引用本文： 明英姿, 郁孟, 佘兴国, 牛英, 庄权, 刘洪. 肝移植术后移植物抗宿主病的研究进展. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(12): 1447-1452. doi: 10.7507/1007-9424.20150380 复制
大约80%的患者在骨髓移植后会发生移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD），而患者在输注血液制品或实体器官移植（如胰-脾、心-肺、肝）后GvHD也偶有发生[1]。在现有的文献[2-4]中报道的肝移植术后GvHD发生率并不一致，但对其低发生率和高死亡率是有共识的，认为其发生率为0.1%～2%，死亡率>75%。面对如此凶险的病症，及时有效的诊断和治疗显得尤为重要。然而肝移植术后GvHD的诊断和治疗却相当困难：①至今尚未能阐述肝移植术后GvHD的确切发病机制，也无统一的诊断标准，更缺乏确切有效的治疗方案；②临床特征缺乏特异性，如药物反应或病毒感染等均需要有效鉴别[3]；③发生率低，病例量少，难以展开大样本量的研究，现有的多是各中心的病例报道及病例的回顾性分析；④许多移植医生对此疾病尚存在认识不足等。近年来针对肝移植术后GvHD的研究报道也寥寥无几，在这一条艰难的探索道路上，我们仍需不懈努力。
1 肝移植术后GvHD的发现
1966年，Billingham[5]首次提出了GvHD系供体免疫活性细胞与受体细胞抗原间的免疫反应所致，其同时提出GvHD的发生需要满足3个前提条件：①有免疫活性细胞的来源；②供受体组织相容性抗原不同；③受者无力清除供体淋巴细胞。1984年，Starzl等[6]在1例胰-脾联合移植术后的患者身上发现了GvHD，并首次报道并提出了实体器官移植后GvHD。到1988年，Burdick等[7]才首次报道并提出了肝移植术后GvHD。虽然目前肝移植术后GvHD发生的确切机制尚未阐明，但Billingham [5]所提出的3个前提条件还是适用于肝移植术后GvHD。
2 肝移植术后GvHD的发病机制
目前一般认为，肝移植术后GvHD是由于肝移植术后供肝内的免疫活性细胞（主要是T淋巴细胞）识别宿主体内主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）抗原后增殖分化，并攻击宿主体内含有该MHC抗原的组织和器官（如皮肤、消化道、骨髓等），最终导致宿主发生严重的全身性疾病甚至死亡[4]。
早在1991年，Martin [8]就在关于骨髓移植后GvHD发生危险因素的报道中提出，在人类白细胞抗原（HLA）相符的移植中，GvHD的发生便与次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigen，mHA）的差异有重要关系，这或许也是肝移植中供受体HLA的匹配率越高越容易出现致死性的GvHD的原因之一。HLA匹配率低，容易导致宿主抗移植物反应，临床上有较丰富的经验及时应对，即使在治疗排斥后发生GvHD，但宿主对供肝的免疫反应能力良好，通过适当的用药调整当能起到较好的效果；而在HLA匹配率高的情况下，宿主对供肝的免疫反应低下，临床上容易被忽视，待症状明显时，经验性的治疗已经难以起到很好的效果。
现在的研究认为，在原位肝移植术中，大约109～1010数量的供体源性的白细胞（包括单核细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞）会留存在肝门静脉区和肝实质中同移植物一起被植入受体[9]，几乎相当于一次标准的外周血干细胞输注的量。供肝所带来的免疫活性细胞和多能干细胞，对于使用了免疫抑制剂处于免疫抑制状态的患者来说，相当于接受了一次造血干细胞移植[10]。
