引用本文： 刘元, 钱军, 郭晨旭, 承泽农. 茯苓对裸鼠SGC-7901胃癌细胞移植瘤的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(3): 286-290. doi: 10.7507/1007-9424.20160079 复制
胃癌目前仍是最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前临床上胃癌的治疗主要是手术及术后化疗，但基础研究已开始转向于中药方面的研究。茯苓是我国传统中药，具有利水渗湿、养心安神、健脾、抗癌等作用，以往研究发现其对乳腺癌[2]、胰腺癌[3]、喉癌[4]等肿瘤细胞均较敏感。当前国内外就茯苓对胃癌裸鼠移植瘤疗效的研究仍然较少，本实验拟采用SGC-7901胃癌细胞建立裸鼠移植瘤模型，利用免疫组化及Western blot技术，来探究茯苓对移植瘤生长及其对凋亡蛋白等蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂及设备
10只SPF级BALB/c-nu裸鼠购于维通利华实验动物技术有限公司，均为雌性，4周龄，许可证号：SCXK（京）2012-0001；10只雌性新西兰大白兔由蚌埠医学院动物房提供（体质量约为2.0 kg）；SGC-7901胃癌细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。主要试剂：RPMI-1640不完全培养液（含有双抗，青霉素：80 U/mL；链霉素：0.08 mg/mL）、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲液（PBS液）及胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司，兔抗人B细胞淋巴瘤基因-2 （B cell lymphoma 2，Bcl-2） /Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗购于Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG购于BIOSHARP公司，鼠抗人Bax蛋白单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2蛋白单克隆抗体、鼠抗人胱天蛋白酶-3 （Caspase-3）蛋白单克隆抗体、鼠抗人胱天蛋白酶-9 （Caspase-9）蛋白单克隆抗体及鼠抗人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体均购自杭州联科生物股份有限公司，Western试剂盒购自碧云天公司，茯苓由蚌埠医学院第一附属医院中药房提供。主要设备：CX-201型垂直层流工作台（蚌埠净化设备厂）、Thermo 3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）、OLYMPUS CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）、Eppendorf Centrifuge 5810R低温离心机（德国eppen-dorf公司）及LC-20AD高效液相色谱分析仪（日本岛津公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 茯苓汤剂的熬制
称取茯苓10 g，于20 mL蒸馏水内浸泡30 min后，加蒸馏水400 mL煮至150 mL；过滤出药液，再加蒸馏水400 mL煮至150 mL，过滤出药液；将两次煎煮所得药液合并，再次煮至150 mL，药液浓度约为0.2 g/mL。于4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 细胞培养
细胞培养在37 ℃、5% CO2、95%湿度的恒温培养箱中。每隔2天换液1次，当细胞铺满培养瓶底约90%时，予以1∶3传代3次。
1.2.3 裸鼠接种细胞悬液的制备
取对数期生长细胞，以0.25%胰蛋白酶消化液消化3 min，4 ℃离心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min），弃上清液；用PBS液重悬离心后的细胞，取0.1 mL稀释10倍；用0.4%台盼蓝染色后，用血球计数板记数活细胞，当活细胞比例＞95%时，调整细胞浓度至5×106个/mL。
1.2.4 裸鼠移植瘤实验
将10只裸鼠随机分为2组（随机数字表法）：空白对照组和茯苓组，每组5只。将细胞悬液混匀，取0.2 mL接种于裸鼠右腋部偏后方皮下；接种细胞24 h后，茯苓组予以0.5 mL茯苓、空白对照组予以0.5 mL生理盐水灌胃，1次/d。查看裸鼠生长状态和移植瘤的生长情况，测量（第1次测量为间隔5 d，之后每次均是间隔3 d）裸鼠移植瘤的长/短径（a/b），计算瘤体体积V，V=a×b2/2。于第32天处死裸鼠，剥离瘤体，称取瘤体重量，计算抑瘤率，抑瘤率= （空白对照组瘤体平均质量-茯苓组瘤体平均质量）/空白对照组瘤体平均质量×100%。
