引用本文： 梁小芹, 苏勤军. CCR7 和VEGF-D 蛋白在乳腺癌发生发展过程中的表达及意义. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(6): 715-721. doi: 10.7507/1007-9424.20160190 复制
趋化因子受体是一类能够特异性结合趋化因子的G蛋白偶联受体，其中趋化因子受体7（CCR chemokine receptor-7，CCR7）蛋白在多种肿瘤发生过程中有重要作用，并可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移 [1-7] 。血管内皮生长因子D（vascular endo thelial growth factor-D，VEGF-D）蛋白是目前已确认的淋巴管生长因子，在许多肿瘤细胞中VEGF-D蛋白呈高表达，其可诱导肿瘤内或肿瘤周边淋巴管生成和扩张，与肿瘤的淋巴管转移密切相关 [8-10] 。本研究旨在探讨乳腺正常组织、乳腺导管非典型增生组织及乳腺癌组织中CCR7和VEGF-D蛋白的表达情况，进一步明确这两种蛋白在乳腺癌发生发展过程中的意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集兰州军区兰州总医院2005年2月至2013年10月期间经病理学检查证实的乳腺浸润性导管癌标本73例（乳腺癌组）、乳腺导管非典型增生及导管原位癌标本40例（乳腺轻中度导管非典型增生组20例，乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组20例，乳腺重度导管非典型增生与导管原位癌的界限较难界定，两种病变的肌上皮都是完整的，故将两者归为一类），以距乳腺癌组织切缘5 cm以远的正常乳腺组织20例作为对照（正常乳腺组织组，病例来源于乳腺癌组）。患者均为女性，术前均未接受化疗和放疗，且所有病例均经病理学检查确诊，并根据2012年 《WHO乳腺肿瘤分类标准》 [11] 进行分类。乳腺癌组患者均为浸润性导管癌，年龄22～82岁，中位年龄为52岁，其中>45岁者47例，≤45岁者26例；肿瘤直径≤3 cm者36例，>3 cm者37例；临床分期采用1988年国际抗癌联盟（UICC） 提出的TNM分期法 [12] ：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期31例，Ⅳ期12例；组织学分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级30例，Ⅲ级23例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移30例；雌激素受体（ER）阳性46例，阴性27例；孕激素受体（PR）阳性43例，阴性30例；人类表皮生长因子受体2（HER-2）阳性33例，阴性40例。40例乳腺导管非典型增生及导管原位癌患者年龄为35～58岁，中位年龄为45岁。
1.2 主要试剂与设备
CCR7和VEGF-D鼠抗人抗体均为武汉博士德生物公司产品，D2-40购自福建迈新生物技术有限公司，二抗由Roche公司提供。罗氏全自动多功能病理组织检测系统为罗氏公司产品（瑞士），主要设备为BX51正置显微镜（Olympus公司，日本）。
1.3 免疫组化染色
将石蜡包埋的组织制成4 μm厚的切片，使用瑞士罗氏全自动多功能病理组织检测系统进行免疫组化染色，具体步骤如下。①75 ℃烤片4 min，采用专用EZprep将石蜡切片脱蜡。加入修复液CC1 100 μL （碱性），再将独立温控的切片加热板升温到100 ℃以进行高温修复30 min；加入IU INHIBITOR 100 μL，37 ℃孵育4 min；以加样器加入100 μL一抗，切片加热升温到设定的温度（95 ℃），孵育16 min；以加样器加入100 μL HRP UNIVMULT，37 ℃孵育8 min；以加样器同时加入100 μL UV DAB及100 μL UV DABH 2 O 2 ，37 ℃孵育8 min；以加样器加入100 μL UV COPPER，37 ℃孵育4 min；以加样器加入100 μL 苏木精HEMATOXYLIN Ⅱ进行复染，孵育4 min；以加样器加入100 μL反蓝BLUING REAGENT试剂，孵育4 min。②取出切片，用含温和清洁剂的清水涮洗切片。③梯度乙醇脱水。④应用二甲苯对切片透明、封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照，以人结肠癌组织标本作为阳性对照。
1.4 免疫组化结果判断
