引用本文： 杨晓佳, 石乔, 余佳, 陈辰, 何斌, 赵亮, 王鹏, 胡鹏, 李晨, 郭闻一, 王卫星. TNF-α介导重症急性胰腺炎肾上腺细胞的凋亡. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(10): 1198-1203. doi: 10.7507/1007-9424.20160307 复制
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种严重危害人类健康、常见且多发的外科急腹症，病情凶险，容易引起全身炎症反应综合征（syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS），导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syn-drome，MODS）等严重并发症，病死率高达20%～40% [1]。目前，对SAP引起的肺、肾损伤研究较多[2-4]，而对SAP相关肾上腺损伤的研究还不多见。SAP早期就可出现肾上腺损伤和肾上腺功能不全。有研究[5]显示，约有16%的SAP患者合并有肾上腺损伤和肾上腺功能不全，而合并有MODS的SAP患者约有27%会发生肾上腺损伤和肾上腺功能不全，提示肾上腺的损伤有可能加重病情，促使MODS的发生。本研究旨在观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在胰腺炎相关性肾上腺细胞凋亡中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
牛磺胆酸钠溶液（STC，美国Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α抗体及Caspase-3抗体（美国Abcam公司），TUNEL凋亡试剂盒（Roche公司）。
1.2 实验动物分组和模型制备
1.2.1 实验动物分组
40只SPF级雄性Wistar大鼠（湖北省疾病预防控制中心提供），鼠龄7～8周、体质量200～250 g。采用随机数字表法随机分为假手术组（SO组，n=8）和SAP组（n=32）；SAP组再按3、6、12及24 h观察时间点分为4个亚组，每组各8只。
1.2.2 SAP大鼠模型制备
实验大鼠术前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）进行麻醉，取上腹正中切口进腹，翻动十二指肠找到十二指肠乳头开口，用钝性细针头沿十二指肠乳头逆行插入胆胰管，用无损伤血管夹分别肝门处的胆总管及针头插入处的胆胰管，恒速注入（0.1 mL/100 g）5%牛磺胆酸钠溶液（0.1 mL/100 g），并保持胆胰管夹闭5 min，5 min后若观察发现胰腺出现出血、水肿等情况则表明造模成功，关腹。SO组大鼠开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹。造模成功后2组大鼠均皮下补液（2 mL/100 g）。
1.3 标本采集
SAP组大鼠分别于造模术后3、6、12及24 h以及SO组大鼠在术后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，心脏采血10 mL，采集血液于2 000 r/min（r=20 cm）下离心15 min，分离血清保存于于-20 ℃备用。肉眼观察胰腺组织及肾上腺组织的大体病理改变，取胰头组织及左侧肾上腺组织，以4%多聚甲醛固定，行HE染色，光镜下观察。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LIP）测定
采用全自动生化分析仪（日本奥林巴斯2700，武汉大学人民医院检验科）测定血清AMY及LIP水平。
1.4.2 组织病理学改变观察
取胰头和左侧肾上腺用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色，光镜下观察组织病理改变。观察胰腺水肿、腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎症、血管周围炎性浸润等情况，根据Schmidt等[6]的方法，进行病理学评分。选取肾上腺病理切片，在高倍镜下观察并拍照，请两位资深病理学专家盲法阅片，根据本实验室前期研究[7]所提出的评分标准，并根据血窦扩张、细胞变性、细胞坏死及炎性细胞浸润情况进行评分，计算平均分，即为标本病理损伤的评分。其具体的评分标准[7]为：①血窦扩张。无血窦扩张、0分；1～10个血窦扩张、0.5分；11～20个血窦扩张、1分；21～30个血窦扩张、1.5分；≥31个血窦扩张、2分。