引用本文： 王路兵, 朱登峰, 黄磊, 张超峰, 姜波健. 胃腺癌患者外周血中基质细胞衍生因子-1α含量检测及其临床意义. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(11): 1327-1331. doi: 10.7507/1007-9424.20150347 复制
近年来研究[1]发现，基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）/趋化因子受体4（CXCR4）轴在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等的迁移、侵袭和转移过程中发挥关键作用。在前列腺癌起始细胞的研究[2]中发现，活化的SDF-1α/CXCR4轴维持其肿瘤分化、细胞黏附及致瘤能力。有报道[3-4]称，CXCR4高表达与胆囊癌淋巴结浸润和转移呈正相关，并可作为监测预后的独立危险因素。在结肠癌中，CXCR4和CD133联合表达提示高转移可能性[5]。我们前期研究[6]结果证明，在胃癌KATO-Ⅲ细胞中，SDF-1α/CXCR4轴参与调控CD133（一种潜在的胃癌起始细胞标志物）的表达。还有研究[7-8]表明，SDF-1α/CXCR4轴可能与胃癌淋巴结转移呈一定的相关性，或可作为胃癌治疗的一个潜在靶点。本研究应用酶联免疫吸附测定技术（ELISA）检测胃腺癌患者血清中SDF-1α的含量，并分析其与胃腺癌患者临床病理特征之间的关系，并进一步探讨其与胃腺癌患者的生存关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2010年1月至2015年4月期间就诊于上海交通大学医学院附属第三人民医院普外科并实施D2手术和获得完整随访资料的胃腺癌患者90例，其中男42例，女48例；年龄45～85岁，中位年龄60岁。组织学类型：管状腺癌76例，低分化腺癌4例，印戒细胞腺癌10例。TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期23例，Ⅲ期48例，Ⅳ期12例。淋巴结转移：有76例，无14例。CT、B超等影像学检查评估患者术前肿瘤转移情况，发生远处转移患者12例，其中肝转移5例，腹腔转移4例，肺转移3例；无远处转移患者78例。所有胃腺癌患者就诊前均未采用放化疗，除黏膜内癌外，其余全身情况许可者术后均予以5-氟尿嘧啶+草酸铂+甲酰四氢叶酸钙治疗4～6个疗程。选择25名年龄与胃腺癌患者匹配、体格检查与常规生化检查均无明显异常的健康自愿者作为对照，其中男10例，女15例；年龄38～72岁，中位年龄55岁。随访截止日期为2015年4月30日，随访率为90%。随访方式为电话随访或门诊随访。所有胃腺癌患者和健康自愿者均获书面知情同意。研究开始前获医院伦理委员会审核同意。采集胃腺癌患者治疗前及健康自愿者的血清样本用以检测血清SDF-1α含量。
1.2 采用ELISA法检测外周血中SDF-1α含量
分别收集胃腺癌患者和健康自愿者外周血2 mL，放入常规生化检测管内，在4℃条件下，以3 000 r/min（r=13.5 cm）离心5 min。取上清液500μL存放于-70℃冰箱至检测。按ELISA试剂盒（Bio-Swamp，上海顺元生物科技有限公司，R & D systems）操作。具体步骤为：①加样：稀释标准品至不同浓度，每个测试管的密度标准是9 600、4 800、2 400、1 200、600、0 pg/mL。加待检样品100μL于反应孔中。②加酶标抗体：于各反应孔中，在标准品和样本中分别加入抗SDF-1α单抗10μL，置37℃孵育1 h，洗涤。③加底物液显色：于各反应孔中加入即刻配制的TMB底物溶液（3，3，5，5-Tetramethyl benzidine solution liquid membrane substrate）200μL，置37℃反应30 min。④终止反应：于各反应孔中加入硫酸50μL，使用酶联免疫分析仪（Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，美国）测定450 nm波长处每孔吸光度值（A值）[9]。以SDF-1α含量中位数为界，大于中位数者为高表达，小于等于中位数者为低表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件（Chicago，IL，美国）进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 血清SDF-1α含量比较