在大多数情况下，随着供肝植入的造血干细胞数量并不足够多，加上HLA的不匹配程度很高，使得其（供体细胞）移植入以及重建髓系和红系都十分困难。随着时间的推移，受者的免疫系统会排斥供体淋巴细胞并且最终重新建立完全的宿主嵌合体，因此很难发生GvHD。然而不幸发生GvHD的受者，在供肝中的淋巴细胞数量与外周血中不同，肝脏淋巴细胞存在CD4+与CD8+ T淋巴细胞比例倒置，且CD8+ T淋巴细胞和B淋巴细胞比重较高[11]。随着供肝植入宿主的淋巴细胞通过攻击和消灭宿主的造血干细胞可导致严重的全血细胞减少症。此外，供肝内的多功能干细胞还可移行到宿主的骨髓、脾脏、淋巴结和肺并且增殖分化产生更多的供体源性造血谱系的成熟细胞[12]。患者会有不同程度的发热、皮疹、腹泻、血细胞减少等症状，这些临床症状和体征与初次造血干细胞移植后的临床症状和体征是相同的[10]。
简言之，如果供肝与宿主之间的免疫系统平衡被打破并且供肝占优，那么供肝携带的淋巴细胞就会被激活，逐步导致GvHD。
3 肝移植术后GvHD的分类
在国内外文献报道中，实体器官移植术后GvHD可分为体液性和细胞性两类。①体液性GvHD又称为移植物抗宿主溶血，通常发生在移植术后1～2周，病情较轻且多可自愈，偶有严重贫血患者可输血治疗。其主要表现为溶血、发热。一般是ABO血型不相容所致，随供肝植入的淋巴细胞产生抗宿主红细胞抗体，进而使宿主发生溶血性贫血。②细胞性GvHD就是我们所重点讨论的这一类，通常发生在移植术后2～6周，病情较重且死亡率高，目前尚无统一有效的治疗方案。其主要表现为不同程度的发热、皮疹、腹泻、血细胞减少等。一般认为是供肝内的免疫活性细胞识别宿主体内MHC后增殖分化，并攻击宿主体内含有该MHC的组织和器官（如皮肤、消化道、骨髓等），最终导致宿主发生严重的全身性疾病甚至死亡。一般文献报道中所讨论的肝移植术后GvHD均为细胞性GvHD。
此外，还有人将GvHD分为急性GvHD和慢性GvHD，急性与慢性以100 d为界。最近研究[13]对在造血细胞移植术后GvHD的研究认为，急性和慢性GvHD在病理生理学上是不同的，而且在发病时间线上可能存在重叠，因此相应地修订了急性和慢性GvHD的分类标准，见表 1。在目前，肝移植术后急、慢性GvHD的研究方面较为匮乏，只能适当地借鉴造血细胞移植的经验。不论如何，这也提醒我们，在临床上只靠一般的发病时间和临床特征来警惕GvHD是远远不够的。
表1
急、慢性GvHD的分类
4 肝移植术后GvHD发生的危险因素
肝移植术后GvHD的原因尚未明确，但是有不少因素被认为是危险因素，包括HLA匹配率高、受者年龄大、供受者年龄差大、葡萄糖耐受不良、自身免疫性肝炎、乙醇性肝病、肝细胞癌、移植前输血、移植前免疫抑制治疗、排斥、再次移植以及多器官联合移植[4, 14-17]。目前只有两项关于危险因素的研究是有循证风险分析：Smith等[18]的研究表明，受者年龄≥65岁，供受体年龄差≥40岁以及供受体HLA型的近似匹配是危险因素；Chan等[16]的研究中，葡萄糖耐受不良、自身免疫性肝炎、乙醇性肝病、肝细胞癌以及它们的不同组合为危险因素。值得一提的是，Kamei等[19]研究表明，供体与受体的HLA匹配率越高；越容易发生GvHD，且发病的严重程度也越高。活体肝移植比尸体供肝更易出现HLA配型匹配，更容易发生GvHD [20]，这一点与移植医生对于器官移植的常规认知是有出入的，当更加注意。
5 肝移植术后GvHD的临床表现
肝移植术后GvHD发病通常是在肝移植术后第2～6周[14, 21-22]。常见临床表现包括：发热、皮疹、腹泻和血细胞减少[3, 23-25]。在GvHD发病早期，移植肝的肝功能并不受影响[3, 24-26]，到GvHD发病后期常可因各种严重感染、多器官功能衰竭等导致肝功能出现损害。Akbulut等[2]研究表明，常见临床表现的发生率皮疹为94.2%、发热为66.6%、腹泻为54%、各类血细胞减少为54%，其中各类血细胞减少和腹泻两项被认为与死亡率有重要相关性，累及肠道和骨髓会增加死亡风险；首发症状的发生时间是在肝移植术后（60.6±190.1）d（2~1 865 d），但在该研究中首发症状的发生时间并未列入危险因素，但依然认为术后1个月内发生GvHD的患者死亡率要高得多。
