引用本文： 李安强, 史浩, 牛启兵, 陈泉, 董方. 低分子肝素钙对急性深静脉血栓大鼠血清IL-6和TNF-α水平的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(9): 1121-1124. doi: 10.7507/1007-9424.20160286 复制
静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是临床三大血栓性疾病（心肌梗塞、缺血性脑卒中和VTE）之一[1]。急性下肢深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是临床常见的外周血管疾病，若治疗不及时，易继发致命的肺栓塞和慢性静脉瓣功能不全。炎症与血栓形成之间存在着密切的联系，一方面炎症促进高凝状态，另一方面血栓形成过程中产生的物质也可引起炎症。本实验采用低分子肝素钙（LMWH）对大鼠DVT模型进行干预后，检测血清白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平的变化，旨在研究LMWH的抗炎作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要材料
57只雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠（体质量约250 g，8周龄），购自兰州大学医学实验中心，批号：9222764。IL-6和TNF-α ELISA试剂盒均购自上海星科生物技术发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 建模及分组
将57只SD大鼠随机（随机数字表法）分为空白对照组20只和DVT组37只。所有大鼠均于腹腔内注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，取仰卧位固定、消毒铺巾；沿左下肢股静脉走行切开皮肤约3.5 cm长，显露、游离左侧股静脉，DVT组大鼠采用泰丝（1-0）结扎近心端股静脉，肉眼见左下肢肿胀，则提示造模成功，空白对照组大鼠不予结扎；采用缝线缝合手术创口。分别于术前、术后36 h行彩色多普勒超声检查大鼠左下肢静脉血栓形成情况。再将DVT大鼠随机（随机数字表法）分为实验对照组18只和LMWH组19只。空白对照组和实验对照组大鼠均给予2 mL生理盐水皮下注射，LMWH组大鼠给予2 mL稀释后的LMWH（3 U/mL）皮下注射，每12小时注射1次，于60 h后停止注射。采用千分尺测量3组大鼠术前、术后36 h和术后72 h时左下肢膝关节上6 mm处的左下肢周径变化，并于术前、术后36 h和术后72 h取大鼠心脏血液1 mL以检测血清IL-6和TNF-α水平。
1.2.2 IL-6和TNF-α水平检测
采用ELISA法检测血清IL-6和TNF-α水平，具体操作均按照ELISA试剂盒说明书进行，并于450 nm波长处测定吸光度（OD）值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同时点3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；同组内各时点比较采用重复测量资料的方差分析，两两比较采用q检验。检验水准α=0.050。
2 结果
实验过程中无大鼠死亡，建模前彩色多普勒超声检查提示所有大鼠的左下肢深静脉通畅、无DVT发生；术后36 h行彩色多普勒超声检查提示DVT组大鼠均有左下肢DVT形成，进一步证实建模成功（图 1和图 2）。
图1
示左下肢股静脉和股深静脉有DVT形成（白箭） 图 2 彩色多普勒超声检查提示股静脉和股深静脉有DVT形成（红箭）
2.1 3组大鼠各时点的左下肢周径
术前空白对照组、实验对照组及LMWH组的左下肢周径比较差异无统计学意义（P=0.555），但术后36 h和术后72 h时3组的左下肢周径比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。空白对照组3个时点的左下肢周径变化不大（P=0.343）；实验对照组的左下肢周径递增，各时点两两比较差异有统计学意义（P < 0.050）；而LMWH组的左下肢周径在术后36 h升高（P=0.009），术后72 h较术后36 h有所下降（P=0.025），见表 1。
表1
3组大鼠各时点的左下肢周径（μm，x±s）
2.2 3组大鼠各时点的血清IL-6和TNF-α水平
