引用本文： 龚帅, 任泽强, 张蓬波, 姚丹, 刘利, 王吉科, 孙婷. 胃转流术对非肥胖型2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素受体底物-1及泛素化蛋白表达的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(8): 915-921. doi: 10.7507/1007-9424.20160241 复制
1995年，Pories等[1]报道，在胃转流术治疗病态肥胖症时，偶然发现合并有2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的患者术后血糖快速恢复了正常，糖尿病获得了永久治愈。胃转流术对伴病理性肥胖的T2DM患者的疗效是肯定的，并得到了临床病例回顾性研究[2-6]的肯定。那么，胃转流术是否对非肥胖症或轻度肥胖的T2DM也有确切控制血糖的作用呢?我们的前期研究[7-8]是以SD大鼠为造模模型，成功构建T2DM大鼠模型后，然后实行胃转流术，研究结果已显示其具有较好的降糖效果，并且改善了肝脏和脂肪组织的胰岛素抵抗。本研究以GK大鼠为模型，GK大鼠为自发性非肥胖型糖尿病大鼠模型，主要特征有胰岛β细胞分泌功能受损，胰岛素分泌减少，肝糖原生成过多，肌肉和脂肪组织有中度的胰岛素抵抗，与人类T2DM的进展极为相似[9-10]。本研究旨在观察胃转流术对GK大鼠骨骼肌组织中胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的蛋白表达以及骨骼肌组织泛素化蛋白水平的影响，以探讨胃转流术改善非肥胖型T2DM的可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
雄性GK大鼠30只，清洁级，8～12周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司；健康雄性Wistar大鼠8只，清洁级，8～12周龄，购自徐州医学院动物实验中心。稳步血糖仪，美国强生公司；大鼠胰岛素试剂盒，上海岚派公司；IRS-1抗体，Bioworld公司；泛素（Ubiquitin，Ub）抗体，Proteintech公司；GAPDH抗体，Abcam公司；山羊抗兔抗体以及山羊抗小鼠抗体由徐州医学院肿瘤生物研究所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
30只GK大鼠，按随机数字表法随机分为糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组，每组8只，其余备用。8只Wistar大鼠作为正常对照组。
1.2.2 手术方式
为了避免胃部分切除造成的摄食减少，我们在手术中保留了胃的原始容积。大鼠术前禁食12～14 h，不限饮水，3%戊巴比妥麻醉后上腹部正中切口进腹，切断幽门，闭合十二指肠残端，距Treitz韧带约8～10 cm切断空肠，远端空肠与幽门行端端吻合，近端空肠与距此吻合口远端12 cm行空肠端侧吻合。假手术组在与手术组相同部位分别切断十二指肠和空肠，再原位端端吻合，不改变胃肠道正常解剖结构，保持与手术组相似的手术时间。术后均用美洛西林（80×104 U/L）2～4 mL冲洗腹腔后关腹。糖尿病对照组和正常对照组无特殊处理，每日给予同手术组同等量的食物，自由饮水，以排除进食量等因素的影响。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 空腹体重
分别于术前（手术当天）及术后第1、2、4、8周时在大鼠空腹过夜状态下用电子称测量其体重。
1.3.2 空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）
采用血糖仪检测术前及术后第1、2、4、8周时各组大鼠FPG水平。
1.3.3 空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）
及稳态模式胰岛素抵抗（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）指数采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测术前及术后第1、2、4、8周时各组大鼠FINS，根据“HOMA-IR=FPG×FINS/22.5”计算各组术前及术后第8周时的HOMA-IR指数。
1.3.4 IRS-1和泛素化蛋白的表达水平