1.2.5 茯苓对SGC-7901胃癌细胞的影响
将10只新西兰大白兔随机（随机数字表法）均分为空白对照组和茯苓组，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”，用药剂量按如下公式计算：家兔用药量（g/kg • d）=人日用剂量 （g/kg • d）×0.007/1.5。2组大白兔分别给予茯苓和生理盐水 〔14 mL/（kg • d）〕灌胃，每次灌胃前禁食12 h、不禁水，连续灌胃2周，2次/d。末次灌胃后1 h，用1%水合氯醛催眠大白兔（具体量依据大白兔不再挣扎为止），施行无菌心脏采血，4 ℃离心（4 000 r/min，r=17.3 cm，60 min）后收集血清，过滤除菌，用EP管分装，-20 ℃保存。利用高效液相色谱分析法[5]检测血清中所含茯苓的浓度。将胃癌SGC-7901细胞以4 ℃离心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min）后，调整细胞悬液浓度至1×106个/mL，分为2组，分别加入含10%茯苓的血清（因在进行细胞培养的时候所用的培养液是含10%的胎牛血清，所以茯苓组用所取出的含茯苓药物的兔血清来代替正常细胞培养时的胎牛血清）和空白对照组血清（指用生理盐水给予大白兔灌胃后的血清）的细胞培养液5 mL进行培养，于24 h和48 h时提取蛋白。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 免疫组化法检测瘤体组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达
将瘤组织在Carnoy固定液中固定，依次行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋及4 μm厚连续切片。将切片脱蜡水化，于pH=6.0的PBS液中微波加热以修复抗原，用FBS液代替一抗做阴性对照。切片上滴1滴0.3% H2O2溶液，室温下孵育15 min后，用PBS液冲洗5 min×3次；切片上滴加50 μL非免疫性动物血清，常温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL一抗4 ℃过夜后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL二抗，在常温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL三抗，室温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL新配置的DAB液，显微镜下控制发色，自来水冲洗终止显色；行Mayer苏木精复染、脱水透明及中性树胶封片。结果判断如下。①阳性细胞百分比（PP）：在高倍（400倍）显微镜下选择5个不同视野，每个视野计数阳性细胞数2次，计算平均值，为该视野阳性细胞数，阳性细胞数与该视野中细胞总数的比值为PP。然后将5个视野的PP求平均值，作为该切片的PP。无阳性细胞记为0分，PP在10%及以下记为1分，11%～50%记为2分，51%～75%记为3分，＞75%记为4分。②染色强度（SI）：0分为染色阴性，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。将每张切片的PP和SI相乘得到该切片的免疫组化评分（IRS） [6]。
1.3.2 Western-blot法检测胃癌细胞中Bcl-2及Bax的表达
分别在干预24和48 h后提取空白对照组和茯苓组胃癌细胞的蛋白，用BCA蛋白检测方法定量后进行电泳、转膜，分别加入1∶200稀释的Bcl-2/Bax抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后再加入1∶6 000稀释的二抗，4 ℃孵育2 h后洗膜。应用Quantity one软件（Bio-Rad）分析扫描蛋白条带的光密度，取目的蛋白条带的光密度值与相应β-actin光密度值之比值为其相对表达量。每组重复测量3次。
1.4 统计学方法
利用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 茯苓对裸鼠及移植瘤的影响
2组裸鼠一般情况较好，实验过程中无裸鼠死亡。各裸鼠于接种细胞后5 d均可见移植瘤，随后瘤体逐渐增大（图 1）。第32天时，空白对照组〔（2 652.17±225.01） mm3〕 裸鼠的移植瘤体积大于茯苓组 〔（1 247.56±277.23） mm3〕，差异具有统计学意义（P＜0.050），见图 2。处死裸鼠后，完整剥离出瘤体，称瘤体质量，结果空白对照组 〔（2.48±0.21） g〕 裸鼠的瘤体质量大于茯苓组 〔（1.28±0.28） g〕，差异具有统计学意义（P＜0.001）。茯苓的抑瘤率为48.39%。
