引用本文： 陈洁, 吕青, 王竹, 杜正贵, 谭秋文, 王强, 曾荷淋. 乳腺癌分子病理学指标分布的异质性. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(6): 761-765. doi: 10.7507/1007-9424.20160200 复制
乳腺癌是欧美国家女性最常见的恶性肿瘤，近20年在我国其发病率也呈持续上升态势，目前已跃居部分城市女性恶性肿瘤的第一位[1]。30年来，随着乳腺癌研究的深入，手术、放疗、细胞毒药物治疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等综合治疗手段的广泛使用，乳腺癌患者的生存率已得到了明显的提高[2]。特别是随着内分泌治疗和基因靶向治疗被成功应用于乳腺癌的治疗之后，乳腺癌的疗效得到了非常显著的提高，患者的生活质量也得到较大改善[3]。然而不是每一种乳腺癌都适合上述所有的治疗方法，需要根据肿瘤不同的分子类型，选择不同的、有针对性的治疗方法。Perou等[4]在2000年首 先提出了乳腺癌的分子分型并在2011年的St.Gallen会议上得到公认，该方法根据患者雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor， PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）及增殖细胞核抗原Ki-67的表达情况，将乳腺癌分成四种类型，以指导乳腺癌的个体化治疗及预后判断。因此，2007年美国病理学会的指南明确要求以上四个指标是乳腺癌病理报告中必不可少的内容[5]。由于这四个指标的准确检测具有举足轻重的作用，若有偏差可能会导致治疗方案发生颠覆性的变化，严重影响患者的治疗结局，所以对其准确检测是非常重要的。然而，Moeder等[6]将669例乳腺癌病理标本重新切片后进行ER及PR检测，发现同以前的病理报告相比，ER的一致性只有0.75，而PR的一致性也只有0.86。在不少临床试验中，虽然对ER的检测进行了严格地规定和监测，但研究者[7]仍然发现，对于ER （-） 的患者，仍然有5%～8%的患者对内分泌治疗有效。因此推测在日常的诊治中，有一部分本来是ER （+）的患者，被误诊为ER （-），而且这个误诊的比例还并不完全清楚。其原因一方面可以归咎为肿瘤取材、固定、染色试剂等多方面因素的影响，但是随着免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）全封闭自动化检测系统越来越广泛的应用和取材固定操作越来越规范，其影响检测结果的可能性也就越来越小。另一方面，常规病理切片要想精确、全面地判断不一定均匀性分布的肿瘤分子指标/标志物是非常困难的，因而，肿瘤的异质性（heterogeneity）成为了人们关注的、影响常规肿瘤病理切片检测结果的最重要的因素。现就乳腺癌分子病理学指标分布的异质性做一综述。
1 人体实性肿瘤的异质性
肿瘤的异质性系指在同一肿瘤内，由于肿瘤细胞系不同而造成肿瘤细胞特质的差异[8]。肿瘤最初是在组织学方面被发现存在异质性，后来又发现在抗原性、免疫性、激素受体、代谢性、生长速度、对化学药物的敏感性等方面均存在异质性[9]。且有研 究[10]表明，肿瘤内部构造非常复杂，在不同区域其血管构成、间质成分也不尽相同，也存在异质性。据此Yarbro [11]甚至认为，所有的肿瘤均可被视为“混合”瘤。
几乎所有的上皮性肿瘤都存在异质性。有研究者[12]估计，在肺癌组织中有高达66%的肿瘤会表现出异质性。李岩磊等[13]检测了肺癌细胞中CD44的分布，结果提示肺癌细胞存在异质性。胃癌存在异质性的比例也较高，刘丽江等[14]的研究表明，在胃癌组织的同一张切片里出现两种及以上类型的癌细胞的比例高达58.7%。Gerlinger等[15]的研究也显示，在肾癌患者中，“预后良好”的基因谱与“预后不良”的基因谱可以出现在同一患者肿瘤的不同位点。于丹等[16]原代培养了人喉癌细胞，将单细胞进行体外克隆，分离喉癌细胞亚群，并进行了形态学、功能状态、分化增殖能力、裸鼠异体移植成瘤能力等指标的检测，也证实了喉癌细胞存在异质性。Arnerlöv等[17]对处于乳腺癌瘤体内不同部位的DNA倍体状态进行了研究，发现转移潜能较大的亚群较转移潜能较小的亚群更具有异质性。田海梅等[18]将乳腺癌细胞系MCF-27亚群培养后，也发现乳腺癌细胞在DNA含量和细胞周期时相分布方面存在异质性。许健等[19]更是利用Percoll不连续密度梯度技术，将MCF-7细胞分离成了5个具有异质性的亚群，因此进一步证实了乳腺癌也存在异质性。
