引用本文： 时云, 王耕, 周坤, 李文仿. Mdm2在ERα阳性乳腺癌组织中的表达及其siRNA对MCF-7细胞生物学行为的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(9): 1066-1072. doi: 10.7507/1007-9424.20160275 复制
乳腺癌细胞中雌激素作用于雌激素受体（ER），诱导靶基因转录以激活细胞生长，同时刺激Myc基因表达导致细胞存活，且可通过诱导抗调亡基因bcl-2的表达而抑制细胞凋亡[1]。通过清除雌激素以抑制ERα信号通路，则可导致乳腺癌细胞的生长抑制，这是他莫西芬治疗乳腺癌的基础。临床上有70%的乳腺癌ERα呈阳性表达[2]，尽管以他莫西芬为基础的内分泌治疗对激素依赖性乳腺癌取得了一定的效果，但仍有50%的ERα阳性乳腺癌细胞对激素治疗耐药[2]。而且，部分患者从起初对内分泌治疗有效逐步过渡到拮抗内分泌治疗，呈现不依赖激素生长的生物学改变。乳腺癌细胞逐步发展到不依赖激素及内分泌治疗是肿瘤进展的表现之一，提示乳腺癌细胞能通过改变细胞信号通路而继续生长[3]。MDM2基因产物即Mdm2可以和野生型p53形成复合体，对p53抑癌蛋白起负调控作用，可使p53受到抑制或完全失活，从而在肿瘤的发生和发展中发挥重要的作用[4]。Mdm2也可与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）形成复合物，在诱导血管内皮生长因子（VEGF）形成过程中发挥重要作用，此外Mdm2在转化因子β1（TGF-β1）介导的乳腺癌细胞转移过程中也有重要的生物学作用[5]。乳腺癌组织中伴有高的Mdm2表达，抑制MCF-7乳腺癌细胞中Mdm2的表达，可明显增加化疗药物依托泊甙导致的细胞凋亡，而ERα可调节乳腺癌组织中Mdm2的表达[6]。因此，MDM2基因在ERα阳性乳腺癌中的作用机制、ERα与MDM2基因之间是否存在相互作用及其作用具体机理、MDM2基因是否通过拮抗P53基因影响乳腺癌细胞中ERα表达等均需进一步研究。沉默MDM2基因已经证实对多种肿瘤细胞有生长抑制并促进凋亡的作用[7]。本研究首先采用免疫组化染色方法检测ERα阳性乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达，并针对MDM2 mRNA序列的不同位点合成siRNA干扰序列，导入ERα阳性MCF-7细胞中，以最大程度抑制MDM2基因的表达。通过基因干扰方式，探讨MDM2-siRNA对MCF-7细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响，并探讨其具体机理，为进一步探索乳腺癌的治疗方法提供重要的科学依据。
1 资料和方法
1.1 研究对象
回顾性收集笔者所在医院2012年6月至2015年10月期间的经病理组织学检查确诊的ERα阳性乳腺癌组织石蜡标本78例（乳腺癌组）及乳腺纤维腺瘤组织石蜡标本10例（乳腺纤维腺瘤组）。乳腺癌组患者均为女性，年龄33～56岁、（44.5±6.3）岁，其中≤45岁35例， > 45岁43例；肿瘤直径：≤2 cm 20例，2～5 cm 38例， > 5 cm 20例；病理学类型：浸润性小叶癌34例，浸润性导管癌42例，其他2例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴结转移数量：0～3枚30例，4～9枚37例， > 9枚11例；组织学分级：1级24例，2级25例，3级29例。根据免疫组化判断标准，ER和孕激素受体（PR）表达阳性定义为≥10%肿瘤细胞染色阳性，人类表皮样生长因子受体2（HER-2）表达阳性定义为≥30%肿瘤细胞染色阳性[8]。乳腺癌组患者中，HER-2阳性20例，阴性58例。乳腺纤维腺瘤组患者均为女性患者，年龄18～42岁、（36.3±7.3）岁。乳腺纤维腺瘤患者均为单发，不合并乳腺癌或其他乳腺疾病。2组患者的年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
1.2 主要材料和设备
人乳腺癌MCF-7细胞系购自武汉大学细胞库。培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，购自美国Gibco公司；Mdm2多克隆抗体购自Abcam公司（产品货号：ab137413），Western blot显色试剂购自美国Millipore公司，BCA试剂盒、MTT试剂盒及AnnexinV-FITC试剂盒购自碧云天生物有限公司，LipofectionTM 2000购自Invitrogen公司。MDM2基因的siRNA由上海生物工程有限公司合成，无效干扰siRNA（siRNA NC）也由该公司合成。MDM2-siRNA：5′-GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT-3′，无效干扰RNA没有相应的mRNA作用靶点，序列为：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。凋亡率检测采用美国BD公司生产的C6型流式细胞仪，电泳仪器为美国伯乐公司的BIO-RAD Powerpac HC型电泳仪，MTT细胞增殖检测采用美国赛默飞有限公司生产的酶标仪（型号：9608）。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化染色法检测Mdm2的表达