①CCR7蛋白主要定位于细胞质和（或） 细胞核中，以细胞质和（或）细胞核内出现浅黄色至棕褐色颗粒者判断为阳性 [13] ；VEGF-D蛋白主要分布于细胞质中，以细胞质内出现浅黄色至棕褐色颗粒者判断为阳性 [14] 。参考Shimizu等 [15] 的方法采用双评分半定量法进行评分，高倍镜下（400倍）根据染色强度和阳性细胞所占百分比判定免疫组化结果。染色强度评分标准：不着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。阳性细胞所占比例评定标准：无肿瘤细胞着色，0分；<1/3的肿瘤细胞着色，1分； 1/3～2/3的肿瘤细胞着色，2分；>2/3的肿瘤细胞着色，3分。两种评分之和为最终评分，0～2分为阴性，其余为阳性（3分为弱阳性，4分为中度阳性，5～6分为强阳性）。②微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的判定参考Weidner [16] 的方法：根据D2-40染色结果，以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为1个阳性微淋巴管。先在低倍镜下（40倍）确定5个着色密集的区域（即“hot spot”），再在200倍放大倍数下分别计数5个视野的阳性微淋巴管数，取其均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料的统计分析方法采用Student’s t检验和单因素方差分析（两两比较采用LSD法），计数资料的统计分析方法采用χ 2 检验和趋势χ 2 检验（分析率随分层变化的趋势），相关性分析采用非参数Spearman秩相关和χ 2 检验（计算Pearson列联系数）。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 CCR7蛋白及VEGF-D蛋白的免疫组化染色结果
①免疫组化染色结果显示：CCR7蛋白的阳性颗粒呈棕黄色，以细胞质和（或）细胞核内着色为主。CCR7蛋白在正常乳腺组织中的表达较低或无表达（表 1、图 1A）；乳腺轻中度导管非典型增生组中有 1例呈弱阳性表达（图 1B）；乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组中有6例呈阳性表达，其中4例呈弱阳性，1例呈中度阳性，1例呈强阳性（图 1C）；乳腺癌组中有35例呈阳性表达，其中7例呈弱阳性，12例呈中度阳性，16例呈强阳性（图 1D）。②免疫组 化染色结果显示：VEGF-D蛋白的阳性颗粒呈棕黄色，着色颗粒位于细胞质内。正常乳腺组织组中1例 VEGF-D蛋白呈弱阳性表达（图 2A）；乳腺轻中度导管非典型增生组中有4例呈阳性表达，其中3例呈弱阳性，1例呈中度阳性（图 2B）；乳腺重度导管非典型增生及导管原位癌组中有8例呈阳性表达，其中5例呈弱阳性，1例呈中度阳性，2例呈强阳性（图 2C）；乳腺癌组有42例呈阳性表达，其中10例呈弱阳性，14例呈中度阳性，18例呈强阳性（图 2D）。CCR7蛋白和VEGF-D蛋白在正常乳腺组织、乳腺轻中度导管非典型增生组织、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织及乳腺癌组织中的表达逐渐增强。正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组中CCR7蛋白（χ 趋势2 =23.905，P<0.050）和VEGF-D蛋白（χ 趋势2 =22.349，P<0.050）的表达阳性率逐渐增高（表 1）。
图1
图1 示CCR7蛋白在4种乳腺组织中的表达。1A：在正常乳腺组织中无表达（SP ×400）；1B：在乳腺轻中度导管非典型增生组织中呈弱阳性表达（SP ×200）；1C：在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织中呈强阳性表达（SP ×200）；1D：在乳腺浸润性导管癌组织中呈强阳性表达（SP ×400） 图2 示CCR7蛋白在4种乳腺组织中的表达。2A：在正常乳腺组织中呈弱阳性表达（SP ×400）； 2B：在乳腺轻中度导管非典型增生组织中呈中度阳性表达（SP ×200）；2C：在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织中呈强阳性表达（SP ×400）；2D：在乳腺浸润性导管癌组织中呈强阳性表达（SP ×400） 图3 示4种乳腺组织中D2-40染色的免疫组化结果（SP ×200）。 3A：正常乳腺组织；3B：乳腺轻中度导管非典型增生组织；3C：乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织；3D：乳腺癌组织；3E：乳腺癌组织中，淋巴管内可见癌栓
