引用本文： 涂灿能, 陈建立, 陈俊卯, 王长友, 王晓涛, 张国志. 低分子肝素钙联合曲美他嗪对大鼠急性肠系膜静脉血栓肠道平滑肌的保护作用. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(4): 416-420. doi: 10.7507/1007-9424.20160111 复制
急性肠系膜静脉血栓（AMVT）是外科急重症，近10年来，随着影像学技术的快速发展，早期诊断技术的提高，迅速的外科干预及抗凝治疗等措施，尽管AMVT的死亡率在下降，但病死率仍较高。既往陈建立等[1]建立了AMVT大鼠模型，模拟周围型MVT和中央型MVT的病理生理过程，研究了AMVT肠道微循环障碍和氧自由基变化规律，提出静脉瘀滞性损伤及微循环障碍是造成肠道损伤的主要因素；同时研究了低分子肝素治疗AMVT的病理生理学机理，并对影响AMVT发生、发展及预后的相关因素做了多因素分析。本研究通过建立大鼠AMVT周围型模型，以探讨低分肝素钙（LHC）抗凝基础上联合曲美他嗪在AMVT治疗中对肠道平滑肌的保护作用及其可能的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
曲美他嗪注射液购自天津施维雅公司，LHC购自葛兰素史克（天津）有限公司，丙二醛（MDA）试剂盒、肌酸激酶（CK）试剂盒、考马斯亮蓝检测蛋白试剂盒和三磷酸腺苷（ATP）试剂盒购自南京建成公司。健康雄性SD大鼠购自北京阜康生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组与处理
健康雄性SD大鼠120只，体质量250～300 g，先将大鼠编号（1～120号），应用随机数字表法简单随机抽取大鼠分成3组，每组40只，即LHC组、LHC+曲美他嗪组（LHCT组）和生理盐水组（NS组）。LHC组、LHCT组及NS组均制作AMVT模型，造模成功后，LHC组和LHCT组大鼠于术后0 h给予LHC（30 U/100 g）皮下注射，同时LHCT组大鼠经尾静脉注射曲美他嗪（10 mg/kg），NS组大鼠经皮下注射生理盐水0.2 mL/100 g；每间隔12 h重复给予药物干预，直至术后72 h。
1.2.2 AMVT模型制备
采用结扎8 cm长回肠段肠系膜上静脉及边缘静脉弓的方法建立AMVT模周围型[1]。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 标本采集
大鼠分别均于造模术后6 h、12 h、24 h、48 h及72 h再次开腹，3组SD大鼠分别于造模术后各时相随机抽取8只抽取下腔静脉血3 mL，静置10～20 min，高速离心机（3 500 r/min，r=13.5 cm）离心15 min后，采集血清-80℃保存待检。采集血液标本后，处死大鼠，切取结扎静脉回肠组织样本3份，每份各200 mg，其中2份在冰生理盐水中漂洗，滤纸擦干，称重后-80℃保存待检；另1份经9%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、行HE染色。
1.3.2 血清MDA和CK水平以及回肠组织匀浆液ATP水平检测
均采用ELISA法检测，回肠组织匀浆液中的蛋白浓度用考马斯亮蓝试剂盒进行检测, 操作按照各试剂盒操作说明进行。
1.3.3 回肠组织损伤病理学评分
取HE染色的回肠组织切片，请病理科专科医师在光镜下阅片，并行回肠病理组织损伤病理学评分。参照Mesemeche肠壁层次损伤分级为评分标准[2]：0分，小肠黏膜绒毛正常；1分，黏膜层部分坏死；2分，黏膜层全层坏死；3分，肌层部分坏死；4分，肌层全层坏死。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件。所有数据均以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组大鼠不同时间点血清MDA水平检测结果
3组大鼠血清MDA水平随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点血清MDA水平均明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点的MDA水平又均明显低于NS组，差异也具有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠造模术后不同时相血清MDA水平检测结果（nmol/mL，2.2 各组大鼠不同时间点血清CK水平检测结果