2.2 2组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达
免疫组化检测结果显示，各蛋白染色为淡黄色、棕黄色、棕褐色不等，均在胞浆内着色（图 3）。茯苓组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2和VEGF的表达均低于空白对照组（P＜0.050），而Bax、Caspase-3及Caspase-9 的表达均高于空白对照组（P＜0.050），见表 1。
表1
2组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达（分，2.3 含药血清干预后SGC-7901胃癌细胞中Bcl-2和Bax的表达
与空白对照组比较，24 h和48 h时茯苓组Bcl-2的表达水平均较低（P＜0.050），且茯苓组48 h时Bcl-2的表达水平低于24 h时（P＜0.050）；与空白对照组比较，24 h时茯苓组Bax的表达水平变化不明显（P＞0.050），但48 h时Bax的表达水平高于空白对照组和24 h茯苓组（P＜0.050），见表 2和图 4。
表2
2组SGC-7901胃癌细胞中Bcl-2和Bax的表达（3 讨论
在基础研究中，中药对肿瘤的治疗受到越来越多的关注，主要原因是其具有有效、副作用低、价廉等优点。随着对中药的不断研究，其抗肿瘤的作用机制也得到进一步的了解，如对溶酶体的影响[7]、诱导肿瘤细胞凋亡[8]、 增强机体免疫系统[9]等。茯苓生于松树根上，分布于我国大部分地区，为我国经典的传统中药，在中医大部分的名方中都有茯苓的配伍，如四君子汤、桂枝茯苓汤、二陈汤等。
在实验中，笔者发现，茯苓对SGC-7901胃癌细胞移植瘤的生长具有明显的抑制作用。笔者进一步从肿瘤组织凋亡相关蛋白及VEGF入手，来研究茯苓对肿瘤生长的抑制机理。细胞凋亡是细胞程序性的死亡，其不仅仅是一种正常生理性过程，还与肿瘤、自身免疫性疾病等[10-11]有一定的关系。细胞凋亡开始是由Bcl-2蛋白家族引发细胞色素c通过膜通透性增加的线粒体，进入细胞质，发生级联反应，随之Caspase-9及Caspase-3被激活，促进细胞凋亡信号的传导，进而引起细胞发生凋亡[12-14]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的重要调节因子，根据功能作用可以分为抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax），抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例最终决定了在线粒体凋亡通路中细胞的死亡或存活[15-17]。Pietrantonio等[18]也证明，卡培他滨（希罗达）可以通过诱导Bax的表达而促进肿瘤细胞死亡。抗凋亡蛋白的过表达常常与肿瘤复发、不良预后及耐药均有一定的关系[19]。Caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶家族，根据其在凋亡级联反应中的作用位置分为起始Caspase（如Caspase-8及9）和效应Caspase（Caspase-3、6及7），其中Caspase-3和Caspase-9对细胞的凋亡起着关键性的作用[20-21]。VEGF也称为血管通透因子，是可以促进血管内皮细胞分裂增殖及新生血管形成的一种蛋白质。肿瘤组织中的血管存在于肿瘤间质中，起着营养肿瘤实质的作用。关于胃癌[22]和宫颈癌[23]的研究表明，癌组织中VEGF的表达高于正常人。一些研究还表明，在实体肿瘤组织内，VEGF的表达与肿瘤进展有着直接的关系[24]，而且在患者预后方面起着重要的作用[25]。本实验结果显示，茯苓组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2和VEGF的表达均低于空白对照组，而Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达均高于空白对照组。该结果提示，茯苓可以抑制Bcl-2表达而诱导Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达，其可以通过改变Bcl-2和Bax的比例而触发线粒体凋亡信号的传导，引起肿瘤细胞凋亡；在体外细胞水平，随着茯苓作用时间的延长，Bcl-2的表达水平逐渐降低，但Bax的表达水平在茯苓作用48 h时才升高较为明显，表明茯苓含药血清可以抑制细胞Bcl-2表达，诱导Bax表达，进一步验证了裸鼠移植瘤免疫组化的结果；此外，茯苓可以抑制移植瘤组织中VEGF的表达，但是否会因此减少肿瘤新生血管的形成，使肿瘤实质得不到血供而抑制肿瘤的发展，本实验尚不确定，笔者下一步将深入研究茯苓作用下VEGF在体内外实验中的表达及其关系。