2 乳腺癌分子病理学指标的异质性
癌细胞的分子病理学指标是肿瘤诊断、治疗和预后判断中非常重要的指标。这些指标的异质性可以导致在同一个患者的同一个肿瘤中，不同位置的肿瘤细胞有着阴性或阳性两种截然不同的表达；甚至在同一张病理切片中也存在显色的差异、肿瘤细胞染色强弱不等及阳性范围的不同，从而在显微镜下形成斑点状着色（patchy staining） [20]。龚西騟等[21]在1992年开展了乳腺癌肿瘤标本连续切片研究，发现多种抗乳腺癌单克隆抗体在肿瘤组织中的分布呈现明显的异质性，其主要表现为：①在阳性染色的癌巢内或邻近区域，可见染色阴性的癌细胞，二者分布互相连续或交叉，构成斑块状染色图案；②强阳性和弱阳性的癌细胞也呈交叉分布。
早在1978年，Tilley等[22]就发现ER在乳腺癌组织中的分布存在着异质性。Taylor等[23]也通过实验发现，ER在分布、染色强度以及定位诸方面均存在着异质性，因此认为大多数乳腺癌是由各种不同比例的ER阳性和ER阴性细胞群体所构成。Chung等[24]的研究也证实：由于ER的分布存在异质性，导致空芯针穿刺活检（the core needle biopsy，CNB）结果同术后标本结果的符合率只有75%；通过计算显示，对于1个体积为1 cm3的乳腺癌组织，1张标准的一般病理切片（一般为10 mm×10 mm×5 μm大）只能代表整个肿瘤组织的0.05%区域的情况，因此，1张或几张任选的切片并不能完全代表整个肿瘤的ER状况；同时，该研究者还发现，在同一个标本中，不同部位的ER的一致性很差，能够达到一致的比例最高才只有22%；而且在肿瘤组织中，还存在ER （+） 细胞聚集的情况。其他的研究者[25-27]也发现，在乳腺癌组织中，约有17%～40%组织的ER分布具有不均匀性。Douglas-Jones等[28]的研究更是表明，乳腺癌从外周向中心，其ER的阳性率逐渐降低，下降的比例是2%/mm。也就是说，如果是1个直径为 20mm的肿瘤，从边缘到中心其ER阳性率的下降比率为20%。因此取材部位的不同，会严重影响对肿瘤ER结果的真实判断，甚至导致结果从ER （+）变为ER （-）。
Chen等[29]的研究也提示，HER-2在乳腺癌组织中的分布也具有异质性。而Lehmann等[30]更是使用激光显微镜切割技术，精确地分割出了每个乳腺癌肿瘤细胞，并进行实时定量（real-time）的多聚酶链聚合反应（polymerase chain reaction）检测，其结果显示HER-2基因在肿瘤组织中的分布存在异质性。Ohlschlegel等[31]的研究表明，HER-2的异质率约为14.7%，且在HER-2 （2+） 的标本中最明显。Seol等[32]的研究更是将HER-2的异质性分为了瘤内分布的异质性和基因扩增的异质性，其中瘤内分布的异质性约占18%，且在激素受体阳性的患者中更明显。此外，PR及Ki-67在乳腺癌组织中的分布中也被证实存在异质性[6, 33-34]。
由此可见，现有的乳腺癌最基本的分子分型指标ER、PR、HER-2及Ki-67，在肿瘤组织中的分布都存在异质性。
3 乳腺癌分子病理学指标异质性的成因
造成肿瘤异质性的原因有很多。现在有学者[35]认为是肿瘤发生之后，自原发的区域开始，随着不断向四周特别是深层的扩展，肿瘤亦不断演变，导致异质性。在肿瘤发生的不同阶段，宿主对肿瘤发生不同的反应，同时又有新的基因参与细胞的活动，从而可能使肿瘤细胞表现出不同的生物学特征。Bryne [10]报道，口腔鳞状细胞癌（OSCC）浸润区的细胞同中心区的细胞相比，其分化程度更低。Riviére等[36]也发现，在口腔颌面部和外阴部的鳞状细胞癌中，深层浸润区C-myc mRNA的表达水平高于肿瘤表面区。有学者[37-38]认为，大多数肿瘤是单克隆起源，但是其生长过程中的亚组分化导致了异质性的发生。亚群细胞在形态、增殖能力、成瘤性、DNA相对含量及克隆能力方面均存在异质性[39]。
如今，有两种关于肿瘤异质性成因的假说得到多数学者的认可[39-44]。一种是干细胞学说，该假说认为肿瘤实际上是由一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞，及其产生的分化程度不同的细胞团组成。肿瘤干细胞的不对称分裂，产生细胞质和细胞器的不均匀分布，从而导致肿瘤存在异质性。另一种克隆进化论假说则认为，肿瘤的异质性是由于由单个细胞形成的肿瘤细胞群，在发展的过程中发生突变，引起肿瘤细胞遗传水平和表型上的多样性和异质性。肿瘤新发生时所携带的突变较少，但在肿瘤发展过程中突变会逐步积累，进而导致异质性逐渐变得更加明显。如今这两种假说孰是孰非还没有定论，有待进一步的研究加以证实。