应用Wes-tern blot技术检测术后第8周时各组大鼠骨骼肌组织中IRS-1蛋白表达水平以及骨骼肌组织泛素化蛋白的水平。术后第8周时处死实验动物取双侧腓肠肌组织于-80 ℃冰箱冻存。采用RIPA组织裂解液裂解骨骼肌组织得到组织总蛋白，应用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。从肌肉组织所获蛋白样品，经10% SDS-PAGE分离后，恒流200 mA转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，之后加入1 : 500的一抗稀释液：IRS-1一抗、泛素（Ub）抗体、内参GAPDH抗体孵育过夜，再加入1 : 5 000的二抗稀释液进行孵育并洗膜，ECL试剂发光检测目标蛋白的表达情况，采用Image J分析软件测定IRS-1蛋白、GAPDH以及泛素化蛋白条带的灰度值，结果以IRS-1、泛素化蛋白与GAPDH条带灰度值比值进行统计比较。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0软件对数据进行分析。定量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组大鼠术前、术后空腹体重的变化
①组间比较：术前，4组间大鼠空腹体重比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第1、2、4、8周时，糖尿病手术组大鼠空腹体重均明显低于糖尿病假手术组、糖尿病对照组以及正常对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；术后第1、2、4周时，糖尿病假手术组大鼠体重明显低于糖尿病对照组（P < 0.05），而在术后第8周时两者体重比较差异无统计学意义（P > 0.05），并且与相应时相正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病对照组在术后第1、2、4周时，大鼠空腹体重均明显高于相同时相的正常对照组（P < 0.05），而在术后第8周时2组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第1、2、4周时大鼠体重呈下降趋势，与术前比较差异均有统计学意义（P < 0.05），而术后第8周时大鼠体重又呈上升趋势，与术前比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组术后第1周时体重与术前相比下降明显（P < 0.05），第2周时上升，但与术前相比，差异无统计学意义（P < 0.05），而到第4周和第8周时继续上升，与术前相比体重明显增加（P < 0.05）；糖尿病对照组和正常对照组术后大鼠体重均呈稳步上升趋势，至术后第8周时，2组体重均明显高于术前，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠术前、术后体重变化（g，2.2 各组大鼠术前、术后FPG的变化
①组间比较：术前，糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组FPG均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后第1、2、4、8周时，糖尿病假手术组、糖尿病对照组FPG均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但这2组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；术后第2、4、8周时，糖尿病手术组明显低于相应时相糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），但与相应时相正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），术后第1周时，糖尿病手术组与其他3组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第1周时FPG已开始下降，但与术前相比差异无统计学意义（P > 0.05），术后第2、4、8周时FPG继续下降，均明显低于术前，差异均有统计学意义（P < 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠手术前、后FPG变化（mmol/L，2.3 各组大鼠术前、术后FINS变化
①组间比较：术前，4组间FINS水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第1周和第4周时，4组之间相应时相间点FINS水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第2周时，除糖尿病手术组明显高于正常对照组（P < 0.05）外，其他3组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第8周时，糖尿病手术组FINS水平明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），与正常对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异亦无统计学意义（P > 0.05），但二者均明显高于正常对照组（P < 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组FINS经历了先上升后下降的过程，即术后第1周时呈上升趋势，但与术前比较差异无统计学意义，到术后第2周时继续上升，明显高于术前水平（P < 0.05），然后开始呈下降趋势，至术后第8周时已明显低于术前（P < 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