②细胞变性面积。无细胞变性、0分；0～5%细胞发生变性、0.5分；5%～10%细胞发生变性、1分；10%～15%细胞发生变性、1.5分；15%～20%细胞发生变性、2分；20%～25%细胞发生变性、2.5分；25%～30%细胞发生变性、3分；30%～35细胞发生变性、3.5分；35%以上细胞发生变性、4分。③细胞坏死。未见细胞坏死、0分；1处出现1～5个细胞坏死、1分；2处及以上出现1～5个细胞坏死、2分；“2分”标准+1处出现5个以上细胞坏死、3分； > 2处出现5个以上细胞坏死、4分。④炎性细胞浸润。未见炎性细胞浸润、0分；1～5个炎性细胞浸润、1分；5个以上炎性细胞浸润、2分。
1.4.3 原位细胞凋亡检测
采用原位末端标记（TUNEL）法、按照试剂盒说明书进行。每张肾上腺组织TUNEL染色切片随机选取5个高倍视野，计算每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数表示。肾上腺细胞凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.4.4 TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测
采用蛋白质印迹法（Western blot）检测肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白的表达。提取各组大鼠肾上腺组织的总蛋白，取10 μL蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳、电转、封闭，加一抗、二抗后，用Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR Odyssey，武汉大学人民医院中心实验室）扫描，并分析图像。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0软件分析。所有计量数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 血清AMY及LIP水平检测结果
造模术后各时间点SAP组大鼠血清AMY及LIP水平均较SO组高（AMY：t3 h=4.05、P < 0.05，t6 h=12.49、P < 0.05，t12 h=16.37、P < 0.05，t24 h=17.74、P < 0.05；LIP：t3 h=3.20、P < 0.05，t6 h=20.96、P < 0.05，t12 h=25.84、P < 0.05，t24 h=39.73、P < 0.05），差异具有统计学意义；SAP组造模术后血清AMY及LIP水平逐渐升高，后一时相与前一时相比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠血清AMY及LIP水平检测结果
2.2 胰腺组织病理学改变
SO组胰腺组织未见出血、水肿、坏死等改变，SAP组胰腺出现明显出血、坏死等改变，并伴有皂化斑出现，以24 h组最为严重。光镜下观察，SO组胰腺组织正常，未见水肿、出血及炎性细胞浸润（图 1A）；SAP组胰腺组织病理损害随着造模术后时间的延长进行性加重，可见腺体破坏，腺泡水肿、坏死，间质出血，炎性细胞浸润（图 1B～1E）。SAP组造模术后各时间点Schmidt病理评分进行性升高，且均高于SO组（t3 h=7.40，P < 0.05；t6 h=12.65，P < 0.05；t12 h=24.16，P < 0.05；t24 h=31.26，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 1F）。
图1
示各组大鼠胰腺组织病理学改变（HE ×200）及其病理学评分。1A：SO组；1B：SAP 3 h组；1C：SAP 6 h组；1D：SAP 12 h组；1E：SAP 24 h组；1F：胰腺组织病理学评分，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05 图 2 示各组大鼠肾上腺组织病理学改变（HE ×200）及其病理学评分。2A：SO组；2B：SAP 3 h组；2C：SAP 6 h组；2D：SAP 12 h组；2E：SAP 24 h组；2F：肾上腺组织病理学评分，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
2.3 肾上腺组织的病理学改变
2.3.1 肾上腺大体观察结果
SO组肾上腺包膜红润、光滑，未见水肿、皂化斑等改变；SAP组肾上腺包膜紧张，水肿，周围可见皂化斑出现，以24 h组最为严重。