3组大鼠血清CK水平随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点血清CK水平均明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点血清CK水平又均明显低于NS组，差异也具有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠造模术后不同时相血清CK含量检测结果（U/mL，2.3 各组大鼠不同时间点回肠组织中ATP水平检测结果
3组大鼠回肠组织中ATP水平随着时间的延长逐渐降低，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点回肠组织中ATP水平均明显高于LHC组及NS组，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点回肠组织中ATP含量又高于NS组，其差异也有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
各组大鼠造模术后不同时相回肠组织中ATP含量检测结果（μmol/g prot，2.4 各组大鼠不同时间点回肠组织损伤病理学评分结果
参照Mesemeche肠壁层次损伤分级为评分标准，NS组大鼠肠壁组织损伤明显，且随着时间推移渐行性加重，术后24～48 h肠壁部分肌层坏死，术后48～72 h肠壁坏死层达全层，即发生透壁性梗死（图 1）；LHC组肠壁平滑肌部分发生坏死（图 2）；LHCT组肠道平滑肌未发生明显损伤（图 3）。3组大鼠回肠组织损伤病理学评分随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点回肠组织损伤病理学评分明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）, LHC组各时间点回肠组织损伤病理学评分又均明显低于NS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 4。
图1
示NC组造模术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100） 图 2 示LHC组术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100） 图 3 示LHCT组术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100）
表4
各组大鼠造模术后不同时相回肠组织损伤病理学评分结果（分，3 讨论
AMVT为肠缺血性疾病急腹症之一，误诊率高，通常症状与体征不符[3]，AMVT的死亡率虽然有所下降，但病死率仍较高。外科手术是目前临床上影响AMVT患者30 d死亡率最为重要的因素[4]；复发率高，大部分患者腹痛后30 d再次形成血栓的发生率为3%～40%[5]。66.7%的AMVT患者血液呈高凝状态[6]，早期仍以抗凝为首选，因为抗凝治疗可使阻塞的血管再通[7]，阻止肠系膜静脉主干及其分支静脉血栓的进一步扩大蔓延，从而可中止AMVT时肠道静脉血栓的发展。我们发现[1]，不论是绞窄型MVT还是单纯性MVT，早期即可造成肠黏膜脱落坏死。所不同的是，绞窄型MVT发生了肠道平滑肌的坏死，即透壁性梗死，需立即行手术治疗，而单纯性MVT没有发生肠道平滑肌完整性破坏[8]。AMVT时建立侧支循环仅需2～3 d，如果肠道顺利通过2～3 d的侧支建立期，则可不发生透壁性梗死，肠道功能就可以恢复[1]。因此，改善MVT预后的关键是对肠道平滑肌的保护，优化平滑肌细胞能量代谢，增加平滑肌中ATP含量，平滑细胞骨架得以维持，可防止平滑肌能量消耗导致的骨架解聚，若肠道骨架作用减弱，肠壁通透性增大，则可促进肠道细菌移位的发生[9-10]。能不能在肝素抗凝治疗改善肠壁组织局部血供基础上，采用保护肠道平滑肌的干预措施，从而改善预后？