表3
各组大鼠手术前、后FINS变化（mU/L，2.4 各组大鼠术前、术后HOMA-IR指数变化
①组间比较：术前，糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组HOMA-IR指数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后第8周时，糖尿病手术组明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），与正常对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组HOMA-IR指数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但该2组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第8周时HOMA-IR指数明显低于术前（P < 0.05），而糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 4。
表4
各组大鼠手术前、后HOMA-IR指数变化（2.5 各组大鼠术后第8周时IRS-1蛋白表达结果
Western blot技术检测各组大鼠术后第8周时IRS-1蛋白表达结果见图 1。定性结果见图 1A；半定量结果见图 1B，IRS-1蛋白表达水平在糖尿病假手术组及糖尿病对照组均明显低于正常对照组（P < 0.05），糖尿病手术组和正常对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），而糖尿病手术组明显高于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图1
各组术后第8周时IRS-1蛋白表达水平。1A：定性结果。1B：半定量结果。1：正常对照组；2：糖尿病对照组；3：糖尿病假手术组；4：糖尿病手术组。与正常对照组比较，*P < 0.05；与糖尿病假手术组比较，△P < 0.05；与糖尿病对照组比较，☆P < 0.05
2.6 各组大鼠术后第8周时泛素化蛋白的表达结果
Western blot技术检测各组大鼠术后第8周时泛素化蛋白表达结果见图 2。定性结果见图 2A，结果提示，各组泛素化蛋白多以大分子蛋白为主。半定量结果见图 2B，泛素化蛋白表达水平在糖尿病手术组、糖尿病假手术组及糖尿病对照组均明显高于正常对照组（P < 0.05），而糖尿病手术组明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图2
各组术后第8周时泛素化蛋白表达水平。2A：定性结果。2B：半定量结果。M：Marker；1：正常对照组；2：糖尿病对照组；3：糖尿病假手术组；4：糖尿病手术组。与正常对照组比较，*P < 0.05；与糖尿病假手术组比较，△P < 0.05；与糖尿病对照组比较，☆P < 0.05
3 讨论
目前胃转流术治疗肥胖症合并T2DM已得到了全球代谢专家学者的认可[11-12]。然而，在我国T2DM患者中肥胖率仅为37.95%，大多数患者不伴有肥胖或仅有轻度肥胖，那么胃转流术是否对非肥胖T2DM也有明显降糖效果?本研究结果发现，糖尿病手术组的FPG从术后第1周时已开始下降，至术后第8周时，已由术前的（9.10±0.98）mmol/L降至（5.70±0.91）mmol/L，差异有统计学意义（P < 0.05），而糖尿病假手术组及糖尿病对照组手术前后FPG水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），表明胃转流术对非肥胖型T2DM也是有确切的降糖效果。
胰岛素抵抗是T2DM的主要特征和中心环节，主要表现为肝脏、骨骼肌以及脂肪组织对胰岛素敏感性及反应性降低。其中骨骼肌是人体内最大的代谢器官，在体内胰岛素介导的葡萄糖摄取中大约有70%～90%是由骨骼肌完成的[13]。在胰岛素抵抗的发生、发展过程中，骨骼肌是最先发生病理生理改变的组织器官之一。目前人们已基本认清胰岛素信号通路的大致骨架结构，即胰岛素受体/胰岛素受体底物-磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸激酶通路[14-15]；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制的研究仍不明确[16]。