通过SP免疫组化染色方法检测ERα阳性乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达。按试剂盒说明步骤，取厚度为3 μm的石蜡切片，经二甲苯脱蜡1 h后，再以浓度梯度为100%、95%及85%的乙醇入水；于加热至98 ℃的0.1%枸橼酸钠溶液中抗原修复15 min，以山羊血清封闭15 min；加入Mdm2兔抗人抗体（1 : 100）4 ℃湿盒过夜，以PBS溶液洗涤3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育15 min后，以PBS溶液洗涤3次，每次5 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液1滴，37 ℃孵育15 min；DAB进行显色，苏木精染核1 min；60 ℃烤片，85%、95%及100%梯度乙醇脱水，最后以二甲苯透明，中性树胶封片。以不加Mdm2一抗的PBS溶液作为阴性对照，以已知高表达Mdm2的肝癌石蜡切片作为阳性对照。
1.3.2 免疫组化染色结果判定
参考文献方法[9]，将染色强度和染色百分比结合以评估染色结果。染色强度：0分，无染色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，强染色。染色百分比：0分，0～20%；1分，21%～40%；2分，41%～60%；3分，61%～80%；4分，81%～100%。最终评分结果为染色强度和染色百分比的乘积，范围为0～12分，其中0～6分定义为阴性表达，7～12分定义为阳性表达。
1.3.3 MCF-7细胞培养和转染
采用37 ℃含5% CO2的细胞孵箱培养细胞。将MCF-7细胞分为MDM2-siRNA组、阴性对照组及空白对照组，接种到6孔板中，每组设3个复孔。当生长到80%的融合度时，采用LipofectionTM 2000转染试剂，按说明转染最终浓度为100 nmol/L的MDM2-siRNA（MDM2-siRNA组）或无效干扰siRNA（阴性对照组），空白对照组不加入任何试剂。最后，吸去转染液，换入新鲜培养液继续培养细胞48 h。
1.3.4 Western blot法检测Mdm2的表达
上述细胞培养48 h后，采用Western blot法检测Mdm2的表达，每个复孔重复测量3次，取均值。采用细胞裂解方法提取蛋白，蛋白浓度测定采用BCA试剂盒，具体操作根据试剂盒说明书进行。蛋白上样量为50 μg，首先以70 V电压跑积成胶，再以110 V电压跑分离胶，待显色剂溴酚蓝刚好跑出凝胶时，停止电泳。蛋白转膜采用尼龙膜，预先在无水的甲醇中浸湿2 min，然后再放在转膜液中平衡10 min，转膜时间为1 h。采用PBS溶液洗涤尼龙膜3次，然后加入浓度为1 : 1 000的Mdm2一抗，4 ℃过夜孵育；加入二抗，浓度为1 : 2 000，室温条件下结合2 h，然后采用PBS溶液洗涤尼龙膜。显影按显影试剂盒说明书进行，将按1 : 1比例配置的显影液滴于尼龙膜行显色分析，最后以Quality-One软件分析蛋白浓度，目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。
1.3.5 MTT法检测细胞增殖
细胞分组及处理同1.3.2。转染后继续培养细胞，将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔1 000个细胞接种于96孔板中（3组均设3个复孔），置于37℃、5% CO2孵箱中继续培养。分别于接种细胞后1、2、3和4 d以酶标仪检测MCF-7细胞的吸光度值（OD值）。主要方法是：在细胞培养板每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，于酶标仪上测量490 nm波长时的OD值（和增殖率呈正相关）。绘制细胞生长曲线，以时间为横坐标，OD值为纵坐标。
1.3.6 克隆形成实验
细胞分组及处理同1.3.2。将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔1000个细胞接种于6孔板中（3组均设3个复孔），将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中继续培养，连续培养10 d，期间每3天换液1次。然后倒弃培养基，以4%甲醛固定30 min，再以0.1%结晶紫染色，在显微镜下观察计数克隆形成数（计数各孔中的克隆数量）。每个细胞克隆由50个以上细胞组成，被结晶紫染成紫色。
1.3.7 细胞凋亡实验