健康自愿者的血清中SDF-1α含量为（5 023.7±1 103.8）ng/L，明显低于胃腺癌患者的（6 950.8±1 131.3）ng/L，差异有统计学意义（P=0.036）。
2.2 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的关系
分析胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病例特征的关系显示，随着肿瘤浸润深度（P < 0.001）、淋巴结转移程度（P=0.018）和TNM分期（P < 0.001）的增加，外周血中SDF-1α含量呈上升趋势；且有血管浸润（P=0.001）、淋巴管浸润（P < 0.001）和远处转移（P < 0.001）的胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量明显高于未出现上述情况的患者；但胃腺癌患者的年龄（P=0.282）、性别（P=0.712）、组织学类型（P=0.281）、肿瘤直径（P=0.627）和组织学分级（P=0.053）与其外周血中SDF-1α含量无关，见表 1。对远处转移进一步进行分层分析显示，有肝转移和肺转移的患者外周血中SDF-1α含量均分别明显高于无肝转移（P=0.002）和肺转移（P=0.030）患者，见表 1。
表1
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的关系（ng/L，进一步多因素分析发现，肿瘤浸润深度（OR=14.999，95%可信区间为3.568～75.456，P=0.027）和远处转移的发生（OR=0.186，95%可信区间为0.610～2.014，P=0.026）与外周血中SDF-1α含量升高明显有关，见表 2。
表2
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的logistic分析结果
2.3 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量对预后的影响
以Kaplan-Meier法绘制的生存曲线见图 1。
图1
胃腺癌患者外周血SDF-1α含量高者和含量低者的生存曲线比较
从图 1可见，经log-rank检验，胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量低者的生存时间明显优于含量高的患者（P=0.001）。SDF-1α含量低者的生存时间为（49.55±13.15）个月，明显优于SDF-1α含量高者的（33.56±16.33）个月（P < 0.001）。
2.4 影响胃腺癌患者预后的因素分析结果
单因素分析结果显示，胃癌患者肿瘤浸润越深（P=0.021）、TNM分期越晚（P < 0.001）、远处转移（P=0.004）、血管浸润存在（P=0.002）及外周血SDF-1α含量高表达（P=0.001）的患者的预后越差。进一步Cox比例风险回归模型分析结果显示，肿瘤TNM分期（RR=2.497，95%可信区间为1.987～10.238，P=0.009）、血管浸润（RR=7.501，95%可信区间为2.086～16.942，P=0.002）及外周血SDF-1α含量高（RR=18.302，95%可信区间为6.895～30.538，P=0.001）分别是影响预后的独立危险因素，见表 3。
表3
影响胃癌患者预后的Cox比例风险回归模型分析结果
3 讨论
SDF-1α/CXCR4轴是由趋化因子SDF-1α与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的偶联分子对[10]，此轴可调控非小细胞肺癌[11]、乳腺癌[12]及结直肠癌[13]的侵袭和转移。在胃癌中，乏氧环境通过低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促进CXCR4的表达，从而调控胃癌细胞的生物学特性[14]。CXCR4的表达增强与胃癌患者的预后不良呈正相关[15-16]，激活胃恶性溃疡微环境中的SDF-1α/CXCR4轴可募集基质细胞诱导胃癌的发生[17]。但是SDF-1α对胃癌细胞侵袭能力的作用，目前相关的研究较少。