4 乳腺癌分子病理学指标异质性的影响
ER、PR、Ki-67及HER-2这四种指标在乳腺癌的诊断、治疗及预后判断方面都具有非常重要的作用，但是这些指标的异质性，会给其检测结果带来较大的影响。
4.1 对彩超引导下的乳腺肿瘤CNB的影响
由于CNB能提供足够的组织学标本并进行IHC检测，具有诊断准确、创伤小、价格便宜等优点[45]， 被公认为是乳腺癌诊断治疗的标准流程之一，广泛应用于临床。同时随着乳腺癌术前新辅助治疗的广泛应用，CNB穿刺的标本不光能提供IHC的结果，指导术前新辅助治疗方案的选择，而且对于新辅助治疗后达病理完全缓解（pathologic complete response，PCR）的患者来说，新辅助治疗前的CNB标本是其乳腺癌的唯一病理学证据，因此CNB更对这类患者的整个治疗方案起着决定性作用。如今在欧美国家及我国的大多数乳腺中心，CNB是术前必备的一种检查方法。现已有很多研究[46-50]证实了CNB对乳腺癌病理类型诊断的准确性，其结果和手术完整切除标本（surgical specimens，SS）的结果具有很高的一致性，达80%～96%。虽然有的回顾性研究[51] 显示CNB和SS在ER检测上的一致性高达90%左右，但Sutela等[52]的研究却显示，ER在CNB和SS标本的一致性只有83%，一致性检验的κ=0.39，一致性较差；但PR的一致性为88%，κ=0.69，反而一致性较好。Chen等[53]的Meta分析纳入了27个相关研究，提示ER的一致性只有77.7%～80%，PR的一致性为66.2%～69.5%。Seferina等[54]回顾性分析了526例患者的IHC结果，表明ER在CNB和SS之间的一致率为89.5%，PR为82.5%。但笔者认为这样的一致性仍然较低，会导致不少患者内分泌治疗的错误使用或漏用，故还是建议对未行新辅助化疗的患者使用SS标本进行ER、PR等检测。
关于Ki-67及HER-2的检测准确性，Ricci等[55]也回顾性分析了69例患者的资料，结果显示Ki-67的CNB与SS检测的一致率为83%，κ=0.71；HER-2的一致率为78%，κ=0.61，故认为CNB虽然可以用于Ki-67的诊断，但是不建议用于HER-2的判断。但Greer等[56]的对165例患者的研究结果显示，CNB和SS中Ki-67的一致率只有73%，κ=0.48；HER-2的一致率虽然为93%，但κ=0.63，故认为二者的一致性仍然较差，所以建议单独的CNB的IHC结果不能用于患者治疗方案的制定。Ough等[57]对209例患者的研究结果更是显示HER-2的一致率仅56%，κ=0.392 0；Ki-67的一致率仅为59%，κ=0.360 2。 虽然导致CNB和SS在IHC检测结果上不一致的原因有很多，但是肿瘤的异质性会导致不同特质的肿瘤细胞在瘤体内不均匀分布，而CNB时只切取了肿瘤中的几条组织，显然无法代表整个肿瘤的情况，所以肿瘤的异质性可能是导致这种差异的主要原因[58]。
4.2 异质性同预后的关系
在胃癌的研究中，研究者[14]发现肿瘤的异质性越高，淋巴结转移数目也越多。初步研究[58]也提示，ER及HER-2的异质性和乳腺癌患者的预后也有关。Yang等[59]前瞻性研究了32例复发或转移的乳腺癌患者，发现乳腺癌组织中ER异质性越高，对内分泌治疗的反应越差。同时，Seol等[32]的96例回顾性分析结果提示，HER-2分布的异质性在激素受体阳性的患者中更多见；而且异质性高的患者的无瘤生存率（disease free survival，DFS）更低（P=0.018）；进一步分析显示，同年龄、T分期（肿瘤大小）、N分期（淋巴结转移情况）等因素比较，HER-2分布的异质性是独立的预后影响因素。对中国患者的研究[60]也显示，原发包块更大、分化更差、分期更晚（Ⅲ期），腋淋巴结（+）≥4枚及绝经前的患者，HER-2的异质性更高。
4.3 对内分泌治疗的影响
研究者[61]发现，即使SS标本诊断为luminal A型的患者，其内分泌治疗的有效率也不是100%，而只有60%～70%，而三阴型和HER-2 （+）型患者中却有10%～20%的患者对内分泌治疗有效，其原因即考虑同乳腺癌细胞的异质性有关。
4.4 导致原发灶同复发灶/转移灶的表达不一致
乳腺癌分子病理学指标的异质性还表现在原发灶同转移灶或复发灶指标的表达上存在差异[62-63]。