细胞分组、复孔数量及处理同1.3.2。每个复孔重复测量3次，取均值。采用AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡率。收集细胞培养液后，离心5 min（800 r/min，r=8 cm），小心吸去上清液，以预冷的PBS溶液洗细胞2遍，再同条件离心5 min，小心吸净PBS溶液。加入400 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞浓度达到1×106个/mL。加入5 μL FITC标记的Annexin V，轻柔混匀，避光5 ℃孵育15 min。再加入5 μL PI，混匀（注意避光）。使用流式细胞仪进行检测、分析。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。
1.4 统计学方法
数据分析采用SPSS 17.0统计分析软件。乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织中Mdm2的表达阳性率比较采用成组χ2检验；乳腺癌组织中Mdm2表达与患者临床病理特征关系的分析采用成组χ2检验/精确概率法（二分类资料），或趋势χ2检验（等级资料）；3组细胞的Mdm2表达水平、细胞增殖率、克隆形成数量和凋亡率比较的统计方法采用方差分析，两两比较采用LSD法。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 ERα阳性乳腺癌组织和乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达情况
Mdm2主要表达于乳腺癌细胞的细胞核，阳性表达呈棕黄色，呈块状或片状分布（图 1）。乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2均呈阴性表达，表达阳性率为0；ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2阳性表达38例，阳性表达率为48.7%，高于乳腺纤维腺瘤组织（χ2=12.357，P=0.000）。
图1
示Mdm2在乳腺纤维腺瘤和ERα阳性乳腺癌组织中的表达（SP ×200）。1A：在乳腺纤维腺瘤组织中呈阴性表达；1B：在乳腺癌组织中呈阴性表达；1C：在乳腺癌组织中呈阳性表达 图 2示3组细胞中Mdm2的表达。1：空白对照组；2：阴性对照组；3：MDM2-siRNA组 图 3示各时点3组细胞的细胞增殖率。同时点与空白对照组和阴性对照组比较，*P < 0.050 图 4示3组细胞的细胞克隆形成结果。4A：空白对照组；4B：阴性对照组；4C：MDM2-siRNA组 图 5示3组细胞的细胞凋亡率。5A：空白对照组；5B：阴性对照组；5C：MDM2-siRNA组
Figure1.
2.2 ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与其临床病理特征的关系
ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与患者的TNM分期和淋巴结转移数量均有关（P < 0.050），肿瘤分期越晚、淋巴结转移数量越多，Mdm2的表达阳性率越高；而Mdm2表达与患者的年龄、肿瘤直径、病理类型、组织学分级及HER-2表达均无关（P > 0.050），见表 1。
表1
ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与患者临床病理特征的关系〔例（%）〕
2.3 MDM2-siRNA对MCF-7细胞中Mdm2表达的影响
Western blot电泳结果表明，空白对照组、阴性对照组及MDM2-siRNA组中Mdm2的表达水平均值分别为0.687、0.675及0.156，其中MDM2-siRNA组的表达水平低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P > 0.050），见图 2。
2.4 MDM2-siRNA对MCF-7细胞增殖的影响
空白对照组和阴性对照组的MCF-7细胞转染1 d后开始稳步生长，2组的生长曲线未见明显差异，而MDM2-siRNA组细胞的生长曲线低平，从2 d开始始终低于空白对照组和阴性对照组（图 3）。转染后1 d时3组细胞的细胞增殖率比较差异无统计学意义（P > 0.050）；在转染后2、3及4 d时，MDM2-siRNA组的细胞增殖率均低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），而各时点空白对照组和阴性对照组的细胞增殖率比较差异均无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显抑制MCF-7细胞的增殖。
2.5 MDM2-siRNA对MCF-7细胞克隆的影响
空白对照组、阴性对照组组和MDM2-siRNA组的克隆形成均数分别为237、255及58个（图 4）。MDM2-siRNA组的细胞克隆形成数低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），但空白对照组和阴性对照组的细胞克隆形成数比较差异无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显抑制MCF-7细胞的克隆形成。
2.6 MDM2-siRNA对MCF-7细胞凋亡的影响