Zhi等[18]的研究发现，通过DNA甲基化手段降低胃癌组织中SDF-1α的表达，可显著抑制胃癌的淋巴结转移。同样有研究者[19]利用白花丹素下调SDF-1α受体CXCR4的表达，可抑制乳腺癌细胞发生转移。在本研究结果中也发现，在发生远处转移的胃癌患者的体内血清中SDF-1α含量明显高于未发生远处转移的患者，结果提示，胃癌患者血清中SDF-1α含量可能与胃癌的转移有关。进一步研究发生远处转移的患者，发现只有转移至肝和肺的胃癌患者，其外周血中SDF-1α水平相较于其未发生转移的患者显著增高，而对于发生腹腔转移的患者，其表达水平较未发生转移的患者没有明显变化。分析其原因可能为：一方面，相较于其他转移易发生部位，肝和肺器官丰富的血供可保证维持SDF-1α含量在一较高水平，更有利于募集到循环系统中的肿瘤细胞转移至此，而随着募集到的肿瘤细胞的增多，可进一步促进肿瘤细胞所处微环境中SDF-1α的分泌，以促进转移瘤的生长；另一方面，由于腹腔本身没有肝和肺那样丰富的血供，所以即便存在较为广泛的腹腔转移时，患者血清SDF-1α水平与无腹腔转移患者相比仍升高不显著；此外，发生腹腔广泛转移的病例数较少或也是导致本研究中出现腹腔转移患者的SDF-1α表达水平较未发生转移者无显著差别的可能原因之一。
趋化因子及其受体与胃癌的发生、进展及转移有密切联系，或可作为治疗潜在靶点[20]。有研究[21]发现，趋化因子家族的多态性与胃癌的发生和预后息息相关。本课题组前期研究[22]发现，SDF-1受体CXCR4在胃癌组织中的阳性表达与胃癌的侵袭和转移有关。Wang等[23]比较胃癌患者胃癌组织中和癌旁组织中SDF-1含量发现，SDF-1的表达可作为胃癌患者预后的独立预测因子，并且与肿瘤的侵袭程度、淋巴结转移和远处转移有关。针对SDF-1α/CXCR4轴及其下游的mTOR通路作为治疗靶点可能对于胃癌转移患者具有一定帮助[24]。本研究进一步探究发现，随着肿瘤进展程度的增高、淋巴结转移的广泛和浸润深度的加深，外周血中SDF-1α含量升高，提示外周血中SDF-1α可能与胃癌的淋巴结转移和侵袭转移有关。Cox回归分析结果表明，肿瘤分期、血管浸润和外周血中SDF-1α高表达是胃癌患者预后的独立危险因素，并且外周血中SDF-1α高表达患者，其术后生存时间短于期低表达患者。
综上所述，SDF-1α可能在胃癌生长，乃至在肝、肺等器官转移的发生中发挥重要作用。术后持续随访检测胃癌患者血清中SDF-1α含量对提高胃癌的诊断率、评估患者预后及其特定器官的转移或许有重要的预测意义，值得进一步的多中心随机对照研究的验证。
近年来研究[1]发现，基质细胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）/趋化因子受体4（CXCR4）轴在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等的迁移、侵袭和转移过程中发挥关键作用。在前列腺癌起始细胞的研究[2]中发现，活化的SDF-1α/CXCR4轴维持其肿瘤分化、细胞黏附及致瘤能力。有报道[3-4]称，CXCR4高表达与胆囊癌淋巴结浸润和转移呈正相关，并可作为监测预后的独立危险因素。在结肠癌中，CXCR4和CD133联合表达提示高转移可能性[5]。我们前期研究[6]结果证明，在胃癌KATO-Ⅲ细胞中，SDF-1α/CXCR4轴参与调控CD133（一种潜在的胃癌起始细胞标志物）的表达。还有研究[7-8]表明，SDF-1α/CXCR4轴可能与胃癌淋巴结转移呈一定的相关性，或可作为胃癌治疗的一个潜在靶点。本研究应用酶联免疫吸附测定技术（ELISA）检测胃腺癌患者血清中SDF-1α的含量，并分析其与胃腺癌患者临床病理特征之间的关系，并进一步探讨其与胃腺癌患者的生存关系。
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取2010年1月至2015年4月期间就诊于上海交通大学医学院附属第三人民医院普外科并实施D2手术和获得完整随访资料的胃腺癌患者90例，其中男42例，女48例；年龄45～85岁，中位年龄60岁。组织学类型：管状腺癌76例，低分化腺癌4例，印戒细胞腺癌10例。TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期23例，Ⅲ期48例，Ⅳ期12例。淋巴结转移：有76例，无14例。CT、B超等影像学检查评估患者术前肿瘤转移情况，发生远处转移患者12例，其中肝转移5例，腹腔转移4例，肺转移3例；无远处转移患者78例。