其中胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）是此信号通路中重要信号传导蛋白，其在胞内保持正常水平与活性是胰岛素发挥正常生理的重要因素，IRS任何异常，如含量下降或者活性降低均可影响胞内胰岛素信号转导传递，从而减弱靶细胞对胰岛素的敏感性，产生胰岛素抵抗，其中骨骼肌中重要的传导蛋白是IRS-1 [17]。本研究结果显示，术后第8周时糖尿病手术组的HOMA-IR指数由术前的3.18±0.50降至1.96±0.63，差异有统计学意义（P < 0.05），明显改善了GK大鼠胰岛素抵抗。那么是如何改善胰岛素抵抗呢？本研究结果发现，糖尿病手术组与糖尿病对照组和糖尿病假手术组比较，术后第8周时骨骼肌中IRS-1蛋白表达明显增加（P < 0.05），可见胃转流术可以上调骨骼肌胰岛素信号通路中的IRS-1蛋白表达水平，改善了骨骼肌胰岛素抵抗，这可能是胃转流术降糖效果的重要机制之一。
那么胃转流术后GK大鼠骨骼肌中IRS-1蛋白表达明显增加的原因是什么呢？近年来研究[18]发现，在肥胖、糖尿病等众多机体代谢紊乱的情况下，胰岛素靶器官中泛素-蛋白酶体系统活性明显上调，其在T2DM及其并发症的发生、发展过程中起了重要作用。通过泛素-蛋白酶体系统，细胞几乎可以对其内在的任何一种蛋白质进行高度特异性地降解，整个过程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个部分组成[19]。早在胰岛素抵抗研究的初期，已经发现胰岛素受体和IRS-1在其酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同时，存在大量的“分子数目缺失”[20-21]。越来越多的研究[22-25]表明，IRS的泛素化可能导致胰岛素信号通路障碍，是导致T2DM发生的分子机制。本研究结果发现，术后第8周时，糖尿病模型组泛素化蛋白表达明显高于正常对照组（P < 0.05），可见泛素-蛋白酶体系统活性上调在T2DM的发生中可能扮演了重要作用；而胃转流术后第8周时，糖尿病手术组血糖已明显降低的情况下，其泛素化蛋白水平却明显低于糖尿病对照组（P < 0.05）和糖尿病假手术组（P < 0.05），尤其是是相对分子质量180×103附近最为明显，而IRS-1蛋白分子量恰好在这一区域，由此可以推测胃转流术可能通过降低骨骼肌组织泛素化蛋白水平，降低了IRS-1蛋白泛素化，减少了其降解，从而上调了骨骼肌胰岛素受体/胰岛素受体底物-磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸激酶胰岛素信号通路中的IRS-1蛋白表达，提高了骨骼肌组织的胰岛素敏感性，以达到降糖效果。
本实验仅研究了骨骼肌组织中泛素化蛋白水平的总体变化，但是并没有进一步深层次研究能特异性识别IRS-1的E3泛素连接酶的蛋白表达情况，这将是我们后续研究的重点，从而更进一步阐明胃转流术改善骨骼肌胰岛素抵抗的具体机制。
1995年，Pories等[1]报道，在胃转流术治疗病态肥胖症时，偶然发现合并有2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）的患者术后血糖快速恢复了正常，糖尿病获得了永久治愈。胃转流术对伴病理性肥胖的T2DM患者的疗效是肯定的，并得到了临床病例回顾性研究[2-6]的肯定。那么，胃转流术是否对非肥胖症或轻度肥胖的T2DM也有确切控制血糖的作用呢?我们的前期研究[7-8]是以SD大鼠为造模模型，成功构建T2DM大鼠模型后，然后实行胃转流术，研究结果已显示其具有较好的降糖效果，并且改善了肝脏和脂肪组织的胰岛素抵抗。本研究以GK大鼠为模型，GK大鼠为自发性非肥胖型糖尿病大鼠模型，主要特征有胰岛β细胞分泌功能受损，胰岛素分泌减少，肝糖原生成过多，肌肉和脂肪组织有中度的胰岛素抵抗，与人类T2DM的进展极为相似[9-10]。本研究旨在观察胃转流术对GK大鼠骨骼肌组织中胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）的蛋白表达以及骨骼肌组织泛素化蛋白水平的影响，以探讨胃转流术改善非肥胖型T2DM的可能机制。
1 材料与方法
1.1 主要材料和试剂
雄性GK大鼠30只，清洁级，8～12周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司；健康雄性Wistar大鼠8只，清洁级，8～12周龄，购自徐州医学院动物实验中心。稳步血糖仪，美国强生公司；大鼠胰岛素试剂盒，上海岚派公司；IRS-1抗体，Bioworld公司；泛素（Ubiquitin，Ub）抗体，Proteintech公司；GAPDH抗体，Abcam公司；山羊抗兔抗体以及山羊抗小鼠抗体由徐州医学院肿瘤生物研究所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 动物分组
30只GK大鼠，按随机数字表法随机分为糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组，每组8只，其余备用。8只Wistar大鼠作为正常对照组。
1.2.2 手术方式