关于常见临床表现的具体描述，不少病例报道中均有提及。然而肝移植术后GvHD的临床表现并无特异性，文献报道中的描述亦无大量病例作为支撑，故无法统一归纳。
6 肝移植术后GvHD的诊断标准与方法
GvHD尚无明确统一的诊断标准。众多文献报道所引用的是Triulzi等[1]提出的3点：①靶器官受累出现特征性临床症状和体征，如皮疹、腹泻、血细胞减少等；②受累器官的组织学检查证据；③受累器官或外周血中存在供体淋巴细胞的HLA或DNA证据。
对于受累器官的组织学检查通常包括皮肤、消化道以及骨髓的活检。由于皮疹发生率高且早，适用于早期诊断，但是特异性低，常需要与药疹、感染等相鉴别[27]。一般认为，若活检中发现表皮基底层呈空泡样改变、苔藓样淋巴细胞浸润、角化不良、嗜酸粒细胞坏死等组织学特征时需高度怀疑GvHD。当发生严重的消化道反应（如呕血、便血）时可行消化道活检，若胃、十二指肠或结肠黏膜活检提示黏膜细胞凋亡并发现供者淋巴细胞浸润者则高度提示为GvHD [28]。
GvHD患者的骨髓分析通常会显示显著的骨髓增生不良而无骨髓发育障碍，流式细胞学检查显示重度骨髓抑制，骨髓嵌合体研究显示供体细胞所占比例高而宿主细胞显著减少，染色体核型分析与供体核型一致[10]。受累器官或外周血中是否有供体淋巴细胞的移入，可以通过嵌合体研究和受体骨髓或外周血PCR检测供体HLA等位基因来确证。为了明确肝移植术后的同种异体细胞，需要一份供肝的DNA样本，若所检测T淋巴细胞数量中供体T淋巴细胞水平超过1%，可认为供体淋巴细胞移入；若外周血中供体CD8+ T淋巴细胞/自然杀伤细胞水平持续升高（>10%）则可能提示GvHD [10]。
Taylor等[29]曾对33例肝移植术后疑似GvHD受者（有皮疹、腹泻、发热、全血细胞减少症等临床表现）进行外周血供体淋巴细胞嵌合体研究（嵌合体一般出现在肝移植术后的最初几周，尤其是第1周，到术后3～4周迅速下降[2]），在受者首次出现临床症状时，他们从受者外周血中提取染色体DNA并用PCR法进行供体HLA等位基因检测，对于有检测到供体HLA等位基因者再行双色流式细胞仪分析，确定其中供体T淋巴细胞比例，结果7例受者外周血中供体HLA等位基因PCR检测阳性，都含有嵌合体且供体T淋巴细胞水平在4%～50%，这7例受者肝功能正常、有皮疹，并且在组织学上通过皮肤、肠道活检佐证了其GvHD诊断；另外26例PCR检测阴性的受者，其中23例最终明确为其他诊断，余下3例快速自发恢复。
Domiati-Saad等[30]的研究建议，应当反复多次对受者行HLA Ⅰ类抗原分型（以纯化的T淋巴细胞用血清学方法）和（或）HLA Ⅱ类抗原分型（以序列特异性引物PCR法，即PCR-SSP法），如果检测到供体HLA，应当用PCR扩增短片段串联重复序列（short tandem repeats，STR）检测行供体T淋巴细胞定量分析，当供体CD3 T淋巴细胞>20%则高度提示急性GvHD，低于20%者应当结合临床分析并监测CD3 T淋巴细胞水平看其是否升高，之后每2周进行STR检测CD3和（或）CD8 T淋巴细胞来监测患者对治疗的反应，如果中性粒细胞计数恢复，那么检测附加种群（尤其是CD15）可能对于辨别造血是宿主源性还是供体源性有所帮助。值得一提的是，PCR-SSP法在检测供体细胞时更加灵敏，但可能对于正常水平的嵌合体太过灵敏了，血清学方法一般能检测到10%以上的水平，而PCR-SSP法可检测到1%左右的水平；另外作者还提出，行STR检测时必须使用纯化的细胞种群，因为大量的受者骨髓细胞可能稀释供体T淋巴细胞，这会给人以供体细胞很少的假象。