由于大多数转移或复发灶很难取得病理学活检标本，临床中对于无法活检的患者均按照原发灶的分子病理学指标情况进行治疗，因此，这种异质性必将会导致一部分患者接受了错误的内分泌及分子靶向治疗，或者误失了内分泌及分子靶向治疗的机会。有学者[64]对近年相关文献进行了Meta分析，在总结的48篇文献、近4 200例患者中，原发灶和复发病灶中ER和PR不一致的比例分别高达20%和33%。由此则更容易理解中国抗癌协会乳腺癌专业委员会制定的“中国晚期乳腺癌诊治专家共识”中，对于进展缓慢、无复发生存时间较长的ER/PR （-）患者，建议仍然可以给予内分泌治疗[65]。在陈志萍等[34]的研究中则有高达50%患者的ER、PR及HER-2在原发灶与复发灶间的表达存在差异，其中以激素受体由（+）转为（-）多见，而HER-2由（-）转为（+）多见，而且发生这种变化常常提示预后不佳。
5 乳腺癌分子病理学指标异质性的检测
由于乳腺癌ER、PR、Ki-67及HER-2这四种指标在乳腺癌诊断、治疗及预后判断中均具有非常重要的作用，不少方法和检测手段被使用以降低肿瘤的异质性对乳腺癌病理检测结果的影响，提高检测的准确性[33, 66]。
首先，在取材、固定、染色及结果判读上，需要严格按照国际质量控制标准和规范进行操作，以减少实验室的误差。美国临床肿瘤学会（ASCO）及美国病理医师协会（CAP）分别在2007年及2010年联合发布了《乳腺癌HER-2检测指南》 和《乳腺癌患者雌激素受体及孕激素受体免疫组织化学检测指南》，并于2013年进行了更新，我国也于2009年发布了国内的HER-2检测指南[67-69]。随着这些指南的制定及全自动IHC染色机的广泛使用，减少了由于病理切片制作中的误差导致的技术性异质性。
其次，如今探索各种新型检测技术手段以降低肿瘤异质性对检测结果准确性的影响的研究也越来越深入。①组织微阵列技术（tissue microaray）即组织芯片技术（tissue chip），是将几十甚至上百个微组织放在1个载体上（比如1张载玻片）进行组织学研究的技术。该方法可以保证所取的所有样本在相同的试验条件下进行处理，减少了实验误差，同时具有所需组织量小、能批量处理等优点，是一种高通量、多样本的分析工具。Moeder等[6]利用该技术将乳腺癌组织石蜡标本的每个切面重新进行多点取样，以提高ER和PR诊断的一致性。但是该技术仍然存在取样点不能完全代表整个组织中肿瘤情况的缺点。②激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术是一项在显微镜下利用激光将所要研究的单一类型细胞群或单个细胞从组织切片中分离及纯化的技术。理论上说它成功地解决了组织中的细胞异质性问题，是分子病理学和肿瘤基因组学研究的一项革命性技术。虽然该方法可以提取单个细胞进行单独地检测，但是如果将整个肿瘤组织中的上亿个肿瘤细胞进行单独切割检测，来准确判断 1例患者的肿瘤细胞分子分型，其时间和经济上的花费都是巨大的，因而很难在临床中使用[30]。③正电子断层显像（positron emission tomography，PET）能够无创、动态及定量地从分子水平观察肿瘤组织的代谢特征，由于不同表型的肿瘤细胞其代谢能力可能存在差异，因此PET-CT可能能反映出不同肿瘤细胞在肿瘤组织中的分布情况。van Baardwijk等[70] 将非小细胞肺癌患者术后的标本进行了18F标记的氟脱氧葡萄糖（18F-fluorodexoy glucose，18F-FDG）PET显像，勾画出摄取高、中及低区域，再按照勾画图纸分别取三类区域的组织进行病理学检查，发 现18F-FDG摄取的差异与组织中细胞成分的差异相关。但是18F-FDG是非特异性的代谢标识，摄取的差异尚不能完全等同于肿瘤抗原表达的差异。④在最新的研究[71]中使用了发射正电子的18F与ER抗体结合的显像剂18F-fluoroestradiol（18F-FES），该显像剂能准确地和ER结合，能在PET-CT上准确地显示ER （+）细胞的分布。但是该法价格昂贵，很难广泛使用，而且也有研究[59, 72]表明，其结果同IHC检测结果不一致的比例达10%～37%。
病理大切片能完整地观察到整个组织每一个切面的所有肿瘤情况，如果结合连续切片或小间隔切片，再辅助计算机显微扫描技术，即能准确、全面地反映整个组织中主要的细胞分布情况。该方法具有准确性高，花费相对较小，采集的图像便于进一步分析、处理等优点，但是该技术由于切片大，不能采用自动化处理，对标本采集、固定、切片及染色的要求均非常高，质量控制较难，如今只能在大的病理中心的科研中使用[29, 73]。
综上所述，乳腺癌同其他上皮性肿瘤一样存在异质性，而决定乳腺癌分子分型的ER、PR、Ki-67及HER-2这四种特征性分子病理学指标在肿瘤组织中的分布也存在异质性。这种异质性会导致常规病理学检查对这四种指标检测的不准确、甚至错误，进而影响患者治疗方案的选择，并在一定程度上影响患者的预后。如今，虽然有不少新技术用于乳腺癌异质性的研究，但由于各种方法均存在一定缺陷，且有关报道较少，仍需要进一步深入研究以揭示乳腺癌异质性的原因及规律，并寻找减少其影响的可靠方法。