2.3.2 肾上腺组织病理学改变
SO组肾上腺皮质腺体结构完整，未见肿胀、出血等改变，未见炎性细胞浸润（图 2A）。造模术后3 h见肾上腺稍水肿，未见明显出血和炎性细胞浸润，腺体结构基本完整，随着造模术后时间的延长，水肿情况进行性加重，间质出血，炎性细胞增多，腺体结构遭到破坏，至造模术后24 h时，可观察到皮质细胞破坏，可见片状出血，炎性细胞浸润明显，出现片状坏死，肾上腺腺体结构遭到明显破坏（图 2B～2E）。SAP组随病程发展，肾上腺组织的病理学评分进行性升高，且各时间点肾上腺组织病理学评分均较SO组高（t3 h=11.19，P < 0.05；t6 h=16.78，P < 0.05；t12 h=21.23，P < 0.05；t24 h=25.80，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 2F)。
2.4 肾上腺细胞凋亡检测结果
SO组肾上腺凋亡细胞数较少（图 3A），SAP组肾上腺凋亡细胞则明显增多（图 3B），且随病程延长，AI进行性升高，SAP各时相组均高于SO组（t3 h=10.84, P < 0.05；t6 h=14.44，P < 0.05；t12 h=19.24，P < 0.05；t24 h=24.55，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 3C）。
图3
示各组大鼠肾上腺组织TUNEL染色结果（TUNEL ×200）及AI检测结果。3A：SO组；3B：SAP 12 h组；3C：肾上腺细胞AI，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
2.5 肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测结果
应用Western blot法对SAP造模后不同时相的肾上腺组织TNF-α及Caspase-3蛋白表达进行半定量分析，结果显示，SO组大鼠肾上腺组织中TNF-α蛋白表达水平较低，而在SAP造模后3、6、12及24 h其表达水平均高于SO组，且随病程延长逐渐升高，至24 h略有下降，但仍高于SO组（t3 h=5.08, P < 0.05；t6 h=3.39，P < 0.05；t12 h=8.29，P < 0.05；t24 h=17.46，P < 0.05），差异有统计学意义。Caspase-3蛋白在造模后随病程延长逐渐升高，24 h时略有下降，但均高于SO组（t3 h=9.59, P < 0.05；t6 h=3.72，P < 0.05；t12 h=3.82，P < 0.05；t24 h=8.53，P < 0.05），差异有统计学意义。见图 4。
图4
示肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测结果。4A：Western blot电泳图，1为SO组，2为SAP 3 h组，3为SAP 6 h组，4为SAP 12 h组，5为SAP 24 h组；4B：TNF-α蛋白相对表达水平；4C：Caspase3蛋白相对表达水平。与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
3 讨论
目前研究表明，临床上约20%～30%的急性胰腺炎患者会发展为SAP，甚至可能发展为多脏器功能障碍（MODS），病情危重，主要表现为胰腺坏死和胰外器官的损伤[8]，其中30%～70%的危重患者可能伴发肾上腺功能不全[9]。有研究[10]表明，在继发性肾上腺损伤中可出现细胞凋亡现象，细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，而目前关于SAP肾上腺功能不全中肾上腺细胞凋亡的相关研究报道较少。
SAP早期时存在炎症细胞过度激活，大量炎症介质入血，引发瀑布样级联反应，导致多器官功能紊乱、衰竭及组织损伤。有研究[5, 11]表明，急性胰腺炎合并MODS时，肾上腺功能已经部分或完全丧失，主要表现为影像学肾上腺血流灌注的改变或组织学肾上腺组织形态破坏。本实验结果发现，肾上腺损伤后的病理学改变有血窦扩张，血管充血，细胞变性、坏死，炎症细胞浸润等，且SAP组肾上腺病理学评分逐渐升高，提示肾上腺损伤情况与SAP病情发展一致。
正常成年大鼠肾上腺皮质细胞不断在外层增殖，并向内层迁移形成各细胞层，以维持其稳定的形态和功能，正常大鼠肾上腺皮质细胞在最内侧的网状带凋亡[12]。有研究[13]显示，正常大鼠肾上腺有53个凋亡相关基因，其中39个具有促凋亡活性，14个有抗凋亡活性。另外有研究[14]也表明，在急慢性疾病中发生的继发性肾上腺损伤中可出现肾上腺细胞凋亡现象，SAP早期就可出现肾上腺损伤和肾上腺功能不全。