综上所述，茯苓对移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其作用机理与茯苓促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤VEGF的表达相关。由于目前对于茯苓的研究尚处于基础实验阶段，其确切机理尚待探讨，望不久可以应用于临床治疗。
胃癌目前仍是最常见的恶性肿瘤之一[1]。目前临床上胃癌的治疗主要是手术及术后化疗，但基础研究已开始转向于中药方面的研究。茯苓是我国传统中药，具有利水渗湿、养心安神、健脾、抗癌等作用，以往研究发现其对乳腺癌[2]、胰腺癌[3]、喉癌[4]等肿瘤细胞均较敏感。当前国内外就茯苓对胃癌裸鼠移植瘤疗效的研究仍然较少，本实验拟采用SGC-7901胃癌细胞建立裸鼠移植瘤模型，利用免疫组化及Western blot技术，来探究茯苓对移植瘤生长及其对凋亡蛋白等蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物、主要试剂及设备
10只SPF级BALB/c-nu裸鼠购于维通利华实验动物技术有限公司，均为雌性，4周龄，许可证号：SCXK（京）2012-0001；10只雌性新西兰大白兔由蚌埠医学院动物房提供（体质量约为2.0 kg）；SGC-7901胃癌细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司。主要试剂：RPMI-1640不完全培养液（含有双抗，青霉素：80 U/mL；链霉素：0.08 mg/mL）、0.25%胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲液（PBS液）及胎牛血清（FBS）购于杭州四季青公司，兔抗人B细胞淋巴瘤基因-2 （B cell lymphoma 2，Bcl-2） /Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）一抗购于Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/兔IgG购于BIOSHARP公司，鼠抗人Bax蛋白单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2蛋白单克隆抗体、鼠抗人胱天蛋白酶-3 （Caspase-3）蛋白单克隆抗体、鼠抗人胱天蛋白酶-9 （Caspase-9）蛋白单克隆抗体及鼠抗人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体均购自杭州联科生物股份有限公司，Western试剂盒购自碧云天公司，茯苓由蚌埠医学院第一附属医院中药房提供。主要设备：CX-201型垂直层流工作台（蚌埠净化设备厂）、Thermo 3111型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）、OLYMPUS CKX41倒置显微镜（日本Olympus公司）、Eppendorf Centrifuge 5810R低温离心机（德国eppen-dorf公司）及LC-20AD高效液相色谱分析仪（日本岛津公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 茯苓汤剂的熬制
称取茯苓10 g，于20 mL蒸馏水内浸泡30 min后，加蒸馏水400 mL煮至150 mL；过滤出药液，再加蒸馏水400 mL煮至150 mL，过滤出药液；将两次煎煮所得药液合并，再次煮至150 mL，药液浓度约为0.2 g/mL。于4 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 细胞培养
细胞培养在37 ℃、5% CO2、95%湿度的恒温培养箱中。每隔2天换液1次，当细胞铺满培养瓶底约90%时，予以1∶3传代3次。
1.2.3 裸鼠接种细胞悬液的制备
取对数期生长细胞，以0.25%胰蛋白酶消化液消化3 min，4 ℃离心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min），弃上清液；用PBS液重悬离心后的细胞，取0.1 mL稀释10倍；用0.4%台盼蓝染色后，用血球计数板记数活细胞，当活细胞比例＞95%时，调整细胞浓度至5×106个/mL。
1.2.4 裸鼠移植瘤实验
将10只裸鼠随机分为2组（随机数字表法）：空白对照组和茯苓组，每组5只。将细胞悬液混匀，取0.2 mL接种于裸鼠右腋部偏后方皮下；接种细胞24 h后，茯苓组予以0.5 mL茯苓、空白对照组予以0.5 mL生理盐水灌胃，1次/d。查看裸鼠生长状态和移植瘤的生长情况，测量（第1次测量为间隔5 d，之后每次均是间隔3 d）裸鼠移植瘤的长/短径（a/b），计算瘤体体积V，V=a×b2/2。于第32天处死裸鼠，剥离瘤体，称取瘤体重量，计算抑瘤率，抑瘤率= （空白对照组瘤体平均质量-茯苓组瘤体平均质量）/空白对照组瘤体平均质量×100%。