表1
4组乳腺组织中 CCR7 蛋白及 VEGF-D蛋白的表达〔 例（%）〕
2.2 D2-40的表达及LMVD结果
免疫组化染色结果显示：D2-40阳性表达为淋巴管内皮细胞胞膜和细胞浆呈棕黄色。正常乳腺组织、轻中度导管非典型增生和重度导管非典型增生+导管原位癌组织中，D2-40染色的淋巴管多位于乳腺小叶周边（图 3A～3C），淋巴管形态不规则，管壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，部分管腔扩张，部分呈条索状，部分为几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞；乳腺癌组织中D2-40染色的淋巴管多位于癌周组织，部分管腔呈扩张状态（图 3D），部分淋巴管腔内可见癌栓（图 3E）。正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组的LMVD值分别为2.00±1.02、6.70±3.48、9.01±2.13及16.32±4.07，LMVD值逐渐增高，4组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.050）。此外，在乳腺癌患者中，淋巴结转移组的LMVD值为21.37±3.95，高于无淋巴结转移组的11.96±2.31 （P<0.050）。
2.3 乳腺癌组织中CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达与其临床病理学特征的关系
在乳腺癌患者中，CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达均与临床分期、组织学分级、淋巴结转移及HER-2表达有关（P<0.050），而均与患者的年龄、肿瘤直径、ER表达和PR表达状况无关（P>0.050）。组织学分级越高、临床分期为Ⅲ+Ⅳ期（与Ⅰ+Ⅱ期者相比）、淋巴结转移（与未发生淋巴结转移者相比）及HER-2表达阳性（与HER-2表达阴性者相比）者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达阳性率较高（P<0.050），见表 2。
表2
乳腺癌组织中CCR7 蛋白和VEGF-D 蛋白表达与临床病理特征的关系〔例（%）〕
2.4 乳腺癌组织中CCR7蛋白和VEGF蛋白表达与LMVD值间的关系
淋巴管与乳腺癌的淋巴转移密切相关。在乳腺癌组织中，淋巴管增多者转移的概率增高，其与预后有关；而在其余3类组织中，淋巴管密度增加无重要临床意义，故笔者只探讨了该两种蛋白与LMVD值在乳腺癌组织中的关系。结果显示，在乳腺癌患者中，CCR7阴性组的LMVD值为10.31±1.74，CCR7阳性组为12.81±3.98，2组比较差异无统计学意义（P> 0.050）；VEGF-D阴性组的LMVD值为13.32±2.14，VEGF-D阳性组为20.13±4.89，VEGF-D阳性组的LMVD值较高，2组比较差异有统计学意义（P<0.010）。 相关性分析结果显示，LMVD值和VEGF-D蛋白表达强度之间呈正相关性（r=0.623，P<0.010），而LMVD值与CCR7蛋白表达强度之间的相关性无统计学意义（r=-0.303，P>0.050）。
2.5 乳腺癌组织中CCR7蛋白表达与VEGF-D蛋白表达的相关性
由于正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组及乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组中CCR7蛋白与VEGF-D蛋白表达阳性例数太少，故仅分析了乳腺癌组织中两种蛋白表达的相关性。列联表相关分析结果显示：在乳腺癌组织中，CCR7蛋白表达与VEGF-D蛋白表达间呈弱相关性（r=0.112，P<0.050），见表 3。
表3
乳腺癌组织中CCR7 蛋白表达与VEGF-D 蛋白表达的相关性
3 讨论
