引用本文： 杨民, 李媛, 雷长江, 李磊, 冯加锐, 龚小军, 杨锐. 磷脂酰肌醇蛋白多糖-3对Hippo信号通路的调控机制及其对肝癌Huh7细胞生物学行为的影响. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(11): 1315-1320. doi: 10.7507/1007-9424.20160338 复制
我国是肝细胞癌（以下简称肝癌）的发病人数约占全球肝癌总发病人数的55%以上，而死亡率高达45% [1]。因此，了解肝癌的发病机制对靶向治疗十分重要。肿瘤的形成是一个十分复杂的病理过程，通常伴随着细胞的增殖和凋亡，并同时涉及多种细胞增殖凋亡相关基因的异常表达[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 （GPC3）是一种癌胚蛋白，可通过调控细胞信号传导通路促进肝癌的发生、发展[4-6]。Hippo信号通路是近年来新发现的一条细胞信号传导通路，对细胞增殖和凋亡平衡具有关键调节作用[7-8]。YAP1是Hippo信号通路的核心效应因子，在正常机体细胞内发挥信号传导和基因转录调节的作用，有关YAP1促进肝癌细胞增殖的作用已得到证实[9-10]。然而有关GPC3与Hippo信号通路的作用机制及其对肝癌细胞的影响，国内外鲜有报道。本研究通过RNA干扰技术构建GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，以脂质体转染的方式导入人肝癌细胞株Huh7，以观察GPC3和YAP1对人肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
人肝癌Huh7细胞株，中科院上海细胞库；DMEM高糖培养基，美国HyClone公司；胰蛋白酶，美国Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），美国HyClone公司；T4 DNA连接酶，美国Ferments公司；Lipofecta-mine2000和Opti-MEM培养基，美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒，美国Qiagen公司；Trizol RNA提取试剂盒，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒，美国ABI Applied Biosystems公司；PCR试剂盒，日本TaKaRa公司；兔抗人GPC3、YAP1一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及ECL显色试剂盒，美国Santa Cruz公司；Cell-LightTM EdU荧光显微镜检测试剂盒，广州锐博生物科技有限公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，德国Bender公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养传代
人肝癌Huh7细胞接种于DMEM高糖培养基（10% FBS、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素），37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。 85% 融合时，0.25%胰蛋白酶消化，传代。取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2.2 靶向GPC3和YAP1
shRNA重组质粒的构建参照文献[11]，根据GPC3基因信息（GenBank，No.NM_001164617），委托上海生物工程技术服务有限公司合成4条与其他基因编码序列无同源性的shRNA序列。shRNA形成DNA后与pGPU6/gfp/Neo载体连接，构建重组质粒。重组质粒转化感受态DH5α大肠杆菌，提取质粒，委托上海生物工程技术服务有限公司测序鉴定。参照文献[12]，根据YAP1基因信息（GenBank，No. NM_006106.2），构建干扰YAP1表达的重组质粒并进行测序鉴定。见表 1。
表1
GPC3和YAP1 shRNA序列
1.2.3 靶向GPC3和YAP1
shRNA重组质粒的转染筛选 人肝癌Huh7细胞接种于6孔板后进行转染实验。A液：1 μg GPC3-shRNA用50 μL Opti-MEM稀释，静置10 min。B液：2 μL Lipofectamine2000用50 μL Opti-MEM稀释，静置10 min。混合A、B液，静置20 min。取出培养的Huh7细胞，弃去原培养液并用无血清培养液漂洗，再加入1 mL无血清培养液和A与B的混合液，孵育6 h。6 h后，弃去转染液，更换为完全培养基。培养72 h后，观察细胞转染情况。将转染效率最高的重组质粒用于后续实验。GPC3 shRNA重组质粒转染实验分为6组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ GPC3-714-shRNA组：转染GPC3-714-shRNA重组质粒；④ GPC3-647-shRNA组：转染GPC3-647-shRNA重组质粒；⑤ GPC3-1718-shRNA组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒；⑥ GPC3-2134-shRNA组：转染GPC3-2134-shRNA重组质粒。