笔者从心肌细胞能量代谢优化的研究中得到启发。曲美他嗪为抗心肌缺血一线能量代谢调节剂，是当前临床上治疗缺血性心肌病的主要药物[11-13]。在心肌细胞能量代谢方面，在缺血心肌中除具有促进葡萄糖完全代谢、抑制心肌细胞脂肪酸β氧化、提高心肌细胞对氧利用、促进葡萄糖氧化供能、增加心肌细胞高能磷酸键的产生和维持心肌存活的作用，曲美他嗪还可作用于部分细胞内代谢相关酶，可减少乳酸脱氢酶的释放[14]，丙酮酸脱氢酶活性，间接加强葡萄糖氧化，减少细胞内的乳酸堆积，减轻细胞内酸中毒[15-16]，可抑制心肌组织中性粒细胞浸润，抑制血小板聚集[17]，对缩小心肌梗塞面积起到有益的作用[18]，减少肌酸磷酸激酶释放，对缺血心肌具有保护作用[14]，并可促进心肌细胞功能的恢复。曲美他嗪还可保护线粒体的正常功能，增加心肌细胞ATP含量[19] 20；减少氧化应激下心肌内及线粒体钙超负荷, 因细胞内钙超载激活中性蛋白酶（CANP），亦可引起细胞骨架断裂、破坏[20-22]。曲美他嗪在不影响血流动力学的情况下可改善缺血心肌能量代谢[23]，改善心肌缺血状态，提高疗效[24]。王健等[25]对家兔缺血再灌注损伤的研究中发现，曲美他嗪可降低血清MDA和CK含量，增加心肌中ATP含量，具有清除自由基对心肌细胞损害的优势，是一种治疗缺血性心肌病应用较为广泛的优化能量代谢剂。
本实验结果发现，LHCT组血清MDA及CK水平以及回肠组织损伤病理学评分均明显低于LHC组（P < 0.05），而回肠组织中ATP水平却明显明显高于LHC组（P < 0.05），提示曲美他嗪可增加AMVT大鼠肠道平滑肌中ATP水平，减少脂质类过氧化反应终产物MDA的含量，减少血液中CK活性，减轻了肠道平滑肌损伤。进而推测，曲美他嗪可能以保护缺血心肌相似的作用机理保护了AMVT大鼠的缺血肠道平滑肌。既往研究[1]发现，肠道平滑肌层出现透壁性梗死常在AMVT发病后2～3 d，AMVT建立侧支循环仅需2～3 d，曲美他嗪在早期治疗AMVT可能会降低肠道穿孔的发生率，而AMVT死亡原因主要为延误诊断的同时肠道平滑肌发生透壁性梗死并发腹膜炎。曲美他嗪在改善肠道平滑肌能量代谢，为肠道平滑肌度过侧支循环代偿期赢得更多的时间，可避免透壁性肠梗死的发生。
综上所述，AMVT早期确诊后，应尽早在使用低分子肝素钙抗凝的同时联合使用曲美他嗪，可改善肠道平滑肌代谢，保护肠道平滑肌，从而避免肠道平滑肌透壁性坏死发生。血管造影可发现栓塞血管周围有侧支循环形成[26]，后期侧支循环得以充分建立[27-28]，因为后期侧支循环建立后，代偿充分者则不发生肠坏死[29]，预防肠穿孔及腹膜炎发生，从而缩短患者的住院时间，减少并发症发生率、病死率及复发率，改善预后。二者联合应用，既增加了肠道缺血平滑肌的血液供应，又优化肠道缺血平滑肌的能量代谢，起到了良好的协同作用。
急性肠系膜静脉血栓（AMVT）是外科急重症，近10年来，随着影像学技术的快速发展，早期诊断技术的提高，迅速的外科干预及抗凝治疗等措施，尽管AMVT的死亡率在下降，但病死率仍较高。既往陈建立等[1]建立了AMVT大鼠模型，模拟周围型MVT和中央型MVT的病理生理过程，研究了AMVT肠道微循环障碍和氧自由基变化规律，提出静脉瘀滞性损伤及微循环障碍是造成肠道损伤的主要因素；同时研究了低分子肝素治疗AMVT的病理生理学机理，并对影响AMVT发生、发展及预后的相关因素做了多因素分析。本研究通过建立大鼠AMVT周围型模型，以探讨低分肝素钙（LHC）抗凝基础上联合曲美他嗪在AMVT治疗中对肠道平滑肌的保护作用及其可能的作用机理。
1 材料与方法
1.1 材料
曲美他嗪注射液购自天津施维雅公司，LHC购自葛兰素史克（天津）有限公司，丙二醛（MDA）试剂盒、肌酸激酶（CK）试剂盒、考马斯亮蓝检测蛋白试剂盒和三磷酸腺苷（ATP）试剂盒购自南京建成公司。健康雄性SD大鼠购自北京阜康生物科技股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 实验动物分组与处理
健康雄性SD大鼠120只，体质量250～300 g，先将大鼠编号（1～120号），应用随机数字表法简单随机抽取大鼠分成3组，每组40只，即LHC组、LHC+曲美他嗪组（LHCT组）和生理盐水组（NS组）。LHC组、LHCT组及NS组均制作AMVT模型，造模成功后，LHC组和LHCT组大鼠于术后0 h给予LHC（30 U/100 g）皮下注射，同时LHCT组大鼠经尾静脉注射曲美他嗪（10 mg/kg），NS组大鼠经皮下注射生理盐水0.2 mL/100 g；每间隔12 h重复给予药物干预，直至术后72 h。
1.2.2 AMVT模型制备