趋化因子受体通常表达于免疫细胞和内皮细胞的细胞膜上，与相应的趋化因子结合而发挥作用，其与细胞骨架重排、内皮细胞黏附和细胞定向游动均有关。研究 [17-18] 表明，趋化因子及其受体在肿瘤细胞生长、转移及宿主对肿瘤细胞的免疫方面均发挥极其重要的作用。CCR7蛋白是CCR亚家族中的一个亚类，现已证实它与多种肿瘤的发生有关，且与肿瘤的侵袭及转移均相关 [13, 19-21] 。Müller等 [7] 对12例乳腺癌患者进行了CCR7 mRNA水平检测，并与正常乳腺组织进行比较后发现，乳腺癌组织中其表达量明显增高。朱旬等 [22] 研究发现，乳腺癌组织中CCR7 蛋白的阳性表达率明显高于乳腺纤维腺瘤组织，且其阳性表达与淋巴结转移和临床分期均有关。本组资料结果显示，正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组、乳腺癌组中CCR7蛋白的表达阳性率逐渐增高。这提示CCR7蛋白可能在乳腺肿瘤的早期恶性转化方面发挥一定的作用。另外笔者分析了CCR7蛋白表达与乳腺癌不同临床病理特征的关系，结果发现，CCR7蛋白的表达与组织学分级、临床分期、淋巴结转移及HER-2表达均相关。
VEGF-D蛋白是目前已确定的VEGF家族中的淋巴内皮细胞生长因子。研究 [23-24] 表明，VEGF-D蛋白与肿瘤的发生及转移均有关。Thelen等 [25] 在其建立的鼠肝癌模型的研究中发现，VEGF-D蛋白在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织，且其表达与淋巴结转移有关。Onogawa等 [26] 的研究结果也表明，在结肠癌组织中VEGF-D蛋白的阳性表达率较正常结肠组织升高，并且其表达与淋巴结转移和患者的预后均密切相关。Stacker等 [27] 研究发现，VEGF-D蛋白不但可诱导肿瘤组织内的淋巴管生成，还可加快肿瘤细胞向区域淋巴结扩散。本组资料结果表明，正常乳腺组织组、 乳腺轻中度导管非典型增生组、 乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组中VEGF-D蛋白的表达阳性率逐渐增高，其在正常乳腺组织组中的表达阳性率为5.0%，在乳腺轻中度导管非典型增生组的表达阳性率为20.0%，在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组的表达阳性率为40.0%，而在乳腺癌组中的表达阳性率高达57.5%；此外，淋巴结转移组中VEGF-D蛋白的表达阳性率高于无淋巴结转移组（表 2）。提示随着乳腺病变的演进，VEGF-D蛋白的表达有升高的趋势，进一步表明VEGF-D蛋白在乳腺癌的发生、发展及转移过程中可能起着相当重要的作用。
乳腺癌的转移主要以淋巴管转移为主，关于淋巴管生成的研究 [28] 表明，VEGF-D蛋白可与淋巴管内皮细胞上的血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）结合，使VEGFR-3迅速活化，并引起下游分子She和Grb2磷酸化，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促使淋巴管内皮细胞增生、迁移和存活，从而形成新生的毛细淋巴管。Veikkola等 [29] 证明，VEGF-D蛋白在体内通过旁分泌途径（VEGFR-3信号转导通路）选择性诱导淋巴管生成。本组资料结果显示，VEGF-D蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，而且VEGF-D蛋白的表达与LMVD值呈正相关，提示VEGF-D蛋白参与了乳腺癌淋巴管的生成及淋巴结转移。
为进一步探讨两种蛋白表达与乳腺恶性潜能的关系，笔者分析了两种蛋白表达与乳腺癌临床病理学特征的关系，结果发现，这两种蛋白的表达均与临床分期、组织学分级及淋巴结转移相关，且组织学分级越高、临床分期越晚（Ⅲ+Ⅳ期）、有淋巴结转移者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达阳性率均较高。此外，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白的表达呈弱正相关，提示CCR7蛋白与VEGF-D蛋白在乳腺癌的癌变过程中可能有协同作用。CCR7蛋白也可能间接地参与肿瘤淋巴管的生长，其可能的机理是，肿瘤细胞中CCR7蛋白与相应的趋化因子即基质细胞衍生因子（CCL21）结合激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路，继而激活蛋白激酶B（AKT）通路，使得肿瘤细胞内VEGF-D蛋白表达上调，VEGF-D蛋白与血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合，促进新的内皮细胞分化、增生，形成新的肿瘤淋巴管，加速脉管转移；另外肿瘤细胞内VEGF-D蛋白的高表达增加了肿瘤内部及肿瘤边缘淋巴管的表面积，在乳腺癌细胞分泌的CCR7蛋白的作用下，促使乳腺癌细胞发生游走及定向转移。因此VEGF-D蛋白和CCR7蛋白的过表达，在乳腺癌的发生发展及淋巴结转移中发挥协同促进作用。