以相同方法进行YAP1 shRNA重组质粒转染实验，分为6组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接YAP1-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ YAP1-906-shRNA组：转染YAP1-906-shRNA重组质粒；④ YAP1-1363-shRNA组：转染YAP1-1363-shRNA重组质粒；⑤ YAP1-1666-shRNA组：转染YAP1-1666-shRNA重组质粒；⑥ YAP1-2895-shRNA组：转染YAP1-2895-shRNA重组质粒。
1.2.4 GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控
人肝癌Huh7细胞接种于6孔板后进行转染实验，分为5组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ GPC3-1718-shRNA组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒；④ GPC3-1718-shRNA+rhYAP1组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒，同时在细胞培养时加入了rhYAP1；⑤ YAP1-1666-shRNA组：转染YAP1-1666-shRNA重组质粒。转染72 h后，检测各组细胞中YAP1 mRNA和蛋白表达。
1.2.5 荧光定量PCR法检测GPC3
mRNA和YAP1 mRNA表达 Trizol 法提取总RNA，并逆转录成cDNA。参照文献[13-14]，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成GPC3和YAP1引物。GPC3上游引物为5ʹ-CGAGATAAGCACCTTTCACAACC-3ʹ，下游引物为5ʹ-AGAAGAAGCACACCACCGAGA-3ʹ；PCR条件：95℃ 预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸45 s，共40个循环。YAP1上游引物为5ʹ-AATGACGAC-CAATAGCTCAGATCC-3ʹ，下游引物为5ʹ-CACTGT-AGCTGCTCATGCTTAGTCC-3ʹ；PCR条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法分析GPC3和YAP1 mRNA的相对表达量。
1.2.6 蛋白印迹法检测GPC3和YAP1蛋白表达
收集各组细胞，PBS淋洗后加入RIPA裂解液裂解，转移至离心管，15 000 r/min （r=5 cm），离心30 min，取上清于-20 ℃保存备用。50 μg等量总蛋白上样，经8% SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，TBST淋洗3次，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入GPC3一抗，4 ℃孵育过夜；TBST淋洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；TBST淋洗3次，DAB显色。同理，检测各组YAP1蛋白表达。
1.2.7 Edu细胞增殖检测
Huh7细胞接种于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL的EdU溶液（50 μmol/L）。孵育2 h后弃去培养基，PBS洗涤，每孔加入100 μL 的4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mg/mL甘氨酸，振摇10 min后弃去溶液，PBS洗涤。每孔加入100 μL的1×Apollo®染色液，室温避光振摇30 min，弃去染色液，PBS洗涤。每孔加入100 μL的1×Hoechst 33342反应液，室温避光振摇30 min，弃去染色液，PBS洗涤。最后在荧光显微镜下观察增殖细胞染色情况。
1.2.8 Transwell检测细胞侵袭能力
Huh7细胞接种于自带基质胶的Transwell小室上室，下室加入DMEM高糖培养基（10% FBS、105 U/L青霉素、100mg/L链霉素），37 ℃，5% CO2孵育12 h，棉签擦去靠近基底膜内室的细胞，另一面细胞经10%甲醇固定，PBS洗涤，结晶紫染色，PBS洗涤，显微镜下观察细胞并记数。
1.2.9 流式细胞仪检测细胞凋亡