乳腺癌是欧美国家女性最常见的恶性肿瘤，近20年在我国其发病率也呈持续上升态势，目前已跃居部分城市女性恶性肿瘤的第一位[1]。30年来，随着乳腺癌研究的深入，手术、放疗、细胞毒药物治疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、免疫治疗等综合治疗手段的广泛使用，乳腺癌患者的生存率已得到了明显的提高[2]。特别是随着内分泌治疗和基因靶向治疗被成功应用于乳腺癌的治疗之后，乳腺癌的疗效得到了非常显著的提高，患者的生活质量也得到较大改善[3]。然而不是每一种乳腺癌都适合上述所有的治疗方法，需要根据肿瘤不同的分子类型，选择不同的、有针对性的治疗方法。Perou等[4]在2000年首 先提出了乳腺癌的分子分型并在2011年的St.Gallen会议上得到公认，该方法根据患者雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor， PR）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）及增殖细胞核抗原Ki-67的表达情况，将乳腺癌分成四种类型，以指导乳腺癌的个体化治疗及预后判断。因此，2007年美国病理学会的指南明确要求以上四个指标是乳腺癌病理报告中必不可少的内容[5]。由于这四个指标的准确检测具有举足轻重的作用，若有偏差可能会导致治疗方案发生颠覆性的变化，严重影响患者的治疗结局，所以对其准确检测是非常重要的。然而，Moeder等[6]将669例乳腺癌病理标本重新切片后进行ER及PR检测，发现同以前的病理报告相比，ER的一致性只有0.75，而PR的一致性也只有0.86。在不少临床试验中，虽然对ER的检测进行了严格地规定和监测，但研究者[7]仍然发现，对于ER （-） 的患者，仍然有5%～8%的患者对内分泌治疗有效。因此推测在日常的诊治中，有一部分本来是ER （+）的患者，被误诊为ER （-），而且这个误诊的比例还并不完全清楚。其原因一方面可以归咎为肿瘤取材、固定、染色试剂等多方面因素的影响，但是随着免疫组织化学（immunohistochemical，IHC）全封闭自动化检测系统越来越广泛的应用和取材固定操作越来越规范，其影响检测结果的可能性也就越来越小。另一方面，常规病理切片要想精确、全面地判断不一定均匀性分布的肿瘤分子指标/标志物是非常困难的，因而，肿瘤的异质性（heterogeneity）成为了人们关注的、影响常规肿瘤病理切片检测结果的最重要的因素。现就乳腺癌分子病理学指标分布的异质性做一综述。
1 人体实性肿瘤的异质性
肿瘤的异质性系指在同一肿瘤内，由于肿瘤细胞系不同而造成肿瘤细胞特质的差异[8]。肿瘤最初是在组织学方面被发现存在异质性，后来又发现在抗原性、免疫性、激素受体、代谢性、生长速度、对化学药物的敏感性等方面均存在异质性[9]。且有研 究[10]表明，肿瘤内部构造非常复杂，在不同区域其血管构成、间质成分也不尽相同，也存在异质性。据此Yarbro [11]甚至认为，所有的肿瘤均可被视为“混合”瘤。
几乎所有的上皮性肿瘤都存在异质性。有研究者[12]估计，在肺癌组织中有高达66%的肿瘤会表现出异质性。李岩磊等[13]检测了肺癌细胞中CD44的分布，结果提示肺癌细胞存在异质性。胃癌存在异质性的比例也较高，刘丽江等[14]的研究表明，在胃癌组织的同一张切片里出现两种及以上类型的癌细胞的比例高达58.7%。Gerlinger等[15]的研究也显示，在肾癌患者中，“预后良好”的基因谱与“预后不良”的基因谱可以出现在同一患者肿瘤的不同位点。于丹等[16]原代培养了人喉癌细胞，将单细胞进行体外克隆，分离喉癌细胞亚群，并进行了形态学、功能状态、分化增殖能力、裸鼠异体移植成瘤能力等指标的检测，也证实了喉癌细胞存在异质性。Arnerlöv等[17]对处于乳腺癌瘤体内不同部位的DNA倍体状态进行了研究，发现转移潜能较大的亚群较转移潜能较小的亚群更具有异质性。田海梅等[18]将乳腺癌细胞系MCF-27亚群培养后，也发现乳腺癌细胞在DNA含量和细胞周期时相分布方面存在异质性。许健等[19]更是利用Percoll不连续密度梯度技术，将MCF-7细胞分离成了5个具有异质性的亚群，因此进一步证实了乳腺癌也存在异质性。
2 乳腺癌分子病理学指标的异质性