为了避免胃部分切除造成的摄食减少，我们在手术中保留了胃的原始容积。大鼠术前禁食12～14 h，不限饮水，3%戊巴比妥麻醉后上腹部正中切口进腹，切断幽门，闭合十二指肠残端，距Treitz韧带约8～10 cm切断空肠，远端空肠与幽门行端端吻合，近端空肠与距此吻合口远端12 cm行空肠端侧吻合。假手术组在与手术组相同部位分别切断十二指肠和空肠，再原位端端吻合，不改变胃肠道正常解剖结构，保持与手术组相似的手术时间。术后均用美洛西林（80×104 U/L）2～4 mL冲洗腹腔后关腹。糖尿病对照组和正常对照组无特殊处理，每日给予同手术组同等量的食物，自由饮水，以排除进食量等因素的影响。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 空腹体重
分别于术前（手术当天）及术后第1、2、4、8周时在大鼠空腹过夜状态下用电子称测量其体重。
1.3.2 空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）
采用血糖仪检测术前及术后第1、2、4、8周时各组大鼠FPG水平。
1.3.3 空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）
及稳态模式胰岛素抵抗（homeostasis model-insulin resistant，HOMA-IR）指数采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测术前及术后第1、2、4、8周时各组大鼠FINS，根据“HOMA-IR=FPG×FINS/22.5”计算各组术前及术后第8周时的HOMA-IR指数。
1.3.4 IRS-1和泛素化蛋白的表达水平
应用Wes-tern blot技术检测术后第8周时各组大鼠骨骼肌组织中IRS-1蛋白表达水平以及骨骼肌组织泛素化蛋白的水平。术后第8周时处死实验动物取双侧腓肠肌组织于-80 ℃冰箱冻存。采用RIPA组织裂解液裂解骨骼肌组织得到组织总蛋白，应用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。从肌肉组织所获蛋白样品，经10% SDS-PAGE分离后，恒流200 mA转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，TBST洗膜，之后加入1 : 500的一抗稀释液：IRS-1一抗、泛素（Ub）抗体、内参GAPDH抗体孵育过夜，再加入1 : 5 000的二抗稀释液进行孵育并洗膜，ECL试剂发光检测目标蛋白的表达情况，采用Image J分析软件测定IRS-1蛋白、GAPDH以及泛素化蛋白条带的灰度值，结果以IRS-1、泛素化蛋白与GAPDH条带灰度值比值进行统计比较。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0软件对数据进行分析。定量资料以均数±标准差（
2 结果
2.1 各组大鼠术前、术后空腹体重的变化
①组间比较：术前，4组间大鼠空腹体重比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第1、2、4、8周时，糖尿病手术组大鼠空腹体重均明显低于糖尿病假手术组、糖尿病对照组以及正常对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）；术后第1、2、4周时，糖尿病假手术组大鼠体重明显低于糖尿病对照组（P < 0.05），而在术后第8周时两者体重比较差异无统计学意义（P > 0.05），并且与相应时相正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病对照组在术后第1、2、4周时，大鼠空腹体重均明显高于相同时相的正常对照组（P < 0.05），而在术后第8周时2组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第1、2、4周时大鼠体重呈下降趋势，与术前比较差异均有统计学意义（P < 0.05），而术后第8周时大鼠体重又呈上升趋势，与术前比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组术后第1周时体重与术前相比下降明显（P < 0.05），第2周时上升，但与术前相比，差异无统计学意义（P < 0.05），而到第4周和第8周时继续上升，与术前相比体重明显增加（P < 0.05）；糖尿病对照组和正常对照组术后大鼠体重均呈稳步上升趋势，至术后第8周时，2组体重均明显高于术前，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠术前、术后体重变化（g，2.2 各组大鼠术前、术后FPG的变化