采用结扎8 cm长回肠段肠系膜上静脉及边缘静脉弓的方法建立AMVT模周围型[1]。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 标本采集
大鼠分别均于造模术后6 h、12 h、24 h、48 h及72 h再次开腹，3组SD大鼠分别于造模术后各时相随机抽取8只抽取下腔静脉血3 mL，静置10～20 min，高速离心机（3 500 r/min，r=13.5 cm）离心15 min后，采集血清-80℃保存待检。采集血液标本后，处死大鼠，切取结扎静脉回肠组织样本3份，每份各200 mg，其中2份在冰生理盐水中漂洗，滤纸擦干，称重后-80℃保存待检；另1份经9%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片、行HE染色。
1.3.2 血清MDA和CK水平以及回肠组织匀浆液ATP水平检测
均采用ELISA法检测，回肠组织匀浆液中的蛋白浓度用考马斯亮蓝试剂盒进行检测, 操作按照各试剂盒操作说明进行。
1.3.3 回肠组织损伤病理学评分
取HE染色的回肠组织切片，请病理科专科医师在光镜下阅片，并行回肠病理组织损伤病理学评分。参照Mesemeche肠壁层次损伤分级为评分标准[2]：0分，小肠黏膜绒毛正常；1分，黏膜层部分坏死；2分，黏膜层全层坏死；3分，肌层部分坏死；4分，肌层全层坏死。
1.4 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件。所有数据均以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组大鼠不同时间点血清MDA水平检测结果
3组大鼠血清MDA水平随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点血清MDA水平均明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点的MDA水平又均明显低于NS组，差异也具有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠造模术后不同时相血清MDA水平检测结果（nmol/mL，2.2 各组大鼠不同时间点血清CK水平检测结果
3组大鼠血清CK水平随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点血清CK水平均明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点血清CK水平又均明显低于NS组，差异也具有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠造模术后不同时相血清CK含量检测结果（U/mL，2.3 各组大鼠不同时间点回肠组织中ATP水平检测结果
3组大鼠回肠组织中ATP水平随着时间的延长逐渐降低，各时相间比较差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点回肠组织中ATP水平均明显高于LHC组及NS组，其差异均有统计学意义（P < 0.05）；LHC组各时间点回肠组织中ATP含量又高于NS组，其差异也有统计学意义（P < 0.05）。见表 3。
表3
各组大鼠造模术后不同时相回肠组织中ATP含量检测结果（μmol/g prot，2.4 各组大鼠不同时间点回肠组织损伤病理学评分结果
参照Mesemeche肠壁层次损伤分级为评分标准，NS组大鼠肠壁组织损伤明显，且随着时间推移渐行性加重，术后24～48 h肠壁部分肌层坏死，术后48～72 h肠壁坏死层达全层，即发生透壁性梗死（图 1）；LHC组肠壁平滑肌部分发生坏死（图 2）；LHCT组肠道平滑肌未发生明显损伤（图 3）。3组大鼠回肠组织损伤病理学评分随着时间的延长逐渐升高，各时相间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）；LHCT组各时间点回肠组织损伤病理学评分明显低于LHC组及NS组，差异均有统计学意义（P < 0.05）, LHC组各时间点回肠组织损伤病理学评分又均明显低于NS组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 4。
图1