空白对照组、阴性对照组和MDM2-siRNA组的凋亡率均值分别为6.68%、6.73%及29.85%。MDM2-siRNA组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），但空白对照组和阴性对照组的细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显诱导MCF-7细胞的凋亡（图 5）。
3 讨论
MDM2基因是1987年Cahilly-Snyder等[10]首次从一个含有双微体（double minutes，DM）的自发转化的BALB/3T3细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因。MDM2基因转录产物mRNA的长度为5.5 kb，广泛存在于人体正常的组织器官中，以骨骼肌最多，其次为肝、肺等，与细胞的基本生理活动有关。最近研究[11]表明，在人类许多肿瘤组织中，如肺癌和结肠癌，都有MDM2基因的扩增表达。Mdm2可与p53组成自动调节反馈环[12]，一方面Mdm2能与p53酸性活化域直接结合形成p53-Mdm2复合物，抑制野生型（wild type，wt）p53介导的反式激活功能及其诱导的凋亡功能，导致肿瘤发生，但Mdm2并不能与p53紧密结合；另一方面p53能诱导Mdm2表达，此为快速动力学变化，不需要从头合成[13]。除抑制p53功能外，Mdm2还抑制另一抑癌基因——视网膜神经胶质瘤基因（Rb），Mdm2与其C端结合，阻止其诱导细胞进入G1期阻滞的能力[14]。本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2的表达阳性率较高，而乳腺纤维腺瘤组织中未检测到Mdm2的表达，提示Mdm2在乳腺癌的进展中扮演重要角色。
Mdm2直接干扰真核细胞分裂增殖中两个关键的细胞周期调控点，即G1/S和G2/M。G1 /S调控点已证实有多条调节途径，是细胞周期的关键性调控点，参与构成以磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）为中心的调节网络。Mdm2可影响pRb功能，pRb能被Mdm2有效泛素化，导致功能丧失[13]。G2 /M期DNA损伤检验点是细胞进入有丝分裂前修复DNA损伤的最后时机，p53通路是最重要的DNA损伤检验修复分子通路之一[14]。正常情况下MDM2基因处于受抑制状态，细胞无增殖能力，但当有致癌因素时，P53基因发生突变，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表达相应的Mdm2与p53结合，使p53功能丧失，使肿瘤细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发生和发展[15]。另外，研究[16]表明，Mdm2还可与多种生物因子相互作用，在乳腺癌的发展中发挥重要作用。Mdm2靶向促进多种蛋白降解，从而促进肿瘤细胞的生物学进展，包括促进P21蛋白酶体降解[17]，此外Mdm2还可与HIF-1α形成复合物诱导VEGF生成[18]。
ER是乳腺癌最常见的预后分子指标之一，2/3的乳腺癌细胞呈雌激素依赖性生长。ERα信号通路调节多种组织生长及发展活性，能促进乳腺癌细胞生长[19]。乳腺癌细胞中雌激素作用于ER，诱导靶基因转录而激活细胞生长，同时刺激Myc基因表达导致细胞存活，且与HER-2有交互作用[20]。通过清除雌激素抑制ERα信号通路，从而导致乳腺癌细胞生长抑制，这是他莫西芬治疗乳腺癌的基础。内分泌治疗对激素依赖性乳腺癌具有一定的治疗效果，但仍有50%的ERα阳性乳腺癌细胞对激素治疗耐药[2]。部分患者从起初对内分泌治疗有效逐步过渡到拮抗内分泌治疗，呈现不依赖激素生长的生物学改变[21]。乳腺癌患者内分泌治疗逐步发展到内分泌治疗抵抗，提示乳腺癌细胞通过改变细胞信号通路而继续生长[22]。本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2的表达与年龄、肿瘤直径、病理类型、组织学分级及HER-2表达均无关，但与患者的TNM分期及淋巴结转移数量均有关，提示Mdm2参与ERα阳性乳腺癌的生物学进展。然而，本研究并未发现Mdm2表达与ERα阳性乳腺癌的肿瘤直径有关，这可能与病例选择及研究样本量较小有关。
ERα阳性乳腺癌中伴有高的Mdm2表达，且在雌激素作用下Mdm2表达增强[23]。MDM2基因能增强ERα的功能，但机理仍不清楚[24]。在MCF-7细胞中，能通过基因敲除MDM2基因来抑制雌激素诱导的乳腺癌细胞增殖，但同时基因敲除P53并不影响MCF-7细胞的增殖，提示Mdm2并不是通过拮抗p53来促进MCF-7细胞增殖的[25]。T-47D是一种含突变P53的乳腺癌细胞，抑制该细胞中MDM2基因的表达能减弱雌激素促进T-47D细胞的生长作用，证实Mdm2不依赖于p53，还存在其他促进乳腺癌细胞生长的机理[26]。因此，ERα与MDM2基因之间是否存在相互作用、其具体作用机理等并未完全阐明。本研究结果显示，通过沉默MDM2基因，可明显抑制MCF-7细胞的增殖和克隆形成，并诱导MCF-7细胞凋亡，提示Mdm2是参与ERα阳性乳腺癌进展的重要生物分子。