Kanehira等[31]的研究提出，当供者与受者为异性时，可以利用性染色体荧光原位杂交分析确诊GvHD，该法快速可靠但存在局限性。而Wu等[32]提出一种新的荧光原位杂交定量检测方法似乎有所突破，在同性间肝移植也有效，一旦这种技术能够在临床上应用，对于动态监测肝移植后细胞嵌合的变化和快速诊断GvHD将大有帮助。
7 肝移植术后GvHD的治疗
虽然有很多文献关于造血干细胞移植或骨髓移植术后GvHD的治疗方案，但是目前对于肝移植术后GvHD的治疗在很大程度上都是经验性的。在现有文献[3, 33-35]中，肝移植术后GvHD最常见的用药方案是：皮质类固醇治疗，减量或停用或增量或更换免疫抑制剂，T淋巴细胞抗体、淋巴细胞表面各类受体的单克隆抗体、静脉注射免疫球蛋白作为免疫支持治疗，以及适当的抗生素治疗抑制感染。但皮质类固醇的使用大多是基于其在同种异体骨髓干细胞移植术后GvHD中的运用，其有溶淋巴细胞和免疫抑制作用，也具有强大的抗炎能力，虽然大剂量激素治疗亦会增加感染风险，但是一般认为联合使用大剂量激素和免疫球蛋白是比较合理的方案。即使如此，Rogulj等[10]的研究结果显示，该联合用药方案并不能改善预后，且可能增加感染风险。
对于有并发症或治疗效果不佳的患者大多数还会使用各种单抗或T淋巴细胞抗体，最常用的有达珠单抗（Zenapax）、巴利昔单抗（Simulect）、莫罗单抗（OKT3）、阿仑单抗（Campath-1H）、英夫利昔单抗（Remicade）、地尼白介素2（Ontak）、利妥昔单抗（Mab thera）、抗胸腺细胞球蛋白（ATG）以及抗淋巴细胞球蛋白。然而据Akbulut等[2]分析，以上这些用药的疗效差异并无统计学意义，且死亡率均相当高。从文献报道看，有些患者对于免疫抑制剂减量疗效良好[34, 36]，有些对于更换免疫抑制剂疗效良好[36-37]，也有些对增加免疫抑制剂疗效良好[33, 35]。但由于缺乏统一的监测方法和标准，各文献报道的切实疗效无从评判，更无法明确统一有效的治疗方案。
除去常规的药物治疗手段，亦有一些团队在其他方向做出了尝试。Gregoire-Gauthier等[38]报道，可使用人类间充质干细胞治疗难治性GvHD，其治疗GvHD的作用机制尚不清楚，不过也为GvHD的治疗指出了新的方向。
8 肝移植术后GvHD的预后
肝移植术后GvHD的预后相当差，文献[2]中提到的死亡率高达75%～91.6%，几乎所有患者都是死于多器官功能衰竭综合征、败血症或者胃肠道出血。值得一提的是，对于判断预后的因素方面也存在不少分歧。Taylor等[29]研究认为皮疹和发热是影响死亡率的危险因素，而Akbulut等[2]的研究则认为骨髓（各系血细胞减少）和肠道受累（腹泻）对死亡率有着重要的影响。
9 肝移植术后GvHD的预防
基于已知的GvHD病理生理机制，一般认为采用耗竭供肝中的T淋巴细胞的方案可行。对尸体供者使用抗淋巴细胞球蛋白，对供肝进行充分灌注，仔细地移除肝周淋巴结甚至离体进行放疗照射，或者以直接针对淋巴细胞表面蛋白的细胞溶解酶单克隆抗体灌注供肝[20, 39]等。然而由于肝移植术后GvHD的发生率较低等原因，这些方案是否行之有效还并不能完全肯定，并且还可能增加其急性排斥的风险。
基于那些可能导致肝移植术后GvHD的危险因素考虑：①供受体HLA匹配率不宜过高，同时应尽量避免HLA纯合子的供体给HLA杂合子的受体，以免HLA纯合子的供体细胞能识别宿主抗原而攻击，而HLA杂合子的宿主细胞不能识别供肝抗原致使自身免疫无法激活[20]。②供受体年龄差异不宜过大。③限制血液制品的应用，并使用洗涤红细胞、白细胞或血小板可能有所益处。有些中心会在给肝移植术后患者输血前常规对红细胞悬浮液进行放射[2]。
10 小结
肝移植术后GvHD发生率低但死亡率极高，目前还多是依靠临床表现来提示GvHD发病，以经验性来治疗。近年来，国内外对于肝移植术后GvHD的文献报道并不多，自2012年以来几乎更是停滞不前，这反映出了研究形势的艰难，更阻碍了移植医生对于该疾病的认知。我们认为，在现有条件下，一方面是要增强诊断意识，另一方面更要积极开展组织活检、HLA分型、嵌合体研究等。妥善收集患者的外周血及骨髓标本，加强各中心之间的研究交流，分享讨论诊治经验。希望在不远的将来，对于肝移植术后GvHD的机制、诊断和治疗均能有所突破。