术前空白对照组、实验对照组及LMWH组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均无统计学意义（P > 0.050），但术后36 h和术后72 h时3组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。空白对照组3个时点的血清IL-6水平变化不大（P=0.052）；实验对照组的血清IL-6水平递增，3个时点间两两比较差异均有统计学意义（P < 0.050）；而LMWH组的血清IL-6水平在术后36 h升高（P < 0.050），术后72 h较术后36 h有所下降（P < 0.050）。空白对照组3个时点的血清TNF-α水平变化不大（P=0.672），但实验对照组和LMWH组的血清TNF-α水平随时间延长递增，3个时点间两两比较差异均有统计学意义（P < 0.050）。见表 2。
表2
3组大鼠各时点的血清IL-6和TNF-α水平（ng/mL，x±s)
3 讨论
DVT系指血液在深静脉腔内不正常地凝结，阻塞静脉管腔，从而导致静脉回流障碍，是创伤、手术、瘫痪等之后常发生的并发症，好发于下肢。下肢DVT的发生与血液瘀滞、血液高凝状态和血管壁损伤有关。有研究[2]报道，在美国，DVT发病人数每年超过100万，其因并发肺栓塞死亡的患者数量超过20万，危害极大，且高龄（80岁以上）人群的发病率达10.7%。在我国，外科病房住院患者的DVT发病率更高[3]，且大多数患者早期无明显临床表现，由于其继发肺栓塞，造成部分病例猝死[4]，故研究如何早期发现DVT是临床医生关注的话题。近几年研究[5-8]表明，炎症反应与血栓形成之间存在着密切的联系[5-6]：一方面炎症反应易继发血液高凝状态，促进血栓形成，受损的血管细胞和激活的局部炎症细胞（白细胞、单核或巨噬细胞等）能够释放一系列的细胞因子及炎症介质，如TNF-α、IL-6等，经过多种途径影响静脉血栓形成过程，其主要的途径为通过调节静脉内皮细胞的功能诱发血栓形成[7-8]；另一方面血栓形成过程中引起局部甚至全身炎症反应，如纤维蛋白沉积引起组织缺血缺氧，从而刺激炎症因子释放。二者相互促进，呈级联放大。同时，在血凝级联反应过程中发挥重要作用的凝血酶激活单核细胞、内皮细胞等表达黏附分子，释放炎症介质[9]。激活的凝血系统与炎症反应通过多个环节相互作用，相互交织成一个复杂的网络系统，导致血栓形成。
LMWH是通过化学或酶学解聚的方法从普通肝素中衍生出来的片段，长度约为普通肝素的1/3，平均相对分子质量为4 500×103，其窄谱低分子质量的分布显著优于常规肝素，具有明显的抗凝作用，作为抗凝药在临床上已广泛应用，近年来其抗炎活性也受到重视。Wan等[10]报道，给小鼠注射5 000 U/kg LMWH能有效地抑制TNF-α的表达，从而抑制白细胞沿内皮细胞上的黏附和组织浸润。Celasco等[11]研究发现，连续3 d给大鼠直肠给药LMWH，从所取鼠脾细胞的观察中发现，LMWH主要通过抑制干扰素-γ（IFN-γ）的表达而起到抗炎作用，抑制NO的合成[12-13]；此外，其还经小肠屏障作用于肠内微循环后，通过白细胞与内皮细胞的相互作用而达到抗炎作用[14]。
IL-6是由免疫细胞、非免疫细胞等多种细胞分泌的作用于血管系统的细胞因子，具有多种生物活性，是炎症反应的重要介质，是具有广泛生物效应的多功能细胞因子，可诱导干细胞合成血浆纤维蛋白原（FIB）、C反应蛋白（CRP）等急性期蛋白，从而促进血栓形成[15]。TNF-α是由单核-巨噬细胞系统及淋巴细胞产生的细胞因子，是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子。有文献[16]报道，TNF-α在炎症性肠病中被确定为重要的病理学炎症介质，是介导免疫应答和炎症反应的关键介质之一。TNF-α能导致内皮细胞形态和活性的改变，并且使单层内皮细胞的通透性增加并释放大量细胞因子[17]。
本实验通过结扎股静脉以建立大鼠DVT模型，且彩色多普勒超声检查提示大鼠左下肢DVT建立成功。实验结果显示，术后36 h和术后72 h时3组的左下肢周径比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。分析原因可能是，LMWH组由于LMWH的抗凝作用抑制了DVT的进一步发展，从而导致LMWH组大鼠的左下肢周径小于同时间点的实验对照组。此外，本实验结果还表明，术后36 h和术后72 h时3组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。该结果提示，炎症因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用，推测LMWH通过抑制大鼠DVT形成过程中IL-6和TNF-α的表达，从而达到抗炎作用[18-19]，提示抗炎作用是LMWH治疗DVT的重要途径之一，这为临床部分病例下肢DVT发生后白细胞计数和中性粒细胞升高、经低分子肝素抗凝治疗后恢复到正常范围提供了合理的解释，为LMWH临床治疗全身无菌性炎症反应及DVT提供了新的理论支持，为进一步了解LMWH的抗炎作用机理提供了重要依据。此外，LMWH独特的性质使其有望成为有效且安全的新型抗炎药物之一。