总之，本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中存在Mdm2高表达，ERα阳性乳腺癌患者的Mdm2表达与TNM分期及淋巴结转移数量均有关；siRNA沉默MDM2基因能抑制MCF-7细胞的增殖和克隆形成，并诱导细胞凋亡。该结果提示，Mdm2是ERα阳性乳腺癌的相对特异性的标志物，靶向Mdm2可能在ERα阳性乳腺癌患者的治疗中具有一定价值。
乳腺癌细胞中雌激素作用于雌激素受体（ER），诱导靶基因转录以激活细胞生长，同时刺激Myc基因表达导致细胞存活，且可通过诱导抗调亡基因bcl-2的表达而抑制细胞凋亡[1]。通过清除雌激素以抑制ERα信号通路，则可导致乳腺癌细胞的生长抑制，这是他莫西芬治疗乳腺癌的基础。临床上有70%的乳腺癌ERα呈阳性表达[2]，尽管以他莫西芬为基础的内分泌治疗对激素依赖性乳腺癌取得了一定的效果，但仍有50%的ERα阳性乳腺癌细胞对激素治疗耐药[2]。而且，部分患者从起初对内分泌治疗有效逐步过渡到拮抗内分泌治疗，呈现不依赖激素生长的生物学改变。乳腺癌细胞逐步发展到不依赖激素及内分泌治疗是肿瘤进展的表现之一，提示乳腺癌细胞能通过改变细胞信号通路而继续生长[3]。MDM2基因产物即Mdm2可以和野生型p53形成复合体，对p53抑癌蛋白起负调控作用，可使p53受到抑制或完全失活，从而在肿瘤的发生和发展中发挥重要的作用[4]。Mdm2也可与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）形成复合物，在诱导血管内皮生长因子（VEGF）形成过程中发挥重要作用，此外Mdm2在转化因子β1（TGF-β1）介导的乳腺癌细胞转移过程中也有重要的生物学作用[5]。乳腺癌组织中伴有高的Mdm2表达，抑制MCF-7乳腺癌细胞中Mdm2的表达，可明显增加化疗药物依托泊甙导致的细胞凋亡，而ERα可调节乳腺癌组织中Mdm2的表达[6]。因此，MDM2基因在ERα阳性乳腺癌中的作用机制、ERα与MDM2基因之间是否存在相互作用及其作用具体机理、MDM2基因是否通过拮抗P53基因影响乳腺癌细胞中ERα表达等均需进一步研究。沉默MDM2基因已经证实对多种肿瘤细胞有生长抑制并促进凋亡的作用[7]。本研究首先采用免疫组化染色方法检测ERα阳性乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达，并针对MDM2 mRNA序列的不同位点合成siRNA干扰序列，导入ERα阳性MCF-7细胞中，以最大程度抑制MDM2基因的表达。通过基因干扰方式，探讨MDM2-siRNA对MCF-7细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响，并探讨其具体机理，为进一步探索乳腺癌的治疗方法提供重要的科学依据。
1 资料和方法
1.1 研究对象
回顾性收集笔者所在医院2012年6月至2015年10月期间的经病理组织学检查确诊的ERα阳性乳腺癌组织石蜡标本78例（乳腺癌组）及乳腺纤维腺瘤组织石蜡标本10例（乳腺纤维腺瘤组）。乳腺癌组患者均为女性，年龄33～56岁、（44.5±6.3）岁，其中≤45岁35例， > 45岁43例；肿瘤直径：≤2 cm 20例，2～5 cm 38例， > 5 cm 20例；病理学类型：浸润性小叶癌34例，浸润性导管癌42例，其他2例；肿瘤TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期25例，Ⅲ期26例，Ⅳ期5例；淋巴结转移数量：0～3枚30例，4～9枚37例， > 9枚11例；组织学分级：1级24例，2级25例，3级29例。根据免疫组化判断标准，ER和孕激素受体（PR）表达阳性定义为≥10%肿瘤细胞染色阳性，人类表皮样生长因子受体2（HER-2）表达阳性定义为≥30%肿瘤细胞染色阳性[8]。乳腺癌组患者中，HER-2阳性20例，阴性58例。乳腺纤维腺瘤组患者均为女性患者，年龄18～42岁、（36.3±7.3）岁。乳腺纤维腺瘤患者均为单发，不合并乳腺癌或其他乳腺疾病。2组患者的年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05）。
1.2 主要材料和设备
人乳腺癌MCF-7细胞系购自武汉大学细胞库。培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基，购自美国Gibco公司；Mdm2多克隆抗体购自Abcam公司（产品货号：ab137413），Western blot显色试剂购自美国Millipore公司，BCA试剂盒、MTT试剂盒及AnnexinV-FITC试剂盒购自碧云天生物有限公司，LipofectionTM 2000购自Invitrogen公司。MDM2基因的siRNA由上海生物工程有限公司合成，无效干扰siRNA（siRNA NC）也由该公司合成。MDM2-siRNA：5′-GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT-3′，无效干扰RNA没有相应的mRNA作用靶点，序列为：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。凋亡率检测采用美国BD公司生产的C6型流式细胞仪，电泳仪器为美国伯乐公司的BIO-RAD Powerpac HC型电泳仪，MTT细胞增殖检测采用美国赛默飞有限公司生产的酶标仪（型号：9608）。