示NC组造模术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100） 图 2 示LHC组术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100） 图 3 示LHCT组术后72 h结肠组织的病理学改变（HE×100）
表4
各组大鼠造模术后不同时相回肠组织损伤病理学评分结果（分，3 讨论
AMVT为肠缺血性疾病急腹症之一，误诊率高，通常症状与体征不符[3]，AMVT的死亡率虽然有所下降，但病死率仍较高。外科手术是目前临床上影响AMVT患者30 d死亡率最为重要的因素[4]；复发率高，大部分患者腹痛后30 d再次形成血栓的发生率为3%～40%[5]。66.7%的AMVT患者血液呈高凝状态[6]，早期仍以抗凝为首选，因为抗凝治疗可使阻塞的血管再通[7]，阻止肠系膜静脉主干及其分支静脉血栓的进一步扩大蔓延，从而可中止AMVT时肠道静脉血栓的发展。我们发现[1]，不论是绞窄型MVT还是单纯性MVT，早期即可造成肠黏膜脱落坏死。所不同的是，绞窄型MVT发生了肠道平滑肌的坏死，即透壁性梗死，需立即行手术治疗，而单纯性MVT没有发生肠道平滑肌完整性破坏[8]。AMVT时建立侧支循环仅需2～3 d，如果肠道顺利通过2～3 d的侧支建立期，则可不发生透壁性梗死，肠道功能就可以恢复[1]。因此，改善MVT预后的关键是对肠道平滑肌的保护，优化平滑肌细胞能量代谢，增加平滑肌中ATP含量，平滑细胞骨架得以维持，可防止平滑肌能量消耗导致的骨架解聚，若肠道骨架作用减弱，肠壁通透性增大，则可促进肠道细菌移位的发生[9-10]。能不能在肝素抗凝治疗改善肠壁组织局部血供基础上，采用保护肠道平滑肌的干预措施，从而改善预后？
笔者从心肌细胞能量代谢优化的研究中得到启发。曲美他嗪为抗心肌缺血一线能量代谢调节剂，是当前临床上治疗缺血性心肌病的主要药物[11-13]。在心肌细胞能量代谢方面，在缺血心肌中除具有促进葡萄糖完全代谢、抑制心肌细胞脂肪酸β氧化、提高心肌细胞对氧利用、促进葡萄糖氧化供能、增加心肌细胞高能磷酸键的产生和维持心肌存活的作用，曲美他嗪还可作用于部分细胞内代谢相关酶，可减少乳酸脱氢酶的释放[14]，丙酮酸脱氢酶活性，间接加强葡萄糖氧化，减少细胞内的乳酸堆积，减轻细胞内酸中毒[15-16]，可抑制心肌组织中性粒细胞浸润，抑制血小板聚集[17]，对缩小心肌梗塞面积起到有益的作用[18]，减少肌酸磷酸激酶释放，对缺血心肌具有保护作用[14]，并可促进心肌细胞功能的恢复。曲美他嗪还可保护线粒体的正常功能，增加心肌细胞ATP含量[19] 20；减少氧化应激下心肌内及线粒体钙超负荷, 因细胞内钙超载激活中性蛋白酶（CANP），亦可引起细胞骨架断裂、破坏[20-22]。曲美他嗪在不影响血流动力学的情况下可改善缺血心肌能量代谢[23]，改善心肌缺血状态，提高疗效[24]。王健等[25]对家兔缺血再灌注损伤的研究中发现，曲美他嗪可降低血清MDA和CK含量，增加心肌中ATP含量，具有清除自由基对心肌细胞损害的优势，是一种治疗缺血性心肌病应用较为广泛的优化能量代谢剂。
本实验结果发现，LHCT组血清MDA及CK水平以及回肠组织损伤病理学评分均明显低于LHC组（P < 0.05），而回肠组织中ATP水平却明显明显高于LHC组（P < 0.05），提示曲美他嗪可增加AMVT大鼠肠道平滑肌中ATP水平，减少脂质类过氧化反应终产物MDA的含量，减少血液中CK活性，减轻了肠道平滑肌损伤。进而推测，曲美他嗪可能以保护缺血心肌相似的作用机理保护了AMVT大鼠的缺血肠道平滑肌。既往研究[1]发现，肠道平滑肌层出现透壁性梗死常在AMVT发病后2～3 d，AMVT建立侧支循环仅需2～3 d，曲美他嗪在早期治疗AMVT可能会降低肠道穿孔的发生率，而AMVT死亡原因主要为延误诊断的同时肠道平滑肌发生透壁性梗死并发腹膜炎。曲美他嗪在改善肠道平滑肌能量代谢，为肠道平滑肌度过侧支循环代偿期赢得更多的时间，可避免透壁性肠梗死的发生。
综上所述，AMVT早期确诊后，应尽早在使用低分子肝素钙抗凝的同时联合使用曲美他嗪，可改善肠道平滑肌代谢，保护肠道平滑肌，从而避免肠道平滑肌透壁性坏死发生。血管造影可发现栓塞血管周围有侧支循环形成[26]，后期侧支循环得以充分建立[27-28]，因为后期侧支循环建立后，代偿充分者则不发生肠坏死[29]，预防肠穿孔及腹膜炎发生，从而缩短患者的住院时间，减少并发症发生率、病死率及复发率，改善预后。二者联合应用，既增加了肠道缺血平滑肌的血液供应，又优化肠道缺血平滑肌的能量代谢，起到了良好的协同作用。