癌细胞的分子病理学指标是肿瘤诊断、治疗和预后判断中非常重要的指标。这些指标的异质性可以导致在同一个患者的同一个肿瘤中，不同位置的肿瘤细胞有着阴性或阳性两种截然不同的表达；甚至在同一张病理切片中也存在显色的差异、肿瘤细胞染色强弱不等及阳性范围的不同，从而在显微镜下形成斑点状着色（patchy staining） [20]。龚西騟等[21]在1992年开展了乳腺癌肿瘤标本连续切片研究，发现多种抗乳腺癌单克隆抗体在肿瘤组织中的分布呈现明显的异质性，其主要表现为：①在阳性染色的癌巢内或邻近区域，可见染色阴性的癌细胞，二者分布互相连续或交叉，构成斑块状染色图案；②强阳性和弱阳性的癌细胞也呈交叉分布。
早在1978年，Tilley等[22]就发现ER在乳腺癌组织中的分布存在着异质性。Taylor等[23]也通过实验发现，ER在分布、染色强度以及定位诸方面均存在着异质性，因此认为大多数乳腺癌是由各种不同比例的ER阳性和ER阴性细胞群体所构成。Chung等[24]的研究也证实：由于ER的分布存在异质性，导致空芯针穿刺活检（the core needle biopsy，CNB）结果同术后标本结果的符合率只有75%；通过计算显示，对于1个体积为1 cm3的乳腺癌组织，1张标准的一般病理切片（一般为10 mm×10 mm×5 μm大）只能代表整个肿瘤组织的0.05%区域的情况，因此，1张或几张任选的切片并不能完全代表整个肿瘤的ER状况；同时，该研究者还发现，在同一个标本中，不同部位的ER的一致性很差，能够达到一致的比例最高才只有22%；而且在肿瘤组织中，还存在ER （+） 细胞聚集的情况。其他的研究者[25-27]也发现，在乳腺癌组织中，约有17%～40%组织的ER分布具有不均匀性。Douglas-Jones等[28]的研究更是表明，乳腺癌从外周向中心，其ER的阳性率逐渐降低，下降的比例是2%/mm。也就是说，如果是1个直径为 20mm的肿瘤，从边缘到中心其ER阳性率的下降比率为20%。因此取材部位的不同，会严重影响对肿瘤ER结果的真实判断，甚至导致结果从ER （+）变为ER （-）。
Chen等[29]的研究也提示，HER-2在乳腺癌组织中的分布也具有异质性。而Lehmann等[30]更是使用激光显微镜切割技术，精确地分割出了每个乳腺癌肿瘤细胞，并进行实时定量（real-time）的多聚酶链聚合反应（polymerase chain reaction）检测，其结果显示HER-2基因在肿瘤组织中的分布存在异质性。Ohlschlegel等[31]的研究表明，HER-2的异质率约为14.7%，且在HER-2 （2+） 的标本中最明显。Seol等[32]的研究更是将HER-2的异质性分为了瘤内分布的异质性和基因扩增的异质性，其中瘤内分布的异质性约占18%，且在激素受体阳性的患者中更明显。此外，PR及Ki-67在乳腺癌组织中的分布中也被证实存在异质性[6, 33-34]。
由此可见，现有的乳腺癌最基本的分子分型指标ER、PR、HER-2及Ki-67，在肿瘤组织中的分布都存在异质性。
3 乳腺癌分子病理学指标异质性的成因
造成肿瘤异质性的原因有很多。现在有学者[35]认为是肿瘤发生之后，自原发的区域开始，随着不断向四周特别是深层的扩展，肿瘤亦不断演变，导致异质性。在肿瘤发生的不同阶段，宿主对肿瘤发生不同的反应，同时又有新的基因参与细胞的活动，从而可能使肿瘤细胞表现出不同的生物学特征。Bryne [10]报道，口腔鳞状细胞癌（OSCC）浸润区的细胞同中心区的细胞相比，其分化程度更低。Riviére等[36]也发现，在口腔颌面部和外阴部的鳞状细胞癌中，深层浸润区C-myc mRNA的表达水平高于肿瘤表面区。有学者[37-38]认为，大多数肿瘤是单克隆起源，但是其生长过程中的亚组分化导致了异质性的发生。亚群细胞在形态、增殖能力、成瘤性、DNA相对含量及克隆能力方面均存在异质性[39]。
如今，有两种关于肿瘤异质性成因的假说得到多数学者的认可[39-44]。一种是干细胞学说，该假说认为肿瘤实际上是由一小群具有无限自我更新能力的干细胞样细胞，及其产生的分化程度不同的细胞团组成。肿瘤干细胞的不对称分裂，产生细胞质和细胞器的不均匀分布，从而导致肿瘤存在异质性。另一种克隆进化论假说则认为，肿瘤的异质性是由于由单个细胞形成的肿瘤细胞群，在发展的过程中发生突变，引起肿瘤细胞遗传水平和表型上的多样性和异质性。肿瘤新发生时所携带的突变较少，但在肿瘤发展过程中突变会逐步积累，进而导致异质性逐渐变得更加明显。如今这两种假说孰是孰非还没有定论，有待进一步的研究加以证实。
4 乳腺癌分子病理学指标异质性的影响
ER、PR、Ki-67及HER-2这四种指标在乳腺癌的诊断、治疗及预后判断方面都具有非常重要的作用，但是这些指标的异质性，会给其检测结果带来较大的影响。