1.3 方法
1.3.1 免疫组化染色法检测Mdm2的表达
通过SP免疫组化染色方法检测ERα阳性乳腺癌及乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达。按试剂盒说明步骤，取厚度为3 μm的石蜡切片，经二甲苯脱蜡1 h后，再以浓度梯度为100%、95%及85%的乙醇入水；于加热至98 ℃的0.1%枸橼酸钠溶液中抗原修复15 min，以山羊血清封闭15 min；加入Mdm2兔抗人抗体（1 : 100）4 ℃湿盒过夜，以PBS溶液洗涤3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，37 ℃孵育15 min后，以PBS溶液洗涤3次，每次5 min；滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液1滴，37 ℃孵育15 min；DAB进行显色，苏木精染核1 min；60 ℃烤片，85%、95%及100%梯度乙醇脱水，最后以二甲苯透明，中性树胶封片。以不加Mdm2一抗的PBS溶液作为阴性对照，以已知高表达Mdm2的肝癌石蜡切片作为阳性对照。
1.3.2 免疫组化染色结果判定
参考文献方法[9]，将染色强度和染色百分比结合以评估染色结果。染色强度：0分，无染色；1分，弱染色；2分，中等染色；3分，强染色。染色百分比：0分，0～20%；1分，21%～40%；2分，41%～60%；3分，61%～80%；4分，81%～100%。最终评分结果为染色强度和染色百分比的乘积，范围为0～12分，其中0～6分定义为阴性表达，7～12分定义为阳性表达。
1.3.3 MCF-7细胞培养和转染
采用37 ℃含5% CO2的细胞孵箱培养细胞。将MCF-7细胞分为MDM2-siRNA组、阴性对照组及空白对照组，接种到6孔板中，每组设3个复孔。当生长到80%的融合度时，采用LipofectionTM 2000转染试剂，按说明转染最终浓度为100 nmol/L的MDM2-siRNA（MDM2-siRNA组）或无效干扰siRNA（阴性对照组），空白对照组不加入任何试剂。最后，吸去转染液，换入新鲜培养液继续培养细胞48 h。
1.3.4 Western blot法检测Mdm2的表达
上述细胞培养48 h后，采用Western blot法检测Mdm2的表达，每个复孔重复测量3次，取均值。采用细胞裂解方法提取蛋白，蛋白浓度测定采用BCA试剂盒，具体操作根据试剂盒说明书进行。蛋白上样量为50 μg，首先以70 V电压跑积成胶，再以110 V电压跑分离胶，待显色剂溴酚蓝刚好跑出凝胶时，停止电泳。蛋白转膜采用尼龙膜，预先在无水的甲醇中浸湿2 min，然后再放在转膜液中平衡10 min，转膜时间为1 h。采用PBS溶液洗涤尼龙膜3次，然后加入浓度为1 : 1 000的Mdm2一抗，4 ℃过夜孵育；加入二抗，浓度为1 : 2 000，室温条件下结合2 h，然后采用PBS溶液洗涤尼龙膜。显影按显影试剂盒说明书进行，将按1 : 1比例配置的显影液滴于尼龙膜行显色分析，最后以Quality-One软件分析蛋白浓度，目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。
1.3.5 MTT法检测细胞增殖
细胞分组及处理同1.3.2。转染后继续培养细胞，将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔1 000个细胞接种于96孔板中（3组均设3个复孔），置于37℃、5% CO2孵箱中继续培养。分别于接种细胞后1、2、3和4 d以酶标仪检测MCF-7细胞的吸光度值（OD值）。主要方法是：在细胞培养板每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，孵育4 h后吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，于酶标仪上测量490 nm波长时的OD值（和增殖率呈正相关）。绘制细胞生长曲线，以时间为横坐标，OD值为纵坐标。
1.3.6 克隆形成实验
细胞分组及处理同1.3.2。将处于对数生长期的MCF-7细胞以每孔1000个细胞接种于6孔板中（3组均设3个复孔），将细胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中继续培养，连续培养10 d，期间每3天换液1次。然后倒弃培养基，以4%甲醛固定30 min，再以0.1%结晶紫染色，在显微镜下观察计数克隆形成数（计数各孔中的克隆数量）。每个细胞克隆由50个以上细胞组成，被结晶紫染成紫色。
1.3.7 细胞凋亡实验
