳浓度为300μmol/L，最佳处理时间是24 h，这种逐渐升高，到达峰值之后再逐渐下降的模式与文献[26]报道一致，考虑与CoCl2作用时间及浓度依赖的负反馈机理有关。
在接下来的CCK-8实验中，对SGC7901细胞而言，感染-常氧组细胞表现出最高的生长抑制率（P < 0.05）；而对MKN28细胞而言，阴性对照-常氧组、阴性对照-缺氧组、感染-常氧组及感染-缺氧组间的生长抑制率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot检测结果也证实，对SGC7901细胞株而言，感染组细胞在常氧条件下RASSF1A蛋白呈弱表达，而在缺氧条件下RASSF1A蛋白的表达水平明显增加；而对MKN28细胞株而言，空白对照组、阴性对照组及感染组细胞在常氧及缺氧条件下均未见RASSF1A蛋白表达的电泳条带。考虑由于CEA基因转录能力弱，以及存在复杂的表达调控机理，从而导致感染组的MKN28细胞在缺氧诱导下无RASSF1A蛋白的表达上调。以上实验结果提示，慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A在低氧诱导下具有抑制SGC7901胃癌细胞株增殖的能力。
综上所述，pGL4.20-5HRE-CEAp-Luc载体具有低氧诱导及CEA靶向性的双重调控特征；其慢病毒载体pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A通过调控抑癌基因RASSF1A的表达，初步显示了其具有在低氧诱导下明显抑制CEA阳性SGC7901胃癌细胞增殖的潜能。本实验为继续开展pLV-5HRE-CEAp-RASSF1A治疗载体的体内及体外实验奠定了实验基础。