4.1 对彩超引导下的乳腺肿瘤CNB的影响
由于CNB能提供足够的组织学标本并进行IHC检测，具有诊断准确、创伤小、价格便宜等优点[45]， 被公认为是乳腺癌诊断治疗的标准流程之一，广泛应用于临床。同时随着乳腺癌术前新辅助治疗的广泛应用，CNB穿刺的标本不光能提供IHC的结果，指导术前新辅助治疗方案的选择，而且对于新辅助治疗后达病理完全缓解（pathologic complete response，PCR）的患者来说，新辅助治疗前的CNB标本是其乳腺癌的唯一病理学证据，因此CNB更对这类患者的整个治疗方案起着决定性作用。如今在欧美国家及我国的大多数乳腺中心，CNB是术前必备的一种检查方法。现已有很多研究[46-50]证实了CNB对乳腺癌病理类型诊断的准确性，其结果和手术完整切除标本（surgical specimens，SS）的结果具有很高的一致性，达80%～96%。虽然有的回顾性研究[51] 显示CNB和SS在ER检测上的一致性高达90%左右，但Sutela等[52]的研究却显示，ER在CNB和SS标本的一致性只有83%，一致性检验的κ=0.39，一致性较差；但PR的一致性为88%，κ=0.69，反而一致性较好。Chen等[53]的Meta分析纳入了27个相关研究，提示ER的一致性只有77.7%～80%，PR的一致性为66.2%～69.5%。Seferina等[54]回顾性分析了526例患者的IHC结果，表明ER在CNB和SS之间的一致率为89.5%，PR为82.5%。但笔者认为这样的一致性仍然较低，会导致不少患者内分泌治疗的错误使用或漏用，故还是建议对未行新辅助化疗的患者使用SS标本进行ER、PR等检测。
关于Ki-67及HER-2的检测准确性，Ricci等[55]也回顾性分析了69例患者的资料，结果显示Ki-67的CNB与SS检测的一致率为83%，κ=0.71；HER-2的一致率为78%，κ=0.61，故认为CNB虽然可以用于Ki-67的诊断，但是不建议用于HER-2的判断。但Greer等[56]的对165例患者的研究结果显示，CNB和SS中Ki-67的一致率只有73%，κ=0.48；HER-2的一致率虽然为93%，但κ=0.63，故认为二者的一致性仍然较差，所以建议单独的CNB的IHC结果不能用于患者治疗方案的制定。Ough等[57]对209例患者的研究结果更是显示HER-2的一致率仅56%，κ=0.392 0；Ki-67的一致率仅为59%，κ=0.360 2。 虽然导致CNB和SS在IHC检测结果上不一致的原因有很多，但是肿瘤的异质性会导致不同特质的肿瘤细胞在瘤体内不均匀分布，而CNB时只切取了肿瘤中的几条组织，显然无法代表整个肿瘤的情况，所以肿瘤的异质性可能是导致这种差异的主要原因[58]。
4.2 异质性同预后的关系
在胃癌的研究中，研究者[14]发现肿瘤的异质性越高，淋巴结转移数目也越多。初步研究[58]也提示，ER及HER-2的异质性和乳腺癌患者的预后也有关。Yang等[59]前瞻性研究了32例复发或转移的乳腺癌患者，发现乳腺癌组织中ER异质性越高，对内分泌治疗的反应越差。同时，Seol等[32]的96例回顾性分析结果提示，HER-2分布的异质性在激素受体阳性的患者中更多见；而且异质性高的患者的无瘤生存率（disease free survival，DFS）更低（P=0.018）；进一步分析显示，同年龄、T分期（肿瘤大小）、N分期（淋巴结转移情况）等因素比较，HER-2分布的异质性是独立的预后影响因素。对中国患者的研究[60]也显示，原发包块更大、分化更差、分期更晚（Ⅲ期），腋淋巴结（+）≥4枚及绝经前的患者，HER-2的异质性更高。
4.3 对内分泌治疗的影响
研究者[61]发现，即使SS标本诊断为luminal A型的患者，其内分泌治疗的有效率也不是100%，而只有60%～70%，而三阴型和HER-2 （+）型患者中却有10%～20%的患者对内分泌治疗有效，其原因即考虑同乳腺癌细胞的异质性有关。
4.4 导致原发灶同复发灶/转移灶的表达不一致
乳腺癌分子病理学指标的异质性还表现在原发灶同转移灶或复发灶指标的表达上存在差异[62-63]。
由于大多数转移或复发灶很难取得病理学活检标本，临床中对于无法活检的患者均按照原发灶的分子病理学指标情况进行治疗，因此，这种异质性必将会导致一部分患者接受了错误的内分泌及分子靶向治疗，或者误失了内分泌及分子靶向治疗的机会。有学者[64]对近年相关文献进行了Meta分析，在总结的48篇文献、近4 200例患者中，原发灶和复发病灶中ER和PR不一致的比例分别高达20%和33%。由此则更容易理解中国抗癌协会乳腺癌专业委员会制定的“中国晚期乳腺癌诊治专家共识”中，对于进展缓慢、无复发生存时间较长的ER/PR （-）患者，建议仍然可以给予内分泌治疗[65]。在陈志萍等[34]的研究中则有高达50%患者的ER、PR及HER-2在原发灶与复发灶间的表达存在差异，其中以激素受体由（+）转为（-）多见，而HER-2由（-）转为（+）多见，而且发生这种变化常常提示预后不佳。