静脉血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）是临床三大血栓性疾病（心肌梗塞、缺血性脑卒中和VTE）之一[1]。急性下肢深静脉血栓（deep vein thrombosis，DVT）形成是临床常见的外周血管疾病，若治疗不及时，易继发致命的肺栓塞和慢性静脉瓣功能不全。炎症与血栓形成之间存在着密切的联系，一方面炎症促进高凝状态，另一方面血栓形成过程中产生的物质也可引起炎症。本实验采用低分子肝素钙（LMWH）对大鼠DVT模型进行干预后，检测血清白介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）水平的变化，旨在研究LMWH的抗炎作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和主要材料
57只雄性SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠（体质量约250 g，8周龄），购自兰州大学医学实验中心，批号：9222764。IL-6和TNF-α ELISA试剂盒均购自上海星科生物技术发展有限公司。
1.2 方法
1.2.1 建模及分组
将57只SD大鼠随机（随机数字表法）分为空白对照组20只和DVT组37只。所有大鼠均于腹腔内注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，取仰卧位固定、消毒铺巾；沿左下肢股静脉走行切开皮肤约3.5 cm长，显露、游离左侧股静脉，DVT组大鼠采用泰丝（1-0）结扎近心端股静脉，肉眼见左下肢肿胀，则提示造模成功，空白对照组大鼠不予结扎；采用缝线缝合手术创口。分别于术前、术后36 h行彩色多普勒超声检查大鼠左下肢静脉血栓形成情况。再将DVT大鼠随机（随机数字表法）分为实验对照组18只和LMWH组19只。空白对照组和实验对照组大鼠均给予2 mL生理盐水皮下注射，LMWH组大鼠给予2 mL稀释后的LMWH（3 U/mL）皮下注射，每12小时注射1次，于60 h后停止注射。采用千分尺测量3组大鼠术前、术后36 h和术后72 h时左下肢膝关节上6 mm处的左下肢周径变化，并于术前、术后36 h和术后72 h取大鼠心脏血液1 mL以检测血清IL-6和TNF-α水平。
1.2.2 IL-6和TNF-α水平检测
采用ELISA法检测血清IL-6和TNF-α水平，具体操作均按照ELISA试剂盒说明书进行，并于450 nm波长处测定吸光度（OD）值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，同时点3组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；同组内各时点比较采用重复测量资料的方差分析，两两比较采用q检验。检验水准α=0.050。
2 结果
实验过程中无大鼠死亡，建模前彩色多普勒超声检查提示所有大鼠的左下肢深静脉通畅、无DVT发生；术后36 h行彩色多普勒超声检查提示DVT组大鼠均有左下肢DVT形成，进一步证实建模成功（图 1和图 2）。
图1
示左下肢股静脉和股深静脉有DVT形成（白箭） 图 2 彩色多普勒超声检查提示股静脉和股深静脉有DVT形成（红箭）
2.1 3组大鼠各时点的左下肢周径
术前空白对照组、实验对照组及LMWH组的左下肢周径比较差异无统计学意义（P=0.555），但术后36 h和术后72 h时3组的左下肢周径比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。空白对照组3个时点的左下肢周径变化不大（P=0.343）；实验对照组的左下肢周径递增，各时点两两比较差异有统计学意义（P < 0.050）；而LMWH组的左下肢周径在术后36 h升高（P=0.009），术后72 h较术后36 h有所下降（P=0.025），见表 1。
表1
3组大鼠各时点的左下肢周径（μm，x±s）
2.2 3组大鼠各时点的血清IL-6和TNF-α水平