TNF-α是一种多效的促炎症反应细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，还有少部分由其他细胞产生。TNF-α通过与TNF-R1和TNF-R2结合，从而发挥多种效应，但其诱导凋亡效应主要由TNF-R1介导[15]。TNF-α与TNF-R1结合后形成的蛋白复合物可以通过线粒体途径放大活性，从而调控线粒体通透性的转变（MPT），诱导细胞色素C的释放，最终活化Caspase-3。同时，释放出来的第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活蛋白（Smac/Diablo）与X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）结合，使其对Caspase-3的抑制作用减弱，进而导致Caspase-3的充分激活[16-18]。Caspase-3是直接诱导细胞凋亡最重要的效应蛋白酶之一，是凋亡机理的核心成分[19-20]。在诱导细胞凋亡因素的作用下，Caspase-3被激活，活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸残基后切断肽键的能力，使细胞产生核皱缩、DNA断裂等凋亡现象[21]。本实验结果显示，SAP造模术后各时间点肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达均随着病程的进展逐渐升高，到12 h时表达最高，24 h略有下降，提示在肾上腺损伤过程中，可能由于TNF-α蛋白表达的增加，促进了Caspase-3蛋白的表达，从而导致肾上腺细胞凋亡增加，引起肾上腺的损伤。TNF-α及Caspase-3蛋白的表达与肾上腺损伤一致，说明在SAP大鼠，由于TNF-α表达的增高，在它的作用下，Caspase-3从线粒体释放并激活，导致肾上腺细胞内重要蛋白质降解失活及DNA断裂，最终使细胞发生凋亡。
本研究结果表明，SAP时可出现肾上腺损伤及肾上腺功能不全，随着肾上腺凋亡细胞的增多，肾上腺病理损伤进行性恶化，而TNF-α和Caspase-3蛋白表达在SAP组进行性升高，12 h达到顶峰，至24 h组略有下降。有文献[22-23]报道，在肝细胞损伤过程中细胞凋亡的发生早于细胞坏死。因此我们推测，肾上腺损伤首先由TNF-α介导的细胞凋亡引起，且凋亡程度与病情发展一致，而到24 h时，肾上腺损伤已十分严重，此时的损伤不再以凋亡为主，而是以细胞坏死为主，因此TNF-α和Caspase-3蛋白的表达则略有下降。本研究结果提示，TNF-α和Caspase-3可能参与了肾上腺细胞凋亡的调控。通过抑制TNF-α和Caspase-3的表达，可能可以减少细胞凋亡的发生，对SAP时肾上腺细胞的损伤可起到一定的保护作用。但在胰腺炎病程中，肾上腺损伤的机理复杂，仍需深入研究。
重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一种严重危害人类健康、常见且多发的外科急腹症，病情凶险，容易引起全身炎症反应综合征（syste-mic inflammatory response syndrome，SIRS），导致多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syn-drome，MODS）等严重并发症，病死率高达20%～40% [1]。目前，对SAP引起的肺、肾损伤研究较多[2-4]，而对SAP相关肾上腺损伤的研究还不多见。SAP早期就可出现肾上腺损伤和肾上腺功能不全。有研究[5]显示，约有16%的SAP患者合并有肾上腺损伤和肾上腺功能不全，而合并有MODS的SAP患者约有27%会发生肾上腺损伤和肾上腺功能不全，提示肾上腺的损伤有可能加重病情，促使MODS的发生。本研究旨在观察肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在胰腺炎相关性肾上腺细胞凋亡中的作用。
1 材料与方法
1.1 主要材料及试剂
牛磺胆酸钠溶液（STC，美国Sigma公司），兔抗大鼠TNF-α抗体及Caspase-3抗体（美国Abcam公司），TUNEL凋亡试剂盒（Roche公司）。
1.2 实验动物分组和模型制备
1.2.1 实验动物分组
40只SPF级雄性Wistar大鼠（湖北省疾病预防控制中心提供），鼠龄7～8周、体质量200～250 g。采用随机数字表法随机分为假手术组（SO组，n=8）和SAP组（n=32）；SAP组再按3、6、12及24 h观察时间点分为4个亚组，每组各8只。
1.2.2 SAP大鼠模型制备