大约80%的患者在骨髓移植后会发生移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GvHD），而患者在输注血液制品或实体器官移植（如胰-脾、心-肺、肝）后GvHD也偶有发生[1]。在现有的文献[2-4]中报道的肝移植术后GvHD发生率并不一致，但对其低发生率和高死亡率是有共识的，认为其发生率为0.1%～2%，死亡率>75%。面对如此凶险的病症，及时有效的诊断和治疗显得尤为重要。然而肝移植术后GvHD的诊断和治疗却相当困难：①至今尚未能阐述肝移植术后GvHD的确切发病机制，也无统一的诊断标准，更缺乏确切有效的治疗方案；②临床特征缺乏特异性，如药物反应或病毒感染等均需要有效鉴别[3]；③发生率低，病例量少，难以展开大样本量的研究，现有的多是各中心的病例报道及病例的回顾性分析；④许多移植医生对此疾病尚存在认识不足等。近年来针对肝移植术后GvHD的研究报道也寥寥无几，在这一条艰难的探索道路上，我们仍需不懈努力。
1 肝移植术后GvHD的发现
1966年，Billingham[5]首次提出了GvHD系供体免疫活性细胞与受体细胞抗原间的免疫反应所致，其同时提出GvHD的发生需要满足3个前提条件：①有免疫活性细胞的来源；②供受体组织相容性抗原不同；③受者无力清除供体淋巴细胞。1984年，Starzl等[6]在1例胰-脾联合移植术后的患者身上发现了GvHD，并首次报道并提出了实体器官移植后GvHD。到1988年，Burdick等[7]才首次报道并提出了肝移植术后GvHD。虽然目前肝移植术后GvHD发生的确切机制尚未阐明，但Billingham [5]所提出的3个前提条件还是适用于肝移植术后GvHD。
2 肝移植术后GvHD的发病机制
目前一般认为，肝移植术后GvHD是由于肝移植术后供肝内的免疫活性细胞（主要是T淋巴细胞）识别宿主体内主要组织相容性复合物（major histocompability complex，MHC）抗原后增殖分化，并攻击宿主体内含有该MHC抗原的组织和器官（如皮肤、消化道、骨髓等），最终导致宿主发生严重的全身性疾病甚至死亡[4]。
早在1991年，Martin [8]就在关于骨髓移植后GvHD发生危险因素的报道中提出，在人类白细胞抗原（HLA）相符的移植中，GvHD的发生便与次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigen，mHA）的差异有重要关系，这或许也是肝移植中供受体HLA的匹配率越高越容易出现致死性的GvHD的原因之一。HLA匹配率低，容易导致宿主抗移植物反应，临床上有较丰富的经验及时应对，即使在治疗排斥后发生GvHD，但宿主对供肝的免疫反应能力良好，通过适当的用药调整当能起到较好的效果；而在HLA匹配率高的情况下，宿主对供肝的免疫反应低下，临床上容易被忽视，待症状明显时，经验性的治疗已经难以起到很好的效果。
现在的研究认为，在原位肝移植术中，大约109～1010数量的供体源性的白细胞（包括单核细胞、T淋巴细胞和自然杀伤细胞）会留存在肝门静脉区和肝实质中同移植物一起被植入受体[9]，几乎相当于一次标准的外周血干细胞输注的量。供肝所带来的免疫活性细胞和多能干细胞，对于使用了免疫抑制剂处于免疫抑制状态的患者来说，相当于接受了一次造血干细胞移植[10]。