综上所述，从正常乳腺组织、乳腺导管非典型增生组织到乳腺癌的发展过程中，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白的表达均升高，两者表达在乳腺癌组织中呈正相关，并且其阳性表达多见于组织学分级差、临床分期晚和淋巴结转移的乳腺癌患者。由此笔者认为，在乳腺癌的发生发展及转移过程中，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白起着非常重要的作用，其可作为判断乳腺癌恶性生物学行为的重要指标，将其作为切入点来设计药物将为乳腺癌的治疗提供新的靶点。
趋化因子受体是一类能够特异性结合趋化因子的G蛋白偶联受体，其中趋化因子受体7（CCR chemokine receptor-7，CCR7）蛋白在多种肿瘤发生过程中有重要作用，并可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和转移 [1-7] 。血管内皮生长因子D（vascular endo thelial growth factor-D，VEGF-D）蛋白是目前已确认的淋巴管生长因子，在许多肿瘤细胞中VEGF-D蛋白呈高表达，其可诱导肿瘤内或肿瘤周边淋巴管生成和扩张，与肿瘤的淋巴管转移密切相关 [8-10] 。本研究旨在探讨乳腺正常组织、乳腺导管非典型增生组织及乳腺癌组织中CCR7和VEGF-D蛋白的表达情况，进一步明确这两种蛋白在乳腺癌发生发展过程中的意义。
1 资料与方法
1.1 研究对象
回顾性收集兰州军区兰州总医院2005年2月至2013年10月期间经病理学检查证实的乳腺浸润性导管癌标本73例（乳腺癌组）、乳腺导管非典型增生及导管原位癌标本40例（乳腺轻中度导管非典型增生组20例，乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组20例，乳腺重度导管非典型增生与导管原位癌的界限较难界定，两种病变的肌上皮都是完整的，故将两者归为一类），以距乳腺癌组织切缘5 cm以远的正常乳腺组织20例作为对照（正常乳腺组织组，病例来源于乳腺癌组）。患者均为女性，术前均未接受化疗和放疗，且所有病例均经病理学检查确诊，并根据2012年 《WHO乳腺肿瘤分类标准》 [11] 进行分类。乳腺癌组患者均为浸润性导管癌，年龄22～82岁，中位年龄为52岁，其中>45岁者47例，≤45岁者26例；肿瘤直径≤3 cm者36例，>3 cm者37例；临床分期采用1988年国际抗癌联盟（UICC） 提出的TNM分期法 [12] ：Ⅰ期8例，Ⅱ期22例，Ⅲ期31例，Ⅳ期12例；组织学分级：Ⅰ级20例，Ⅱ级30例，Ⅲ级23例；淋巴结转移43例，无淋巴结转移30例；雌激素受体（ER）阳性46例，阴性27例；孕激素受体（PR）阳性43例，阴性30例；人类表皮生长因子受体2（HER-2）阳性33例，阴性40例。40例乳腺导管非典型增生及导管原位癌患者年龄为35～58岁，中位年龄为45岁。
1.2 主要试剂与设备
CCR7和VEGF-D鼠抗人抗体均为武汉博士德生物公司产品，D2-40购自福建迈新生物技术有限公司，二抗由Roche公司提供。罗氏全自动多功能病理组织检测系统为罗氏公司产品（瑞士），主要设备为BX51正置显微镜（Olympus公司，日本）。
1.3 免疫组化染色
将石蜡包埋的组织制成4 μm厚的切片，使用瑞士罗氏全自动多功能病理组织检测系统进行免疫组化染色，具体步骤如下。①75 ℃烤片4 min，采用专用EZprep将石蜡切片脱蜡。加入修复液CC1 100 μL （碱性），再将独立温控的切片加热板升温到100 ℃以进行高温修复30 min；加入IU INHIBITOR 100 μL，37 ℃孵育4 min；以加样器加入100 μL一抗，切片加热升温到设定的温度（95 ℃），孵育16 min；以加样器加入100 μL HRP UNIVMULT，37 ℃孵育8 min；以加样器同时加入100 μL UV DAB及100 μL UV DABH 2 O 2 ，37 ℃孵育8 min；以加样器加入100 μL UV COPPER，37 ℃孵育4 min；以加样器加入100 μL 苏木精HEMATOXYLIN Ⅱ进行复染，孵育4 min；以加样器加入100 μL反蓝BLUING REAGENT试剂，孵育4 min。②取出切片，用含温和清洁剂的清水涮洗切片。③梯度乙醇脱水。④应用二甲苯对切片透明、封片。以PBS液代替一抗作为阴性对照，以人结肠癌组织标本作为阳性对照。
1.4 免疫组化结果判断