术前空白对照组、实验对照组及LMWH组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均无统计学意义（P > 0.050），但术后36 h和术后72 h时3组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。空白对照组3个时点的血清IL-6水平变化不大（P=0.052）；实验对照组的血清IL-6水平递增，3个时点间两两比较差异均有统计学意义（P < 0.050）；而LMWH组的血清IL-6水平在术后36 h升高（P < 0.050），术后72 h较术后36 h有所下降（P < 0.050）。空白对照组3个时点的血清TNF-α水平变化不大（P=0.672），但实验对照组和LMWH组的血清TNF-α水平随时间延长递增，3个时点间两两比较差异均有统计学意义（P < 0.050）。见表 2。
表2
3组大鼠各时点的血清IL-6和TNF-α水平（ng/mL，x±s)
3 讨论
DVT系指血液在深静脉腔内不正常地凝结，阻塞静脉管腔，从而导致静脉回流障碍，是创伤、手术、瘫痪等之后常发生的并发症，好发于下肢。下肢DVT的发生与血液瘀滞、血液高凝状态和血管壁损伤有关。有研究[2]报道，在美国，DVT发病人数每年超过100万，其因并发肺栓塞死亡的患者数量超过20万，危害极大，且高龄（80岁以上）人群的发病率达10.7%。在我国，外科病房住院患者的DVT发病率更高[3]，且大多数患者早期无明显临床表现，由于其继发肺栓塞，造成部分病例猝死[4]，故研究如何早期发现DVT是临床医生关注的话题。近几年研究[5-8]表明，炎症反应与血栓形成之间存在着密切的联系[5-6]：一方面炎症反应易继发血液高凝状态，促进血栓形成，受损的血管细胞和激活的局部炎症细胞（白细胞、单核或巨噬细胞等）能够释放一系列的细胞因子及炎症介质，如TNF-α、IL-6等，经过多种途径影响静脉血栓形成过程，其主要的途径为通过调节静脉内皮细胞的功能诱发血栓形成[7-8]；另一方面血栓形成过程中引起局部甚至全身炎症反应，如纤维蛋白沉积引起组织缺血缺氧，从而刺激炎症因子释放。二者相互促进，呈级联放大。同时，在血凝级联反应过程中发挥重要作用的凝血酶激活单核细胞、内皮细胞等表达黏附分子，释放炎症介质[9]。激活的凝血系统与炎症反应通过多个环节相互作用，相互交织成一个复杂的网络系统，导致血栓形成。
LMWH是通过化学或酶学解聚的方法从普通肝素中衍生出来的片段，长度约为普通肝素的1/3，平均相对分子质量为4 500×103，其窄谱低分子质量的分布显著优于常规肝素，具有明显的抗凝作用，作为抗凝药在临床上已广泛应用，近年来其抗炎活性也受到重视。Wan等[10]报道，给小鼠注射5 000 U/kg LMWH能有效地抑制TNF-α的表达，从而抑制白细胞沿内皮细胞上的黏附和组织浸润。Celasco等[11]研究发现，连续3 d给大鼠直肠给药LMWH，从所取鼠脾细胞的观察中发现，LMWH主要通过抑制干扰素-γ（IFN-γ）的表达而起到抗炎作用，抑制NO的合成[12-13]；此外，其还经小肠屏障作用于肠内微循环后，通过白细胞与内皮细胞的相互作用而达到抗炎作用[14]。
IL-6是由免疫细胞、非免疫细胞等多种细胞分泌的作用于血管系统的细胞因子，具有多种生物活性，是炎症反应的重要介质，是具有广泛生物效应的多功能细胞因子，可诱导干细胞合成血浆纤维蛋白原（FIB）、C反应蛋白（CRP）等急性期蛋白，从而促进血栓形成[15]。TNF-α是由单核-巨噬细胞系统及淋巴细胞产生的细胞因子，是机体炎症反应与免疫应答的重要调节因子。有文献[16]报道，TNF-α在炎症性肠病中被确定为重要的病理学炎症介质，是介导免疫应答和炎症反应的关键介质之一。TNF-α能导致内皮细胞形态和活性的改变，并且使单层内皮细胞的通透性增加并释放大量细胞因子[17]。
本实验通过结扎股静脉以建立大鼠DVT模型，且彩色多普勒超声检查提示大鼠左下肢DVT建立成功。实验结果显示，术后36 h和术后72 h时3组的左下肢周径比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。分析原因可能是，LMWH组由于LMWH的抗凝作用抑制了DVT的进一步发展，从而导致LMWH组大鼠的左下肢周径小于同时间点的实验对照组。此外，本实验结果还表明，术后36 h和术后72 h时3组的血清IL-6水平和TNF-α水平比较差异均有统计学意义（P=0.000），均是实验对照组 > LMWH组 > 空白对照组。该结果提示，炎症因子IL-6和TNF-α在DVT形成中具有重要作用，推测LMWH通过抑制大鼠DVT形成过程中IL-6和TNF-α的表达，从而达到抗炎作用[18-19]，提示抗炎作用是LMWH治疗DVT的重要途径之一，这为临床部分病例下肢DVT发生后白细胞计数和中性粒细胞升高、经低分子肝素抗凝治疗后恢复到正常范围提供了合理的解释，为LMWH临床治疗全身无菌性炎症反应及DVT提供了新的理论支持，为进一步了解LMWH的抗炎作用机理提供了重要依据。此外，LMWH独特的性质使其有望成为有效且安全的新型抗炎药物之一。