所有胃腺癌患者就诊前均未采用放化疗，除黏膜内癌外，其余全身情况许可者术后均予以5-氟尿嘧啶+草酸铂+甲酰四氢叶酸钙治疗4～6个疗程。选择25名年龄与胃腺癌患者匹配、体格检查与常规生化检查均无明显异常的健康自愿者作为对照，其中男10例，女15例；年龄38～72岁，中位年龄55岁。随访截止日期为2015年4月30日，随访率为90%。随访方式为电话随访或门诊随访。所有胃腺癌患者和健康自愿者均获书面知情同意。研究开始前获医院伦理委员会审核同意。采集胃腺癌患者治疗前及健康自愿者的血清样本用以检测血清SDF-1α含量。
1.2 采用ELISA法检测外周血中SDF-1α含量
分别收集胃腺癌患者和健康自愿者外周血2 mL，放入常规生化检测管内，在4℃条件下，以3 000 r/min（r=13.5 cm）离心5 min。取上清液500μL存放于-70℃冰箱至检测。按ELISA试剂盒（Bio-Swamp，上海顺元生物科技有限公司，R & D systems）操作。具体步骤为：①加样：稀释标准品至不同浓度，每个测试管的密度标准是9 600、4 800、2 400、1 200、600、0 pg/mL。加待检样品100μL于反应孔中。②加酶标抗体：于各反应孔中，在标准品和样本中分别加入抗SDF-1α单抗10μL，置37℃孵育1 h，洗涤。③加底物液显色：于各反应孔中加入即刻配制的TMB底物溶液（3，3，5，5-Tetramethyl benzidine solution liquid membrane substrate）200μL，置37℃反应30 min。④终止反应：于各反应孔中加入硫酸50μL，使用酶联免疫分析仪（Bio-Rad Laboratories Inc，Hercules，CA，美国）测定450 nm波长处每孔吸光度值（A值）[9]。以SDF-1α含量中位数为界，大于中位数者为高表达，小于等于中位数者为低表达。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0软件（Chicago，IL，美国）进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（
2 结果
2.1 血清SDF-1α含量比较
健康自愿者的血清中SDF-1α含量为（5 023.7±1 103.8）ng/L，明显低于胃腺癌患者的（6 950.8±1 131.3）ng/L，差异有统计学意义（P=0.036）。
2.2 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的关系
分析胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病例特征的关系显示，随着肿瘤浸润深度（P < 0.001）、淋巴结转移程度（P=0.018）和TNM分期（P < 0.001）的增加，外周血中SDF-1α含量呈上升趋势；且有血管浸润（P=0.001）、淋巴管浸润（P < 0.001）和远处转移（P < 0.001）的胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量明显高于未出现上述情况的患者；但胃腺癌患者的年龄（P=0.282）、性别（P=0.712）、组织学类型（P=0.281）、肿瘤直径（P=0.627）和组织学分级（P=0.053）与其外周血中SDF-1α含量无关，见表 1。对远处转移进一步进行分层分析显示，有肝转移和肺转移的患者外周血中SDF-1α含量均分别明显高于无肝转移（P=0.002）和肺转移（P=0.030）患者，见表 1。
表1
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的关系（ng/L，进一步多因素分析发现，肿瘤浸润深度（OR=14.999，95%可信区间为3.568～75.456，P=0.027）和远处转移的发生（OR=0.186，95%可信区间为0.610～2.014，P=0.026）与外周血中SDF-1α含量升高明显有关，见表 2。
表2
胃腺癌患者血清中SDF-1α含量与临床病理特征的logistic分析结果
2.3 胃腺癌患者血清中SDF-1α含量对预后的影响
以Kaplan-Meier法绘制的生存曲线见图 1。
图1
胃腺癌患者外周血SDF-1α含量高者和含量低者的生存曲线比较