①CCR7蛋白主要定位于细胞质和（或） 细胞核中，以细胞质和（或）细胞核内出现浅黄色至棕褐色颗粒者判断为阳性 [13] ；VEGF-D蛋白主要分布于细胞质中，以细胞质内出现浅黄色至棕褐色颗粒者判断为阳性 [14] 。参考Shimizu等 [15] 的方法采用双评分半定量法进行评分，高倍镜下（400倍）根据染色强度和阳性细胞所占百分比判定免疫组化结果。染色强度评分标准：不着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分。阳性细胞所占比例评定标准：无肿瘤细胞着色，0分；<1/3的肿瘤细胞着色，1分； 1/3～2/3的肿瘤细胞着色，2分；>2/3的肿瘤细胞着色，3分。两种评分之和为最终评分，0～2分为阴性，其余为阳性（3分为弱阳性，4分为中度阳性，5～6分为强阳性）。②微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）的判定参考Weidner [16] 的方法：根据D2-40染色结果，以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为1个阳性微淋巴管。先在低倍镜下（40倍）确定5个着色密集的区域（即“hot spot”），再在200倍放大倍数下分别计数5个视野的阳性微淋巴管数，取其均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料的统计分析方法采用Student’s t检验和单因素方差分析（两两比较采用LSD法），计数资料的统计分析方法采用χ 2 检验和趋势χ 2 检验（分析率随分层变化的趋势），相关性分析采用非参数Spearman秩相关和χ 2 检验（计算Pearson列联系数）。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 CCR7蛋白及VEGF-D蛋白的免疫组化染色结果
①免疫组化染色结果显示：CCR7蛋白的阳性颗粒呈棕黄色，以细胞质和（或）细胞核内着色为主。CCR7蛋白在正常乳腺组织中的表达较低或无表达（表 1、图 1A）；乳腺轻中度导管非典型增生组中有 1例呈弱阳性表达（图 1B）；乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组中有6例呈阳性表达，其中4例呈弱阳性，1例呈中度阳性，1例呈强阳性（图 1C）；乳腺癌组中有35例呈阳性表达，其中7例呈弱阳性，12例呈中度阳性，16例呈强阳性（图 1D）。②免疫组 化染色结果显示：VEGF-D蛋白的阳性颗粒呈棕黄色，着色颗粒位于细胞质内。正常乳腺组织组中1例 VEGF-D蛋白呈弱阳性表达（图 2A）；乳腺轻中度导管非典型增生组中有4例呈阳性表达，其中3例呈弱阳性，1例呈中度阳性（图 2B）；乳腺重度导管非典型增生及导管原位癌组中有8例呈阳性表达，其中5例呈弱阳性，1例呈中度阳性，2例呈强阳性（图 2C）；乳腺癌组有42例呈阳性表达，其中10例呈弱阳性，14例呈中度阳性，18例呈强阳性（图 2D）。CCR7蛋白和VEGF-D蛋白在正常乳腺组织、乳腺轻中度导管非典型增生组织、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织及乳腺癌组织中的表达逐渐增强。正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组中CCR7蛋白（χ 趋势2 =23.905，P<0.050）和VEGF-D蛋白（χ 趋势2 =22.349，P<0.050）的表达阳性率逐渐增高（表 1）。
图1
图1 示CCR7蛋白在4种乳腺组织中的表达。1A：在正常乳腺组织中无表达（SP ×400）；1B：在乳腺轻中度导管非典型增生组织中呈弱阳性表达（SP ×200）；1C：在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织中呈强阳性表达（SP ×200）；1D：在乳腺浸润性导管癌组织中呈强阳性表达（SP ×400） 图2 示CCR7蛋白在4种乳腺组织中的表达。2A：在正常乳腺组织中呈弱阳性表达（SP ×400）； 2B：在乳腺轻中度导管非典型增生组织中呈中度阳性表达（SP ×200）；2C：在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织中呈强阳性表达（SP ×400）；2D：在乳腺浸润性导管癌组织中呈强阳性表达（SP ×400） 图3 示4种乳腺组织中D2-40染色的免疫组化结果（SP ×200）。 3A：正常乳腺组织；3B：乳腺轻中度导管非典型增生组织；3C：乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组织；3D：乳腺癌组织；3E：乳腺癌组织中，淋巴管内可见癌栓