实验大鼠术前禁食12 h，自由饮水。腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）进行麻醉，取上腹正中切口进腹，翻动十二指肠找到十二指肠乳头开口，用钝性细针头沿十二指肠乳头逆行插入胆胰管，用无损伤血管夹分别肝门处的胆总管及针头插入处的胆胰管，恒速注入（0.1 mL/100 g）5%牛磺胆酸钠溶液（0.1 mL/100 g），并保持胆胰管夹闭5 min，5 min后若观察发现胰腺出现出血、水肿等情况则表明造模成功，关腹。SO组大鼠开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹。造模成功后2组大鼠均皮下补液（2 mL/100 g）。
1.3 标本采集
SAP组大鼠分别于造模术后3、6、12及24 h以及SO组大鼠在术后3 h腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，心脏采血10 mL，采集血液于2 000 r/min（r=20 cm）下离心15 min，分离血清保存于于-20 ℃备用。肉眼观察胰腺组织及肾上腺组织的大体病理改变，取胰头组织及左侧肾上腺组织，以4%多聚甲醛固定，行HE染色，光镜下观察。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 血清淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LIP）测定
采用全自动生化分析仪（日本奥林巴斯2700，武汉大学人民医院检验科）测定血清AMY及LIP水平。
1.4.2 组织病理学改变观察
取胰头和左侧肾上腺用4%多聚甲醛固定、切片、HE染色，光镜下观察组织病理改变。观察胰腺水肿、腺泡坏死、出血和脂肪坏死、炎症、血管周围炎性浸润等情况，根据Schmidt等[6]的方法，进行病理学评分。选取肾上腺病理切片，在高倍镜下观察并拍照，请两位资深病理学专家盲法阅片，根据本实验室前期研究[7]所提出的评分标准，并根据血窦扩张、细胞变性、细胞坏死及炎性细胞浸润情况进行评分，计算平均分，即为标本病理损伤的评分。其具体的评分标准[7]为：①血窦扩张。无血窦扩张、0分；1～10个血窦扩张、0.5分；11～20个血窦扩张、1分；21～30个血窦扩张、1.5分；≥31个血窦扩张、2分。②细胞变性面积。无细胞变性、0分；0～5%细胞发生变性、0.5分；5%～10%细胞发生变性、1分；10%～15%细胞发生变性、1.5分；15%～20%细胞发生变性、2分；20%～25%细胞发生变性、2.5分；25%～30%细胞发生变性、3分；30%～35细胞发生变性、3.5分；35%以上细胞发生变性、4分。③细胞坏死。未见细胞坏死、0分；1处出现1～5个细胞坏死、1分；2处及以上出现1～5个细胞坏死、2分；“2分”标准+1处出现5个以上细胞坏死、3分； > 2处出现5个以上细胞坏死、4分。④炎性细胞浸润。未见炎性细胞浸润、0分；1～5个炎性细胞浸润、1分；5个以上炎性细胞浸润、2分。
1.4.3 原位细胞凋亡检测
采用原位末端标记（TUNEL）法、按照试剂盒说明书进行。每张肾上腺组织TUNEL染色切片随机选取5个高倍视野，计算每100个细胞中的凋亡细胞数，以百分数表示。肾上腺细胞凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.4.4 TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测
采用蛋白质印迹法（Western blot）检测肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白的表达。提取各组大鼠肾上腺组织的总蛋白，取10 μL蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳、电转、封闭，加一抗、二抗后，用Odyssey双色红外激光成像系统（LI-COR Odyssey，武汉大学人民医院中心实验室）扫描，并分析图像。
1.5 统计学方法
采用SPSS 19.0软件分析。所有计量数据均以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 血清AMY及LIP水平检测结果
造模术后各时间点SAP组大鼠血清AMY及LIP水平均较SO组高（AMY：t3 h=4.05、P < 0.05，t6 h=12.49、P < 0.05，t12 h=16.37、P < 0.05，t24 h=17.74、P < 0.05；LIP：t3 h=3.20、P < 0.05，t6 h=20.96、P < 0.05，t12 h=25.84、P < 0.05，t24 h=39.73、P < 0.05），差异具有统计学意义；SAP组造模术后血清AMY及LIP水平逐渐升高，后一时相与前一时相比较差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。