从图 1可见，经log-rank检验，胃腺癌患者外周血中SDF-1α含量低者的生存时间明显优于含量高的患者（P=0.001）。SDF-1α含量低者的生存时间为（49.55±13.15）个月，明显优于SDF-1α含量高者的（33.56±16.33）个月（P < 0.001）。
2.4 影响胃腺癌患者预后的因素分析结果
单因素分析结果显示，胃癌患者肿瘤浸润越深（P=0.021）、TNM分期越晚（P < 0.001）、远处转移（P=0.004）、血管浸润存在（P=0.002）及外周血SDF-1α含量高表达（P=0.001）的患者的预后越差。进一步Cox比例风险回归模型分析结果显示，肿瘤TNM分期（RR=2.497，95%可信区间为1.987～10.238，P=0.009）、血管浸润（RR=7.501，95%可信区间为2.086～16.942，P=0.002）及外周血SDF-1α含量高（RR=18.302，95%可信区间为6.895～30.538，P=0.001）分别是影响预后的独立危险因素，见表 3。
表3
影响胃癌患者预后的Cox比例风险回归模型分析结果
3 讨论
SDF-1α/CXCR4轴是由趋化因子SDF-1α与其特异性受体CXCR4相互作用而构成的一个与细胞间信息传递、细胞迁移有密切关系的偶联分子对[10]，此轴可调控非小细胞肺癌[11]、乳腺癌[12]及结直肠癌[13]的侵袭和转移。在胃癌中，乏氧环境通过低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）促进CXCR4的表达，从而调控胃癌细胞的生物学特性[14]。CXCR4的表达增强与胃癌患者的预后不良呈正相关[15-16]，激活胃恶性溃疡微环境中的SDF-1α/CXCR4轴可募集基质细胞诱导胃癌的发生[17]。但是SDF-1α对胃癌细胞侵袭能力的作用，目前相关的研究较少。
Zhi等[18]的研究发现，通过DNA甲基化手段降低胃癌组织中SDF-1α的表达，可显著抑制胃癌的淋巴结转移。同样有研究者[19]利用白花丹素下调SDF-1α受体CXCR4的表达，可抑制乳腺癌细胞发生转移。在本研究结果中也发现，在发生远处转移的胃癌患者的体内血清中SDF-1α含量明显高于未发生远处转移的患者，结果提示，胃癌患者血清中SDF-1α含量可能与胃癌的转移有关。进一步研究发生远处转移的患者，发现只有转移至肝和肺的胃癌患者，其外周血中SDF-1α水平相较于其未发生转移的患者显著增高，而对于发生腹腔转移的患者，其表达水平较未发生转移的患者没有明显变化。分析其原因可能为：一方面，相较于其他转移易发生部位，肝和肺器官丰富的血供可保证维持SDF-1α含量在一较高水平，更有利于募集到循环系统中的肿瘤细胞转移至此，而随着募集到的肿瘤细胞的增多，可进一步促进肿瘤细胞所处微环境中SDF-1α的分泌，以促进转移瘤的生长；另一方面，由于腹腔本身没有肝和肺那样丰富的血供，所以即便存在较为广泛的腹腔转移时，患者血清SDF-1α水平与无腹腔转移患者相比仍升高不显著；此外，发生腹腔广泛转移的病例数较少或也是导致本研究中出现腹腔转移患者的SDF-1α表达水平较未发生转移者无显著差别的可能原因之一。
趋化因子及其受体与胃癌的发生、进展及转移有密切联系，或可作为治疗潜在靶点[20]。有研究[21]发现，趋化因子家族的多态性与胃癌的发生和预后息息相关。本课题组前期研究[22]发现，SDF-1受体CXCR4在胃癌组织中的阳性表达与胃癌的侵袭和转移有关。Wang等[23]比较胃癌患者胃癌组织中和癌旁组织中SDF-1含量发现，SDF-1的表达可作为胃癌患者预后的独立预测因子，并且与肿瘤的侵袭程度、淋巴结转移和远处转移有关。针对SDF-1α/CXCR4轴及其下游的mTOR通路作为治疗靶点可能对于胃癌转移患者具有一定帮助[24]。本研究进一步探究发现，随着肿瘤进展程度的增高、淋巴结转移的广泛和浸润深度的加深，外周血中SDF-1α含量升高，提示外周血中SDF-1α可能与胃癌的淋巴结转移和侵袭转移有关。Cox回归分析结果表明，肿瘤分期、血管浸润和外周血中SDF-1α高表达是胃癌患者预后的独立危险因素，并且外周血中SDF-1α高表达患者，其术后生存时间短于期低表达患者。
综上所述，SDF-1α可能在胃癌生长，乃至在肝、肺等器官转移的发生中发挥重要作用。术后持续随访检测胃癌患者血清中SDF-1α含量对提高胃癌的诊断率、评估患者预后及其特定器官的转移或许有重要的预测意义，值得进一步的多中心随机对照研究的验证。