表1
4组乳腺组织中 CCR7 蛋白及 VEGF-D蛋白的表达〔 例（%）〕
2.2 D2-40的表达及LMVD结果
免疫组化染色结果显示：D2-40阳性表达为淋巴管内皮细胞胞膜和细胞浆呈棕黄色。正常乳腺组织、轻中度导管非典型增生和重度导管非典型增生+导管原位癌组织中，D2-40染色的淋巴管多位于乳腺小叶周边（图 3A～3C），淋巴管形态不规则，管壁薄，管壁无平滑肌，管腔内偶见淋巴细胞，部分管腔扩张，部分呈条索状，部分为几个内皮细胞构成的细胞簇，甚至单个内皮细胞；乳腺癌组织中D2-40染色的淋巴管多位于癌周组织，部分管腔呈扩张状态（图 3D），部分淋巴管腔内可见癌栓（图 3E）。正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组的LMVD值分别为2.00±1.02、6.70±3.48、9.01±2.13及16.32±4.07，LMVD值逐渐增高，4组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.050）。此外，在乳腺癌患者中，淋巴结转移组的LMVD值为21.37±3.95，高于无淋巴结转移组的11.96±2.31 （P<0.050）。
2.3 乳腺癌组织中CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达与其临床病理学特征的关系
在乳腺癌患者中，CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达均与临床分期、组织学分级、淋巴结转移及HER-2表达有关（P<0.050），而均与患者的年龄、肿瘤直径、ER表达和PR表达状况无关（P>0.050）。组织学分级越高、临床分期为Ⅲ+Ⅳ期（与Ⅰ+Ⅱ期者相比）、淋巴结转移（与未发生淋巴结转移者相比）及HER-2表达阳性（与HER-2表达阴性者相比）者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达阳性率较高（P<0.050），见表 2。
表2
乳腺癌组织中CCR7 蛋白和VEGF-D 蛋白表达与临床病理特征的关系〔例（%）〕
2.4 乳腺癌组织中CCR7蛋白和VEGF蛋白表达与LMVD值间的关系
淋巴管与乳腺癌的淋巴转移密切相关。在乳腺癌组织中，淋巴管增多者转移的概率增高，其与预后有关；而在其余3类组织中，淋巴管密度增加无重要临床意义，故笔者只探讨了该两种蛋白与LMVD值在乳腺癌组织中的关系。结果显示，在乳腺癌患者中，CCR7阴性组的LMVD值为10.31±1.74，CCR7阳性组为12.81±3.98，2组比较差异无统计学意义（P> 0.050）；VEGF-D阴性组的LMVD值为13.32±2.14，VEGF-D阳性组为20.13±4.89，VEGF-D阳性组的LMVD值较高，2组比较差异有统计学意义（P<0.010）。 相关性分析结果显示，LMVD值和VEGF-D蛋白表达强度之间呈正相关性（r=0.623，P<0.010），而LMVD值与CCR7蛋白表达强度之间的相关性无统计学意义（r=-0.303，P>0.050）。
2.5 乳腺癌组织中CCR7蛋白表达与VEGF-D蛋白表达的相关性
由于正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组及乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组中CCR7蛋白与VEGF-D蛋白表达阳性例数太少，故仅分析了乳腺癌组织中两种蛋白表达的相关性。列联表相关分析结果显示：在乳腺癌组织中，CCR7蛋白表达与VEGF-D蛋白表达间呈弱相关性（r=0.112，P<0.050），见表 3。
表3
乳腺癌组织中CCR7 蛋白表达与VEGF-D 蛋白表达的相关性
3 讨论
趋化因子受体通常表达于免疫细胞和内皮细胞的细胞膜上，与相应的趋化因子结合而发挥作用，其与细胞骨架重排、内皮细胞黏附和细胞定向游动均有关。研究 [17-18] 表明，趋化因子及其受体在肿瘤细胞生长、转移及宿主对肿瘤细胞的免疫方面均发挥极其重要的作用。CCR7蛋白是CCR亚家族中的一个亚类，现已证实它与多种肿瘤的发生有关，且与肿瘤的侵袭及转移均相关 [13, 19-21] 。Müller等 [7] 对12例乳腺癌患者进行了CCR7 mRNA水平检测，并与正常乳腺组织进行比较后发现，乳腺癌组织中其表达量明显增高。朱旬等 [22] 研究发现，乳腺癌组织中CCR7 蛋白的阳性表达率明显高于乳腺纤维腺瘤组织，且其阳性表达与淋巴结转移和临床分期均有关。本组资料结果显示，正常乳腺组织组、乳腺轻中度导管非典型增生组、乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组、乳腺癌组中CCR7蛋白的表达阳性率逐渐增高。这提示CCR7蛋白可能在乳腺肿瘤的早期恶性转化方面发挥一定的作用。另外笔者分析了CCR7蛋白表达与乳腺癌不同临床病理特征的关系，结果发现，CCR7蛋白的表达与组织学分级、临床分期、淋巴结转移及HER-2表达均相关。