在大多数情况下，随着供肝植入的造血干细胞数量并不足够多，加上HLA的不匹配程度很高，使得其（供体细胞）移植入以及重建髓系和红系都十分困难。随着时间的推移，受者的免疫系统会排斥供体淋巴细胞并且最终重新建立完全的宿主嵌合体，因此很难发生GvHD。然而不幸发生GvHD的受者，在供肝中的淋巴细胞数量与外周血中不同，肝脏淋巴细胞存在CD4+与CD8+ T淋巴细胞比例倒置，且CD8+ T淋巴细胞和B淋巴细胞比重较高[11]。随着供肝植入宿主的淋巴细胞通过攻击和消灭宿主的造血干细胞可导致严重的全血细胞减少症。此外，供肝内的多功能干细胞还可移行到宿主的骨髓、脾脏、淋巴结和肺并且增殖分化产生更多的供体源性造血谱系的成熟细胞[12]。患者会有不同程度的发热、皮疹、腹泻、血细胞减少等症状，这些临床症状和体征与初次造血干细胞移植后的临床症状和体征是相同的[10]。
简言之，如果供肝与宿主之间的免疫系统平衡被打破并且供肝占优，那么供肝携带的淋巴细胞就会被激活，逐步导致GvHD。
3 肝移植术后GvHD的分类
在国内外文献报道中，实体器官移植术后GvHD可分为体液性和细胞性两类。①体液性GvHD又称为移植物抗宿主溶血，通常发生在移植术后1～2周，病情较轻且多可自愈，偶有严重贫血患者可输血治疗。其主要表现为溶血、发热。一般是ABO血型不相容所致，随供肝植入的淋巴细胞产生抗宿主红细胞抗体，进而使宿主发生溶血性贫血。②细胞性GvHD就是我们所重点讨论的这一类，通常发生在移植术后2～6周，病情较重且死亡率高，目前尚无统一有效的治疗方案。其主要表现为不同程度的发热、皮疹、腹泻、血细胞减少等。一般认为是供肝内的免疫活性细胞识别宿主体内MHC后增殖分化，并攻击宿主体内含有该MHC的组织和器官（如皮肤、消化道、骨髓等），最终导致宿主发生严重的全身性疾病甚至死亡。一般文献报道中所讨论的肝移植术后GvHD均为细胞性GvHD。
此外，还有人将GvHD分为急性GvHD和慢性GvHD，急性与慢性以100 d为界。最近研究[13]对在造血细胞移植术后GvHD的研究认为，急性和慢性GvHD在病理生理学上是不同的，而且在发病时间线上可能存在重叠，因此相应地修订了急性和慢性GvHD的分类标准，见表 1。在目前，肝移植术后急、慢性GvHD的研究方面较为匮乏，只能适当地借鉴造血细胞移植的经验。不论如何，这也提醒我们，在临床上只靠一般的发病时间和临床特征来警惕GvHD是远远不够的。
表1
急、慢性GvHD的分类
4 肝移植术后GvHD发生的危险因素
肝移植术后GvHD的原因尚未明确，但是有不少因素被认为是危险因素，包括HLA匹配率高、受者年龄大、供受者年龄差大、葡萄糖耐受不良、自身免疫性肝炎、乙醇性肝病、肝细胞癌、移植前输血、移植前免疫抑制治疗、排斥、再次移植以及多器官联合移植[4, 14-17]。目前只有两项关于危险因素的研究是有循证风险分析：Smith等[18]的研究表明，受者年龄≥65岁，供受体年龄差≥40岁以及供受体HLA型的近似匹配是危险因素；Chan等[16]的研究中，葡萄糖耐受不良、自身免疫性肝炎、乙醇性肝病、肝细胞癌以及它们的不同组合为危险因素。值得一提的是，Kamei等[19]研究表明，供体与受体的HLA匹配率越高；越容易发生GvHD，且发病的严重程度也越高。活体肝移植比尸体供肝更易出现HLA配型匹配，更容易发生GvHD [20]，这一点与移植医生对于器官移植的常规认知是有出入的，当更加注意。
5 肝移植术后GvHD的临床表现
肝移植术后GvHD发病通常是在肝移植术后第2～6周[14, 21-22]。常见临床表现包括：发热、皮疹、腹泻和血细胞减少[3, 23-25]。在GvHD发病早期，移植肝的肝功能并不受影响[3, 24-26]，到GvHD发病后期常可因各种严重感染、多器官功能衰竭等导致肝功能出现损害。Akbulut等[2]研究表明，常见临床表现的发生率皮疹为94.2%、发热为66.6%、腹泻为54%、各类血细胞减少为54%，其中各类血细胞减少和腹泻两项被认为与死亡率有重要相关性，累及肠道和骨髓会增加死亡风险；首发症状的发生时间是在肝移植术后（60.6±190.1）d（2~1 865 d），但在该研究中首发症状的发生时间并未列入危险因素，但依然认为术后1个月内发生GvHD的患者死亡率要高得多。