1.2.5 茯苓对SGC-7901胃癌细胞的影响
将10只新西兰大白兔随机（随机数字表法）均分为空白对照组和茯苓组，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”，用药剂量按如下公式计算：家兔用药量（g/kg • d）=人日用剂量 （g/kg • d）×0.007/1.5。2组大白兔分别给予茯苓和生理盐水 〔14 mL/（kg • d）〕灌胃，每次灌胃前禁食12 h、不禁水，连续灌胃2周，2次/d。末次灌胃后1 h，用1%水合氯醛催眠大白兔（具体量依据大白兔不再挣扎为止），施行无菌心脏采血，4 ℃离心（4 000 r/min，r=17.3 cm，60 min）后收集血清，过滤除菌，用EP管分装，-20 ℃保存。利用高效液相色谱分析法[5]检测血清中所含茯苓的浓度。将胃癌SGC-7901细胞以4 ℃离心（1 000 r/min，r=17.3 cm，5 min）后，调整细胞悬液浓度至1×106个/mL，分为2组，分别加入含10%茯苓的血清（因在进行细胞培养的时候所用的培养液是含10%的胎牛血清，所以茯苓组用所取出的含茯苓药物的兔血清来代替正常细胞培养时的胎牛血清）和空白对照组血清（指用生理盐水给予大白兔灌胃后的血清）的细胞培养液5 mL进行培养，于24 h和48 h时提取蛋白。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 免疫组化法检测瘤体组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达
将瘤组织在Carnoy固定液中固定，依次行梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋及4 μm厚连续切片。将切片脱蜡水化，于pH=6.0的PBS液中微波加热以修复抗原，用FBS液代替一抗做阴性对照。切片上滴1滴0.3% H2O2溶液，室温下孵育15 min后，用PBS液冲洗5 min×3次；切片上滴加50 μL非免疫性动物血清，常温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL一抗4 ℃过夜后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL二抗，在常温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL三抗，室温下放置30 min后，用PBS液洗5 min×3次；切片上滴加50 μL新配置的DAB液，显微镜下控制发色，自来水冲洗终止显色；行Mayer苏木精复染、脱水透明及中性树胶封片。结果判断如下。①阳性细胞百分比（PP）：在高倍（400倍）显微镜下选择5个不同视野，每个视野计数阳性细胞数2次，计算平均值，为该视野阳性细胞数，阳性细胞数与该视野中细胞总数的比值为PP。然后将5个视野的PP求平均值，作为该切片的PP。无阳性细胞记为0分，PP在10%及以下记为1分，11%～50%记为2分，51%～75%记为3分，＞75%记为4分。②染色强度（SI）：0分为染色阴性，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。将每张切片的PP和SI相乘得到该切片的免疫组化评分（IRS） [6]。
1.3.2 Western-blot法检测胃癌细胞中Bcl-2及Bax的表达
分别在干预24和48 h后提取空白对照组和茯苓组胃癌细胞的蛋白，用BCA蛋白检测方法定量后进行电泳、转膜，分别加入1∶200稀释的Bcl-2/Bax抗体，4 ℃孵育过夜，洗膜后再加入1∶6 000稀释的二抗，4 ℃孵育2 h后洗膜。应用Quantity one软件（Bio-Rad）分析扫描蛋白条带的光密度，取目的蛋白条带的光密度值与相应β-actin光密度值之比值为其相对表达量。每组重复测量3次。
1.4 统计学方法
利用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 茯苓对裸鼠及移植瘤的影响
2组裸鼠一般情况较好，实验过程中无裸鼠死亡。各裸鼠于接种细胞后5 d均可见移植瘤，随后瘤体逐渐增大（图 1）。第32天时，空白对照组〔（2 652.17±225.01） mm3〕 裸鼠的移植瘤体积大于茯苓组 〔（1 247.56±277.23） mm3〕，差异具有统计学意义（P＜0.050），见图 2。处死裸鼠后，完整剥离出瘤体，称瘤体质量，结果空白对照组 〔（2.48±0.21） g〕 裸鼠的瘤体质量大于茯苓组 〔（1.28±0.28） g〕，差异具有统计学意义（P＜0.001）。茯苓的抑瘤率为48.39%。
2.2 2组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达