细胞分组、复孔数量及处理同1.3.2。每个复孔重复测量3次，取均值。采用AnnexinV-FITC试剂盒检测细胞凋亡率。收集细胞培养液后，离心5 min（800 r/min，r=8 cm），小心吸去上清液，以预冷的PBS溶液洗细胞2遍，再同条件离心5 min，小心吸净PBS溶液。加入400 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞浓度达到1×106个/mL。加入5 μL FITC标记的Annexin V，轻柔混匀，避光5 ℃孵育15 min。再加入5 μL PI，混匀（注意避光）。使用流式细胞仪进行检测、分析。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。
1.4 统计学方法
数据分析采用SPSS 17.0统计分析软件。乳腺纤维腺瘤组织及乳腺癌组织中Mdm2的表达阳性率比较采用成组χ2检验；乳腺癌组织中Mdm2表达与患者临床病理特征关系的分析采用成组χ2检验/精确概率法（二分类资料），或趋势χ2检验（等级资料）；3组细胞的Mdm2表达水平、细胞增殖率、克隆形成数量和凋亡率比较的统计方法采用方差分析，两两比较采用LSD法。检验水准α=0.050。
2 结果
2.1 ERα阳性乳腺癌组织和乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2的表达情况
Mdm2主要表达于乳腺癌细胞的细胞核，阳性表达呈棕黄色，呈块状或片状分布（图 1）。乳腺纤维腺瘤组织中Mdm2均呈阴性表达，表达阳性率为0；ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2阳性表达38例，阳性表达率为48.7%，高于乳腺纤维腺瘤组织（χ2=12.357，P=0.000）。
图1
示Mdm2在乳腺纤维腺瘤和ERα阳性乳腺癌组织中的表达（SP ×200）。1A：在乳腺纤维腺瘤组织中呈阴性表达；1B：在乳腺癌组织中呈阴性表达；1C：在乳腺癌组织中呈阳性表达 图 2示3组细胞中Mdm2的表达。1：空白对照组；2：阴性对照组；3：MDM2-siRNA组 图 3示各时点3组细胞的细胞增殖率。同时点与空白对照组和阴性对照组比较，*P < 0.050 图 4示3组细胞的细胞克隆形成结果。4A：空白对照组；4B：阴性对照组；4C：MDM2-siRNA组 图 5示3组细胞的细胞凋亡率。5A：空白对照组；5B：阴性对照组；5C：MDM2-siRNA组
Figure1.
2.2 ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与其临床病理特征的关系
ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与患者的TNM分期和淋巴结转移数量均有关（P < 0.050），肿瘤分期越晚、淋巴结转移数量越多，Mdm2的表达阳性率越高；而Mdm2表达与患者的年龄、肿瘤直径、病理类型、组织学分级及HER-2表达均无关（P > 0.050），见表 1。
表1
ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2表达与患者临床病理特征的关系〔例（%）〕
2.3 MDM2-siRNA对MCF-7细胞中Mdm2表达的影响
Western blot电泳结果表明，空白对照组、阴性对照组及MDM2-siRNA组中Mdm2的表达水平均值分别为0.687、0.675及0.156，其中MDM2-siRNA组的表达水平低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），而空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P > 0.050），见图 2。
2.4 MDM2-siRNA对MCF-7细胞增殖的影响
空白对照组和阴性对照组的MCF-7细胞转染1 d后开始稳步生长，2组的生长曲线未见明显差异，而MDM2-siRNA组细胞的生长曲线低平，从2 d开始始终低于空白对照组和阴性对照组（图 3）。转染后1 d时3组细胞的细胞增殖率比较差异无统计学意义（P > 0.050）；在转染后2、3及4 d时，MDM2-siRNA组的细胞增殖率均低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），而各时点空白对照组和阴性对照组的细胞增殖率比较差异均无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显抑制MCF-7细胞的增殖。
2.5 MDM2-siRNA对MCF-7细胞克隆的影响
空白对照组、阴性对照组组和MDM2-siRNA组的克隆形成均数分别为237、255及58个（图 4）。MDM2-siRNA组的细胞克隆形成数低于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），但空白对照组和阴性对照组的细胞克隆形成数比较差异无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显抑制MCF-7细胞的克隆形成。
2.6 MDM2-siRNA对MCF-7细胞凋亡的影响