关于常见临床表现的具体描述，不少病例报道中均有提及。然而肝移植术后GvHD的临床表现并无特异性，文献报道中的描述亦无大量病例作为支撑，故无法统一归纳。
6 肝移植术后GvHD的诊断标准与方法
GvHD尚无明确统一的诊断标准。众多文献报道所引用的是Triulzi等[1]提出的3点：①靶器官受累出现特征性临床症状和体征，如皮疹、腹泻、血细胞减少等；②受累器官的组织学检查证据；③受累器官或外周血中存在供体淋巴细胞的HLA或DNA证据。
对于受累器官的组织学检查通常包括皮肤、消化道以及骨髓的活检。由于皮疹发生率高且早，适用于早期诊断，但是特异性低，常需要与药疹、感染等相鉴别[27]。一般认为，若活检中发现表皮基底层呈空泡样改变、苔藓样淋巴细胞浸润、角化不良、嗜酸粒细胞坏死等组织学特征时需高度怀疑GvHD。当发生严重的消化道反应（如呕血、便血）时可行消化道活检，若胃、十二指肠或结肠黏膜活检提示黏膜细胞凋亡并发现供者淋巴细胞浸润者则高度提示为GvHD [28]。
GvHD患者的骨髓分析通常会显示显著的骨髓增生不良而无骨髓发育障碍，流式细胞学检查显示重度骨髓抑制，骨髓嵌合体研究显示供体细胞所占比例高而宿主细胞显著减少，染色体核型分析与供体核型一致[10]。受累器官或外周血中是否有供体淋巴细胞的移入，可以通过嵌合体研究和受体骨髓或外周血PCR检测供体HLA等位基因来确证。为了明确肝移植术后的同种异体细胞，需要一份供肝的DNA样本，若所检测T淋巴细胞数量中供体T淋巴细胞水平超过1%，可认为供体淋巴细胞移入；若外周血中供体CD8+ T淋巴细胞/自然杀伤细胞水平持续升高（>10%）则可能提示GvHD [10]。
Taylor等[29]曾对33例肝移植术后疑似GvHD受者（有皮疹、腹泻、发热、全血细胞减少症等临床表现）进行外周血供体淋巴细胞嵌合体研究（嵌合体一般出现在肝移植术后的最初几周，尤其是第1周，到术后3～4周迅速下降[2]），在受者首次出现临床症状时，他们从受者外周血中提取染色体DNA并用PCR法进行供体HLA等位基因检测，对于有检测到供体HLA等位基因者再行双色流式细胞仪分析，确定其中供体T淋巴细胞比例，结果7例受者外周血中供体HLA等位基因PCR检测阳性，都含有嵌合体且供体T淋巴细胞水平在4%～50%，这7例受者肝功能正常、有皮疹，并且在组织学上通过皮肤、肠道活检佐证了其GvHD诊断；另外26例PCR检测阴性的受者，其中23例最终明确为其他诊断，余下3例快速自发恢复。
Domiati-Saad等[30]的研究建议，应当反复多次对受者行HLA Ⅰ类抗原分型（以纯化的T淋巴细胞用血清学方法）和（或）HLA Ⅱ类抗原分型（以序列特异性引物PCR法，即PCR-SSP法），如果检测到供体HLA，应当用PCR扩增短片段串联重复序列（short tandem repeats，STR）检测行供体T淋巴细胞定量分析，当供体CD3 T淋巴细胞>20%则高度提示急性GvHD，低于20%者应当结合临床分析并监测CD3 T淋巴细胞水平看其是否升高，之后每2周进行STR检测CD3和（或）CD8 T淋巴细胞来监测患者对治疗的反应，如果中性粒细胞计数恢复，那么检测附加种群（尤其是CD15）可能对于辨别造血是宿主源性还是供体源性有所帮助。值得一提的是，PCR-SSP法在检测供体细胞时更加灵敏，但可能对于正常水平的嵌合体太过灵敏了，血清学方法一般能检测到10%以上的水平，而PCR-SSP法可检测到1%左右的水平；另外作者还提出，行STR检测时必须使用纯化的细胞种群，因为大量的受者骨髓细胞可能稀释供体T淋巴细胞，这会给人以供体细胞很少的假象。
Kanehira等[31]的研究提出，当供者与受者为异性时，可以利用性染色体荧光原位杂交分析确诊GvHD，该法快速可靠但存在局限性。而Wu等[32]提出一种新的荧光原位杂交定量检测方法似乎有所突破，在同性间肝移植也有效，一旦这种技术能够在临床上应用，对于动态监测肝移植后细胞嵌合的变化和快速诊断GvHD将大有帮助。