表1
各组大鼠血清AMY及LIP水平检测结果
2.2 胰腺组织病理学改变
SO组胰腺组织未见出血、水肿、坏死等改变，SAP组胰腺出现明显出血、坏死等改变，并伴有皂化斑出现，以24 h组最为严重。光镜下观察，SO组胰腺组织正常，未见水肿、出血及炎性细胞浸润（图 1A）；SAP组胰腺组织病理损害随着造模术后时间的延长进行性加重，可见腺体破坏，腺泡水肿、坏死，间质出血，炎性细胞浸润（图 1B～1E）。SAP组造模术后各时间点Schmidt病理评分进行性升高，且均高于SO组（t3 h=7.40，P < 0.05；t6 h=12.65，P < 0.05；t12 h=24.16，P < 0.05；t24 h=31.26，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 1F）。
图1
示各组大鼠胰腺组织病理学改变（HE ×200）及其病理学评分。1A：SO组；1B：SAP 3 h组；1C：SAP 6 h组；1D：SAP 12 h组；1E：SAP 24 h组；1F：胰腺组织病理学评分，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05 图 2 示各组大鼠肾上腺组织病理学改变（HE ×200）及其病理学评分。2A：SO组；2B：SAP 3 h组；2C：SAP 6 h组；2D：SAP 12 h组；2E：SAP 24 h组；2F：肾上腺组织病理学评分，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
2.3 肾上腺组织的病理学改变
2.3.1 肾上腺大体观察结果
SO组肾上腺包膜红润、光滑，未见水肿、皂化斑等改变；SAP组肾上腺包膜紧张，水肿，周围可见皂化斑出现，以24 h组最为严重。
2.3.2 肾上腺组织病理学改变
SO组肾上腺皮质腺体结构完整，未见肿胀、出血等改变，未见炎性细胞浸润（图 2A）。造模术后3 h见肾上腺稍水肿，未见明显出血和炎性细胞浸润，腺体结构基本完整，随着造模术后时间的延长，水肿情况进行性加重，间质出血，炎性细胞增多，腺体结构遭到破坏，至造模术后24 h时，可观察到皮质细胞破坏，可见片状出血，炎性细胞浸润明显，出现片状坏死，肾上腺腺体结构遭到明显破坏（图 2B～2E）。SAP组随病程发展，肾上腺组织的病理学评分进行性升高，且各时间点肾上腺组织病理学评分均较SO组高（t3 h=11.19，P < 0.05；t6 h=16.78，P < 0.05；t12 h=21.23，P < 0.05；t24 h=25.80，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 2F)。
2.4 肾上腺细胞凋亡检测结果
SO组肾上腺凋亡细胞数较少（图 3A），SAP组肾上腺凋亡细胞则明显增多（图 3B），且随病程延长，AI进行性升高，SAP各时相组均高于SO组（t3 h=10.84, P < 0.05；t6 h=14.44，P < 0.05；t12 h=19.24，P < 0.05；t24 h=24.55，P < 0.05），差异具有统计学意义（图 3C）。
图3
示各组大鼠肾上腺组织TUNEL染色结果（TUNEL ×200）及AI检测结果。3A：SO组；3B：SAP 12 h组；3C：肾上腺细胞AI，与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
2.5 肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测结果
应用Western blot法对SAP造模后不同时相的肾上腺组织TNF-α及Caspase-3蛋白表达进行半定量分析，结果显示，SO组大鼠肾上腺组织中TNF-α蛋白表达水平较低，而在SAP造模后3、6、12及24 h其表达水平均高于SO组，且随病程延长逐渐升高，至24 h略有下降，但仍高于SO组（t3 h=5.08, P < 0.05；t6 h=3.39，P < 0.05；t12 h=8.29，P < 0.05；t24 h=17.46，P < 0.05），差异有统计学意义。Caspase-3蛋白在造模后随病程延长逐渐升高，24 h时略有下降，但均高于SO组（t3 h=9.59, P < 0.05；t6 h=3.72，P < 0.05；t12 h=3.82，P < 0.05；t24 h=8.53，P < 0.05），差异有统计学意义。见图 4。