①组间比较：术前，糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组FPG均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后第1、2、4、8周时，糖尿病假手术组、糖尿病对照组FPG均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但这2组之间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；术后第2、4、8周时，糖尿病手术组明显低于相应时相糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），但与相应时相正常对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05），术后第1周时，糖尿病手术组与其他3组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第1周时FPG已开始下降，但与术前相比差异无统计学意义（P > 0.05），术后第2、4、8周时FPG继续下降，均明显低于术前，差异均有统计学意义（P < 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。
表2
各组大鼠手术前、后FPG变化（mmol/L，2.3 各组大鼠术前、术后FINS变化
①组间比较：术前，4组间FINS水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第1周和第4周时，4组之间相应时相间点FINS水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第2周时，除糖尿病手术组明显高于正常对照组（P < 0.05）外，其他3组间比较差异均无统计学意义（P > 0.05）；术后第8周时，糖尿病手术组FINS水平明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），与正常对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异亦无统计学意义（P > 0.05），但二者均明显高于正常对照组（P < 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组FINS经历了先上升后下降的过程，即术后第1周时呈上升趋势，但与术前比较差异无统计学意义，到术后第2周时继续上升，明显高于术前水平（P < 0.05），然后开始呈下降趋势，至术后第8周时已明显低于术前（P < 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。
表3
各组大鼠手术前、后FINS变化（mU/L，2.4 各组大鼠术前、术后HOMA-IR指数变化
①组间比较：术前，糖尿病手术组、糖尿病假手术组、糖尿病对照组HOMA-IR指数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；术后第8周时，糖尿病手术组明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），与正常对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；糖尿病假手术组、糖尿病对照组HOMA-IR指数均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但该2组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。②同一组内不同时相间比较：糖尿病手术组术后第8周时HOMA-IR指数明显低于术前（P < 0.05），而糖尿病假手术组、糖尿病对照组及正常对照组内手术前后比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表 4。
表4
各组大鼠手术前、后HOMA-IR指数变化（2.5 各组大鼠术后第8周时IRS-1蛋白表达结果
Western blot技术检测各组大鼠术后第8周时IRS-1蛋白表达结果见图 1。定性结果见图 1A；半定量结果见图 1B，IRS-1蛋白表达水平在糖尿病假手术组及糖尿病对照组均明显低于正常对照组（P < 0.05），糖尿病手术组和正常对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），而糖尿病手术组明显高于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图1
各组术后第8周时IRS-1蛋白表达水平。1A：定性结果。1B：半定量结果。1：正常对照组；2：糖尿病对照组；3：糖尿病假手术组；4：糖尿病手术组。与正常对照组比较，*P < 0.05；与糖尿病假手术组比较，△P < 0.05；与糖尿病对照组比较，☆P < 0.05
2.6 各组大鼠术后第8周时泛素化蛋白的表达结果