7 肝移植术后GvHD的治疗
虽然有很多文献关于造血干细胞移植或骨髓移植术后GvHD的治疗方案，但是目前对于肝移植术后GvHD的治疗在很大程度上都是经验性的。在现有文献[3, 33-35]中，肝移植术后GvHD最常见的用药方案是：皮质类固醇治疗，减量或停用或增量或更换免疫抑制剂，T淋巴细胞抗体、淋巴细胞表面各类受体的单克隆抗体、静脉注射免疫球蛋白作为免疫支持治疗，以及适当的抗生素治疗抑制感染。但皮质类固醇的使用大多是基于其在同种异体骨髓干细胞移植术后GvHD中的运用，其有溶淋巴细胞和免疫抑制作用，也具有强大的抗炎能力，虽然大剂量激素治疗亦会增加感染风险，但是一般认为联合使用大剂量激素和免疫球蛋白是比较合理的方案。即使如此，Rogulj等[10]的研究结果显示，该联合用药方案并不能改善预后，且可能增加感染风险。
对于有并发症或治疗效果不佳的患者大多数还会使用各种单抗或T淋巴细胞抗体，最常用的有达珠单抗（Zenapax）、巴利昔单抗（Simulect）、莫罗单抗（OKT3）、阿仑单抗（Campath-1H）、英夫利昔单抗（Remicade）、地尼白介素2（Ontak）、利妥昔单抗（Mab thera）、抗胸腺细胞球蛋白（ATG）以及抗淋巴细胞球蛋白。然而据Akbulut等[2]分析，以上这些用药的疗效差异并无统计学意义，且死亡率均相当高。从文献报道看，有些患者对于免疫抑制剂减量疗效良好[34, 36]，有些对于更换免疫抑制剂疗效良好[36-37]，也有些对增加免疫抑制剂疗效良好[33, 35]。但由于缺乏统一的监测方法和标准，各文献报道的切实疗效无从评判，更无法明确统一有效的治疗方案。
除去常规的药物治疗手段，亦有一些团队在其他方向做出了尝试。Gregoire-Gauthier等[38]报道，可使用人类间充质干细胞治疗难治性GvHD，其治疗GvHD的作用机制尚不清楚，不过也为GvHD的治疗指出了新的方向。
8 肝移植术后GvHD的预后
肝移植术后GvHD的预后相当差，文献[2]中提到的死亡率高达75%～91.6%，几乎所有患者都是死于多器官功能衰竭综合征、败血症或者胃肠道出血。值得一提的是，对于判断预后的因素方面也存在不少分歧。Taylor等[29]研究认为皮疹和发热是影响死亡率的危险因素，而Akbulut等[2]的研究则认为骨髓（各系血细胞减少）和肠道受累（腹泻）对死亡率有着重要的影响。
9 肝移植术后GvHD的预防
基于已知的GvHD病理生理机制，一般认为采用耗竭供肝中的T淋巴细胞的方案可行。对尸体供者使用抗淋巴细胞球蛋白，对供肝进行充分灌注，仔细地移除肝周淋巴结甚至离体进行放疗照射，或者以直接针对淋巴细胞表面蛋白的细胞溶解酶单克隆抗体灌注供肝[20, 39]等。然而由于肝移植术后GvHD的发生率较低等原因，这些方案是否行之有效还并不能完全肯定，并且还可能增加其急性排斥的风险。
基于那些可能导致肝移植术后GvHD的危险因素考虑：①供受体HLA匹配率不宜过高，同时应尽量避免HLA纯合子的供体给HLA杂合子的受体，以免HLA纯合子的供体细胞能识别宿主抗原而攻击，而HLA杂合子的宿主细胞不能识别供肝抗原致使自身免疫无法激活[20]。②供受体年龄差异不宜过大。③限制血液制品的应用，并使用洗涤红细胞、白细胞或血小板可能有所益处。有些中心会在给肝移植术后患者输血前常规对红细胞悬浮液进行放射[2]。
10 小结
肝移植术后GvHD发生率低但死亡率极高，目前还多是依靠临床表现来提示GvHD发病，以经验性来治疗。近年来，国内外对于肝移植术后GvHD的文献报道并不多，自2012年以来几乎更是停滞不前，这反映出了研究形势的艰难，更阻碍了移植医生对于该疾病的认知。我们认为，在现有条件下，一方面是要增强诊断意识，另一方面更要积极开展组织活检、HLA分型、嵌合体研究等。妥善收集患者的外周血及骨髓标本，加强各中心之间的研究交流，分享讨论诊治经验。希望在不远的将来，对于肝移植术后GvHD的机制、诊断和治疗均能有所突破。