VEGF-D蛋白是目前已确定的VEGF家族中的淋巴内皮细胞生长因子。研究 [23-24] 表明，VEGF-D蛋白与肿瘤的发生及转移均有关。Thelen等 [25] 在其建立的鼠肝癌模型的研究中发现，VEGF-D蛋白在肝癌组织中的阳性表达率明显高于正常肝组织，且其表达与淋巴结转移有关。Onogawa等 [26] 的研究结果也表明，在结肠癌组织中VEGF-D蛋白的阳性表达率较正常结肠组织升高，并且其表达与淋巴结转移和患者的预后均密切相关。Stacker等 [27] 研究发现，VEGF-D蛋白不但可诱导肿瘤组织内的淋巴管生成，还可加快肿瘤细胞向区域淋巴结扩散。本组资料结果表明，正常乳腺组织组、 乳腺轻中度导管非典型增生组、 乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组及乳腺癌组中VEGF-D蛋白的表达阳性率逐渐增高，其在正常乳腺组织组中的表达阳性率为5.0%，在乳腺轻中度导管非典型增生组的表达阳性率为20.0%，在乳腺重度导管非典型增生+导管原位癌组的表达阳性率为40.0%，而在乳腺癌组中的表达阳性率高达57.5%；此外，淋巴结转移组中VEGF-D蛋白的表达阳性率高于无淋巴结转移组（表 2）。提示随着乳腺病变的演进，VEGF-D蛋白的表达有升高的趋势，进一步表明VEGF-D蛋白在乳腺癌的发生、发展及转移过程中可能起着相当重要的作用。
乳腺癌的转移主要以淋巴管转移为主，关于淋巴管生成的研究 [28] 表明，VEGF-D蛋白可与淋巴管内皮细胞上的血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）结合，使VEGFR-3迅速活化，并引起下游分子She和Grb2磷酸化，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促使淋巴管内皮细胞增生、迁移和存活，从而形成新生的毛细淋巴管。Veikkola等 [29] 证明，VEGF-D蛋白在体内通过旁分泌途径（VEGFR-3信号转导通路）选择性诱导淋巴管生成。本组资料结果显示，VEGF-D蛋白在乳腺癌组织中呈高表达，而且VEGF-D蛋白的表达与LMVD值呈正相关，提示VEGF-D蛋白参与了乳腺癌淋巴管的生成及淋巴结转移。
为进一步探讨两种蛋白表达与乳腺恶性潜能的关系，笔者分析了两种蛋白表达与乳腺癌临床病理学特征的关系，结果发现，这两种蛋白的表达均与临床分期、组织学分级及淋巴结转移相关，且组织学分级越高、临床分期越晚（Ⅲ+Ⅳ期）、有淋巴结转移者CCR7蛋白和VEGF-D蛋白的表达阳性率均较高。此外，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白的表达呈弱正相关，提示CCR7蛋白与VEGF-D蛋白在乳腺癌的癌变过程中可能有协同作用。CCR7蛋白也可能间接地参与肿瘤淋巴管的生长，其可能的机理是，肿瘤细胞中CCR7蛋白与相应的趋化因子即基质细胞衍生因子（CCL21）结合激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）通路，继而激活蛋白激酶B（AKT）通路，使得肿瘤细胞内VEGF-D蛋白表达上调，VEGF-D蛋白与血管内皮生长因子受体（VEGFR）结合，促进新的内皮细胞分化、增生，形成新的肿瘤淋巴管，加速脉管转移；另外肿瘤细胞内VEGF-D蛋白的高表达增加了肿瘤内部及肿瘤边缘淋巴管的表面积，在乳腺癌细胞分泌的CCR7蛋白的作用下，促使乳腺癌细胞发生游走及定向转移。因此VEGF-D蛋白和CCR7蛋白的过表达，在乳腺癌的发生发展及淋巴结转移中发挥协同促进作用。
综上所述，从正常乳腺组织、乳腺导管非典型增生组织到乳腺癌的发展过程中，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白的表达均升高，两者表达在乳腺癌组织中呈正相关，并且其阳性表达多见于组织学分级差、临床分期晚和淋巴结转移的乳腺癌患者。由此笔者认为，在乳腺癌的发生发展及转移过程中，CCR7蛋白与VEGF-D蛋白起着非常重要的作用，其可作为判断乳腺癌恶性生物学行为的重要指标，将其作为切入点来设计药物将为乳腺癌的治疗提供新的靶点。