图4
示肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达检测结果。4A：Western blot电泳图，1为SO组，2为SAP 3 h组，3为SAP 6 h组，4为SAP 12 h组，5为SAP 24 h组；4B：TNF-α蛋白相对表达水平；4C：Caspase3蛋白相对表达水平。与SO组比较，*P < 0.05；SAP组内与前一时间点比较，△ P < 0.05
3 讨论
目前研究表明，临床上约20%～30%的急性胰腺炎患者会发展为SAP，甚至可能发展为多脏器功能障碍（MODS），病情危重，主要表现为胰腺坏死和胰外器官的损伤[8]，其中30%～70%的危重患者可能伴发肾上腺功能不全[9]。有研究[10]表明，在继发性肾上腺损伤中可出现细胞凋亡现象，细胞凋亡是为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，而目前关于SAP肾上腺功能不全中肾上腺细胞凋亡的相关研究报道较少。
SAP早期时存在炎症细胞过度激活，大量炎症介质入血，引发瀑布样级联反应，导致多器官功能紊乱、衰竭及组织损伤。有研究[5, 11]表明，急性胰腺炎合并MODS时，肾上腺功能已经部分或完全丧失，主要表现为影像学肾上腺血流灌注的改变或组织学肾上腺组织形态破坏。本实验结果发现，肾上腺损伤后的病理学改变有血窦扩张，血管充血，细胞变性、坏死，炎症细胞浸润等，且SAP组肾上腺病理学评分逐渐升高，提示肾上腺损伤情况与SAP病情发展一致。
正常成年大鼠肾上腺皮质细胞不断在外层增殖，并向内层迁移形成各细胞层，以维持其稳定的形态和功能，正常大鼠肾上腺皮质细胞在最内侧的网状带凋亡[12]。有研究[13]显示，正常大鼠肾上腺有53个凋亡相关基因，其中39个具有促凋亡活性，14个有抗凋亡活性。另外有研究[14]也表明，在急慢性疾病中发生的继发性肾上腺损伤中可出现肾上腺细胞凋亡现象，SAP早期就可出现肾上腺损伤和肾上腺功能不全。
TNF-α是一种多效的促炎症反应细胞因子，主要由活化的巨噬细胞产生，还有少部分由其他细胞产生。TNF-α通过与TNF-R1和TNF-R2结合，从而发挥多种效应，但其诱导凋亡效应主要由TNF-R1介导[15]。TNF-α与TNF-R1结合后形成的蛋白复合物可以通过线粒体途径放大活性，从而调控线粒体通透性的转变（MPT），诱导细胞色素C的释放，最终活化Caspase-3。同时，释放出来的第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活蛋白（Smac/Diablo）与X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）结合，使其对Caspase-3的抑制作用减弱，进而导致Caspase-3的充分激活[16-18]。Caspase-3是直接诱导细胞凋亡最重要的效应蛋白酶之一，是凋亡机理的核心成分[19-20]。在诱导细胞凋亡因素的作用下，Caspase-3被激活，活化后的Caspase-3具有在天冬氨酸残基后切断肽键的能力，使细胞产生核皱缩、DNA断裂等凋亡现象[21]。本实验结果显示，SAP造模术后各时间点肾上腺组织中TNF-α及Caspase-3蛋白表达均随着病程的进展逐渐升高，到12 h时表达最高，24 h略有下降，提示在肾上腺损伤过程中，可能由于TNF-α蛋白表达的增加，促进了Caspase-3蛋白的表达，从而导致肾上腺细胞凋亡增加，引起肾上腺的损伤。TNF-α及Caspase-3蛋白的表达与肾上腺损伤一致，说明在SAP大鼠，由于TNF-α表达的增高，在它的作用下，Caspase-3从线粒体释放并激活，导致肾上腺细胞内重要蛋白质降解失活及DNA断裂，最终使细胞发生凋亡。
本研究结果表明，SAP时可出现肾上腺损伤及肾上腺功能不全，随着肾上腺凋亡细胞的增多，肾上腺病理损伤进行性恶化，而TNF-α和Caspase-3蛋白表达在SAP组进行性升高，12 h达到顶峰，至24 h组略有下降。有文献[22-23]报道，在肝细胞损伤过程中细胞凋亡的发生早于细胞坏死。因此我们推测，肾上腺损伤首先由TNF-α介导的细胞凋亡引起，且凋亡程度与病情发展一致，而到24 h时，肾上腺损伤已十分严重，此时的损伤不再以凋亡为主，而是以细胞坏死为主，因此TNF-α和Caspase-3蛋白的表达则略有下降。本研究结果提示，TNF-α和Caspase-3可能参与了肾上腺细胞凋亡的调控。通过抑制TNF-α和Caspase-3的表达，可能可以减少细胞凋亡的发生，对SAP时肾上腺细胞的损伤可起到一定的保护作用。但在胰腺炎病程中，肾上腺损伤的机理复杂，仍需深入研究。