5 乳腺癌分子病理学指标异质性的检测
由于乳腺癌ER、PR、Ki-67及HER-2这四种指标在乳腺癌诊断、治疗及预后判断中均具有非常重要的作用，不少方法和检测手段被使用以降低肿瘤的异质性对乳腺癌病理检测结果的影响，提高检测的准确性[33, 66]。
首先，在取材、固定、染色及结果判读上，需要严格按照国际质量控制标准和规范进行操作，以减少实验室的误差。美国临床肿瘤学会（ASCO）及美国病理医师协会（CAP）分别在2007年及2010年联合发布了《乳腺癌HER-2检测指南》 和《乳腺癌患者雌激素受体及孕激素受体免疫组织化学检测指南》，并于2013年进行了更新，我国也于2009年发布了国内的HER-2检测指南[67-69]。随着这些指南的制定及全自动IHC染色机的广泛使用，减少了由于病理切片制作中的误差导致的技术性异质性。
其次，如今探索各种新型检测技术手段以降低肿瘤异质性对检测结果准确性的影响的研究也越来越深入。①组织微阵列技术（tissue microaray）即组织芯片技术（tissue chip），是将几十甚至上百个微组织放在1个载体上（比如1张载玻片）进行组织学研究的技术。该方法可以保证所取的所有样本在相同的试验条件下进行处理，减少了实验误差，同时具有所需组织量小、能批量处理等优点，是一种高通量、多样本的分析工具。Moeder等[6]利用该技术将乳腺癌组织石蜡标本的每个切面重新进行多点取样，以提高ER和PR诊断的一致性。但是该技术仍然存在取样点不能完全代表整个组织中肿瘤情况的缺点。②激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）技术是一项在显微镜下利用激光将所要研究的单一类型细胞群或单个细胞从组织切片中分离及纯化的技术。理论上说它成功地解决了组织中的细胞异质性问题，是分子病理学和肿瘤基因组学研究的一项革命性技术。虽然该方法可以提取单个细胞进行单独地检测，但是如果将整个肿瘤组织中的上亿个肿瘤细胞进行单独切割检测，来准确判断 1例患者的肿瘤细胞分子分型，其时间和经济上的花费都是巨大的，因而很难在临床中使用[30]。③正电子断层显像（positron emission tomography，PET）能够无创、动态及定量地从分子水平观察肿瘤组织的代谢特征，由于不同表型的肿瘤细胞其代谢能力可能存在差异，因此PET-CT可能能反映出不同肿瘤细胞在肿瘤组织中的分布情况。van Baardwijk等[70] 将非小细胞肺癌患者术后的标本进行了18F标记的氟脱氧葡萄糖（18F-fluorodexoy glucose，18F-FDG）PET显像，勾画出摄取高、中及低区域，再按照勾画图纸分别取三类区域的组织进行病理学检查，发 现18F-FDG摄取的差异与组织中细胞成分的差异相关。但是18F-FDG是非特异性的代谢标识，摄取的差异尚不能完全等同于肿瘤抗原表达的差异。④在最新的研究[71]中使用了发射正电子的18F与ER抗体结合的显像剂18F-fluoroestradiol（18F-FES），该显像剂能准确地和ER结合，能在PET-CT上准确地显示ER （+）细胞的分布。但是该法价格昂贵，很难广泛使用，而且也有研究[59, 72]表明，其结果同IHC检测结果不一致的比例达10%～37%。
病理大切片能完整地观察到整个组织每一个切面的所有肿瘤情况，如果结合连续切片或小间隔切片，再辅助计算机显微扫描技术，即能准确、全面地反映整个组织中主要的细胞分布情况。该方法具有准确性高，花费相对较小，采集的图像便于进一步分析、处理等优点，但是该技术由于切片大，不能采用自动化处理，对标本采集、固定、切片及染色的要求均非常高，质量控制较难，如今只能在大的病理中心的科研中使用[29, 73]。
综上所述，乳腺癌同其他上皮性肿瘤一样存在异质性，而决定乳腺癌分子分型的ER、PR、Ki-67及HER-2这四种特征性分子病理学指标在肿瘤组织中的分布也存在异质性。这种异质性会导致常规病理学检查对这四种指标检测的不准确、甚至错误，进而影响患者治疗方案的选择，并在一定程度上影响患者的预后。如今，虽然有不少新技术用于乳腺癌异质性的研究，但由于各种方法均存在一定缺陷，且有关报道较少，仍需要进一步深入研究以揭示乳腺癌异质性的原因及规律，并寻找减少其影响的可靠方法。