空白对照组、阴性对照组和MDM2-siRNA组的凋亡率均值分别为6.68%、6.73%及29.85%。MDM2-siRNA组的细胞凋亡率高于空白对照组和阴性对照组（P < 0.050），但空白对照组和阴性对照组的细胞凋亡率比较差异无统计学意义（P > 0.050），提示MDM2-siRNA能明显诱导MCF-7细胞的凋亡（图 5）。
3 讨论
MDM2基因是1987年Cahilly-Snyder等[10]首次从一个含有双微体（double minutes，DM）的自发转化的BALB/3T3细胞中克隆出来的一个高度扩增的基因。MDM2基因转录产物mRNA的长度为5.5 kb，广泛存在于人体正常的组织器官中，以骨骼肌最多，其次为肝、肺等，与细胞的基本生理活动有关。最近研究[11]表明，在人类许多肿瘤组织中，如肺癌和结肠癌，都有MDM2基因的扩增表达。Mdm2可与p53组成自动调节反馈环[12]，一方面Mdm2能与p53酸性活化域直接结合形成p53-Mdm2复合物，抑制野生型（wild type，wt）p53介导的反式激活功能及其诱导的凋亡功能，导致肿瘤发生，但Mdm2并不能与p53紧密结合；另一方面p53能诱导Mdm2表达，此为快速动力学变化，不需要从头合成[13]。除抑制p53功能外，Mdm2还抑制另一抑癌基因——视网膜神经胶质瘤基因（Rb），Mdm2与其C端结合，阻止其诱导细胞进入G1期阻滞的能力[14]。本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2的表达阳性率较高，而乳腺纤维腺瘤组织中未检测到Mdm2的表达，提示Mdm2在乳腺癌的进展中扮演重要角色。
Mdm2直接干扰真核细胞分裂增殖中两个关键的细胞周期调控点，即G1/S和G2/M。G1 /S调控点已证实有多条调节途径，是细胞周期的关键性调控点，参与构成以磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）为中心的调节网络。Mdm2可影响pRb功能，pRb能被Mdm2有效泛素化，导致功能丧失[13]。G2 /M期DNA损伤检验点是细胞进入有丝分裂前修复DNA损伤的最后时机，p53通路是最重要的DNA损伤检验修复分子通路之一[14]。正常情况下MDM2基因处于受抑制状态，细胞无增殖能力，但当有致癌因素时，P53基因发生突变，失去抑癌功能，原癌基因MDM2被激活，表达相应的Mdm2与p53结合，使p53功能丧失，使肿瘤细胞异常增殖，从而促进肿瘤的发生和发展[15]。另外，研究[16]表明，Mdm2还可与多种生物因子相互作用，在乳腺癌的发展中发挥重要作用。Mdm2靶向促进多种蛋白降解，从而促进肿瘤细胞的生物学进展，包括促进P21蛋白酶体降解[17]，此外Mdm2还可与HIF-1α形成复合物诱导VEGF生成[18]。
ER是乳腺癌最常见的预后分子指标之一，2/3的乳腺癌细胞呈雌激素依赖性生长。ERα信号通路调节多种组织生长及发展活性，能促进乳腺癌细胞生长[19]。乳腺癌细胞中雌激素作用于ER，诱导靶基因转录而激活细胞生长，同时刺激Myc基因表达导致细胞存活，且与HER-2有交互作用[20]。通过清除雌激素抑制ERα信号通路，从而导致乳腺癌细胞生长抑制，这是他莫西芬治疗乳腺癌的基础。内分泌治疗对激素依赖性乳腺癌具有一定的治疗效果，但仍有50%的ERα阳性乳腺癌细胞对激素治疗耐药[2]。部分患者从起初对内分泌治疗有效逐步过渡到拮抗内分泌治疗，呈现不依赖激素生长的生物学改变[21]。乳腺癌患者内分泌治疗逐步发展到内分泌治疗抵抗，提示乳腺癌细胞通过改变细胞信号通路而继续生长[22]。本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中Mdm2的表达与年龄、肿瘤直径、病理类型、组织学分级及HER-2表达均无关，但与患者的TNM分期及淋巴结转移数量均有关，提示Mdm2参与ERα阳性乳腺癌的生物学进展。然而，本研究并未发现Mdm2表达与ERα阳性乳腺癌的肿瘤直径有关，这可能与病例选择及研究样本量较小有关。
ERα阳性乳腺癌中伴有高的Mdm2表达，且在雌激素作用下Mdm2表达增强[23]。MDM2基因能增强ERα的功能，但机理仍不清楚[24]。在MCF-7细胞中，能通过基因敲除MDM2基因来抑制雌激素诱导的乳腺癌细胞增殖，但同时基因敲除P53并不影响MCF-7细胞的增殖，提示Mdm2并不是通过拮抗p53来促进MCF-7细胞增殖的[25]。T-47D是一种含突变P53的乳腺癌细胞，抑制该细胞中MDM2基因的表达能减弱雌激素促进T-47D细胞的生长作用，证实Mdm2不依赖于p53，还存在其他促进乳腺癌细胞生长的机理[26]。因此，ERα与MDM2基因之间是否存在相互作用、其具体作用机理等并未完全阐明。本研究结果显示，通过沉默MDM2基因，可明显抑制MCF-7细胞的增殖和克隆形成，并诱导MCF-7细胞凋亡，提示Mdm2是参与ERα阳性乳腺癌进展的重要生物分子。
总之，本研究结果表明，ERα阳性乳腺癌组织中存在Mdm2高表达，ERα阳性乳腺癌患者的Mdm2表达与TNM分期及淋巴结转移数量均有关；siRNA沉默MDM2基因能抑制MCF-7细胞的增殖和克隆形成，并诱导细胞凋亡。该结果提示，Mdm2是ERα阳性乳腺癌的相对特异性的标志物，靶向Mdm2可能在ERα阳性乳腺癌患者的治疗中具有一定价值。