Western blot技术检测各组大鼠术后第8周时泛素化蛋白表达结果见图 2。定性结果见图 2A，结果提示，各组泛素化蛋白多以大分子蛋白为主。半定量结果见图 2B，泛素化蛋白表达水平在糖尿病手术组、糖尿病假手术组及糖尿病对照组均明显高于正常对照组（P < 0.05），而糖尿病手术组明显低于糖尿病假手术组（P < 0.05）和糖尿病对照组（P < 0.05），糖尿病假手术组和糖尿病对照组间比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
图2
各组术后第8周时泛素化蛋白表达水平。2A：定性结果。2B：半定量结果。M：Marker；1：正常对照组；2：糖尿病对照组；3：糖尿病假手术组；4：糖尿病手术组。与正常对照组比较，*P < 0.05；与糖尿病假手术组比较，△P < 0.05；与糖尿病对照组比较，☆P < 0.05
3 讨论
目前胃转流术治疗肥胖症合并T2DM已得到了全球代谢专家学者的认可[11-12]。然而，在我国T2DM患者中肥胖率仅为37.95%，大多数患者不伴有肥胖或仅有轻度肥胖，那么胃转流术是否对非肥胖T2DM也有明显降糖效果?本研究结果发现，糖尿病手术组的FPG从术后第1周时已开始下降，至术后第8周时，已由术前的（9.10±0.98）mmol/L降至（5.70±0.91）mmol/L，差异有统计学意义（P < 0.05），而糖尿病假手术组及糖尿病对照组手术前后FPG水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），表明胃转流术对非肥胖型T2DM也是有确切的降糖效果。
胰岛素抵抗是T2DM的主要特征和中心环节，主要表现为肝脏、骨骼肌以及脂肪组织对胰岛素敏感性及反应性降低。其中骨骼肌是人体内最大的代谢器官，在体内胰岛素介导的葡萄糖摄取中大约有70%～90%是由骨骼肌完成的[13]。在胰岛素抵抗的发生、发展过程中，骨骼肌是最先发生病理生理改变的组织器官之一。目前人们已基本认清胰岛素信号通路的大致骨架结构，即胰岛素受体/胰岛素受体底物-磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸激酶通路[14-15]；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制的研究仍不明确[16]。其中胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）是此信号通路中重要信号传导蛋白，其在胞内保持正常水平与活性是胰岛素发挥正常生理的重要因素，IRS任何异常，如含量下降或者活性降低均可影响胞内胰岛素信号转导传递，从而减弱靶细胞对胰岛素的敏感性，产生胰岛素抵抗，其中骨骼肌中重要的传导蛋白是IRS-1 [17]。本研究结果显示，术后第8周时糖尿病手术组的HOMA-IR指数由术前的3.18±0.50降至1.96±0.63，差异有统计学意义（P < 0.05），明显改善了GK大鼠胰岛素抵抗。那么是如何改善胰岛素抵抗呢？本研究结果发现，糖尿病手术组与糖尿病对照组和糖尿病假手术组比较，术后第8周时骨骼肌中IRS-1蛋白表达明显增加（P < 0.05），可见胃转流术可以上调骨骼肌胰岛素信号通路中的IRS-1蛋白表达水平，改善了骨骼肌胰岛素抵抗，这可能是胃转流术降糖效果的重要机制之一。
那么胃转流术后GK大鼠骨骼肌中IRS-1蛋白表达明显增加的原因是什么呢？近年来研究[18]发现，在肥胖、糖尿病等众多机体代谢紊乱的情况下，胰岛素靶器官中泛素-蛋白酶体系统活性明显上调，其在T2DM及其并发症的发生、发展过程中起了重要作用。通过泛素-蛋白酶体系统，细胞几乎可以对其内在的任何一种蛋白质进行高度特异性地降解，整个过程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个部分组成[19]。早在胰岛素抵抗研究的初期，已经发现胰岛素受体和IRS-1在其酪氨酸磷酸化普遍受抑制的同时，存在大量的“分子数目缺失”[20-21]。越来越多的研究[22-25]表明，IRS的泛素化可能导致胰岛素信号通路障碍，是导致T2DM发生的分子机制。本研究结果发现，术后第8周时，糖尿病模型组泛素化蛋白表达明显高于正常对照组（P < 0.05），可见泛素-蛋白酶体系统活性上调在T2DM的发生中可能扮演了重要作用；而胃转流术后第8周时，糖尿病手术组血糖已明显降低的情况下，其泛素化蛋白水平却明显低于糖尿病对照组（P < 0.05）和糖尿病假手术组（P < 0.05），尤其是是相对分子质量180×103附近最为明显，而IRS-1蛋白分子量恰好在这一区域，由此可以推测胃转流术可能通过降低骨骼肌组织泛素化蛋白水平，降低了IRS-1蛋白泛素化，减少了其降解，从而上调了骨骼肌胰岛素受体/胰岛素受体底物-磷脂酰肌醇3激酶-丝氨酸激酶胰岛素信号通路中的IRS-1蛋白表达，提高了骨骼肌组织的胰岛素敏感性，以达到降糖效果。
本实验仅研究了骨骼肌组织中泛素化蛋白水平的总体变化，但是并没有进一步深层次研究能特异性识别IRS-1的E3泛素连接酶的蛋白表达情况，这将是我们后续研究的重点，从而更进一步阐明胃转流术改善骨骼肌胰岛素抵抗的具体机制。