免疫组化检测结果显示，各蛋白染色为淡黄色、棕黄色、棕褐色不等，均在胞浆内着色（图 3）。茯苓组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2和VEGF的表达均低于空白对照组（P＜0.050），而Bax、Caspase-3及Caspase-9 的表达均高于空白对照组（P＜0.050），见表 1。
表1
2组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及VEGF的表达（分，2.3 含药血清干预后SGC-7901胃癌细胞中Bcl-2和Bax的表达
与空白对照组比较，24 h和48 h时茯苓组Bcl-2的表达水平均较低（P＜0.050），且茯苓组48 h时Bcl-2的表达水平低于24 h时（P＜0.050）；与空白对照组比较，24 h时茯苓组Bax的表达水平变化不明显（P＞0.050），但48 h时Bax的表达水平高于空白对照组和24 h茯苓组（P＜0.050），见表 2和图 4。
表2
2组SGC-7901胃癌细胞中Bcl-2和Bax的表达（3 讨论
在基础研究中，中药对肿瘤的治疗受到越来越多的关注，主要原因是其具有有效、副作用低、价廉等优点。随着对中药的不断研究，其抗肿瘤的作用机制也得到进一步的了解，如对溶酶体的影响[7]、诱导肿瘤细胞凋亡[8]、 增强机体免疫系统[9]等。茯苓生于松树根上，分布于我国大部分地区，为我国经典的传统中药，在中医大部分的名方中都有茯苓的配伍，如四君子汤、桂枝茯苓汤、二陈汤等。
在实验中，笔者发现，茯苓对SGC-7901胃癌细胞移植瘤的生长具有明显的抑制作用。笔者进一步从肿瘤组织凋亡相关蛋白及VEGF入手，来研究茯苓对肿瘤生长的抑制机理。细胞凋亡是细胞程序性的死亡，其不仅仅是一种正常生理性过程，还与肿瘤、自身免疫性疾病等[10-11]有一定的关系。细胞凋亡开始是由Bcl-2蛋白家族引发细胞色素c通过膜通透性增加的线粒体，进入细胞质，发生级联反应，随之Caspase-9及Caspase-3被激活，促进细胞凋亡信号的传导，进而引起细胞发生凋亡[12-14]。Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡的重要调节因子，根据功能作用可以分为抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax），抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例最终决定了在线粒体凋亡通路中细胞的死亡或存活[15-17]。Pietrantonio等[18]也证明，卡培他滨（希罗达）可以通过诱导Bax的表达而促进肿瘤细胞死亡。抗凋亡蛋白的过表达常常与肿瘤复发、不良预后及耐药均有一定的关系[19]。Caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶家族，根据其在凋亡级联反应中的作用位置分为起始Caspase（如Caspase-8及9）和效应Caspase（Caspase-3、6及7），其中Caspase-3和Caspase-9对细胞的凋亡起着关键性的作用[20-21]。VEGF也称为血管通透因子，是可以促进血管内皮细胞分裂增殖及新生血管形成的一种蛋白质。肿瘤组织中的血管存在于肿瘤间质中，起着营养肿瘤实质的作用。关于胃癌[22]和宫颈癌[23]的研究表明，癌组织中VEGF的表达高于正常人。一些研究还表明，在实体肿瘤组织内，VEGF的表达与肿瘤进展有着直接的关系[24]，而且在患者预后方面起着重要的作用[25]。本实验结果显示，茯苓组裸鼠移植瘤组织中Bcl-2和VEGF的表达均低于空白对照组，而Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达均高于空白对照组。该结果提示，茯苓可以抑制Bcl-2表达而诱导Bax、Caspase-3及Caspase-9的表达，其可以通过改变Bcl-2和Bax的比例而触发线粒体凋亡信号的传导，引起肿瘤细胞凋亡；在体外细胞水平，随着茯苓作用时间的延长，Bcl-2的表达水平逐渐降低，但Bax的表达水平在茯苓作用48 h时才升高较为明显，表明茯苓含药血清可以抑制细胞Bcl-2表达，诱导Bax表达，进一步验证了裸鼠移植瘤免疫组化的结果；此外，茯苓可以抑制移植瘤组织中VEGF的表达，但是否会因此减少肿瘤新生血管的形成，使肿瘤实质得不到血供而抑制肿瘤的发展，本实验尚不确定，笔者下一步将深入研究茯苓作用下VEGF在体内外实验中的表达及其关系。
综上所述，茯苓对移植瘤的生长具有明显的抑制作用，其作用机理与茯苓促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤VEGF的表达相关。由于目前对于茯苓的研究尚处于基础实验阶段，其确切机理尚待探讨，望不久可以应用于临床治疗。