将Huh7细胞接种于6孔板培养，转染24 h后弃去培养基，以PBS淋洗，再用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集细胞以2 000 r/min （r=5 cm），离心10 min，弃上清。按Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作用流式细胞仪检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计学软件分析所有数据。所有实验数据均取5次实验结果的平均值，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-Way ANOVO单因素方差分析，组内两两比较采用q检验，取双侧。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 靶向GPC3和YAP1 shRNA重组质粒的构建结果
构建的重组质粒GPC3-714-shRNA、GPC3-647-shRNA、GPC3-1718-shRNA、GPC3-2134-shRNA和YAP1-906-shRNA、YAP1-1363-shRNA、YAP1-1666-shRNA、YAP1-2895-shRNA送上海生物工程技术服务有限公司测序。测试结果证实重组质粒均构建成功。
2.2 靶向GPC3和YAP1 shRNA重组质粒的转染筛选
GPC3 shRNA的转染效率未转染组为0，空载体组为39.5%，GPC3-714-shRNA组为57.3%；GPC3-647-shRNA组为66.5%，GPC3-1718-shRNA组为87.9%，GPC3-2134-shRNA组为68.9%。YAP1 shRNA的转染效率未转染组为0，空载体组为59.7%，YAP1-906-shRNA组为61.4%，YAP1-1363-shRNA组为56.7%，YAP1-1666-shRNA组为89.4%，YAP1-2895-shRNA组为73.8%。
2.3 各组细胞中GPC3 mRNA和蛋白以及YAP1 mRNA和蛋白表达结果
2.3.1 GPC3
mRNA和蛋白表达 GPC3 shRNA各转染组GPC3 mRNA和蛋白表达均明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05），而GPC3-1718-shRNA组GPC3 mRNA和蛋白表达明显低于其他转染组（P＜0.05）。说明GPC3 shRNA可沉默GPC3 mRNA和蛋白表达，尤以GPC3-1718-shRNA沉默效果最好，用于后续实验。见表 2。
表2
各组细胞中GPC3 mRNA和GPC3蛋白表达结果（x±s）
2.3.2 YAP1
mRNA和蛋白表达 YAP1 shRNA各转染组YAP1 mRNA和蛋白表达均明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05），而YAP1-1666-shRNA组YAP1 mRNA和蛋白表达明显低于其他转染组（P＜0.05）。说明YAP1 shRNA可沉默YAP1 mRNA和蛋白表达，尤以YAP1-1666-shRNA沉默效果最好，用于后续实验。见表 3。
表3
各组细胞中YAP1 mRNA和YAP1蛋白表达结果（x±s）
2.4 GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控下各组细胞YAP1 mRNA和蛋白表达结果
GPC3-1718-shRNA组和YAP1-1666-shRNA组细胞YAP1 mRNA和蛋白表达明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05）。GPC3-1718-shRNA+rhYAP1组YAP1 mRNA和蛋白表达明显高于GPC3-1718-shRNA组（P＜0.05）和YAP1-1666-shRNA组（P＜0.05）。
说明rhYAP1可明显逆转由GPC3-1718-shRNA引起的YAP1表达下降（P＜0.05）。见表 4。
表4
GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控下YAP1 mRNA和YAP1蛋白表达结果（x±s）
2.5 GPC3及Hippo信号通路YAP1对Huh7细胞
生物学行为的影响将转染效率最高的GPC3-1718-shRNA通过脂质体转染导入人肝癌Huh7细胞，结果显示，与空载体组和未转染组比较，沉默GPC3可抑制Huh7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）并促进其凋亡（P＜0.05），而rhYAP1可明显抑制因沉默GPC3基因表达而引起的细胞凋亡（P＜0.05）并促进Huh7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）。将YAP1-1666-shRNA导入Huh7细胞，结果显示，在GPC3正常表达而单独沉默YAP1的情况下，也能够抑制Huh-7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）并促进其凋亡（P＜0.05）。说明GPC3很有可能通过对Hippo信号通路YAP1的调控实现其对Huh7细胞生物学行为的影响。见表 5。
表5
GPC3和YAP1对Huh7 细胞增殖、侵袭及凋亡的影响（x±s）
3 讨论
由于肝癌的恶性度高、预后差、死亡率高等特点，因此，早期诊断和治疗对延长肝癌患者生存时间、提高生活质量具有十分重要的意义[15]。
GPC3是细胞表面跨膜糖蛋白受体的一种，目前认为GPC3的硫酸乙酰肝素链与大量生物效应分子（如生长因子及其受体、细胞外基质蛋白、黏附分子等）相互作用，从而调节细胞增殖、分化、黏附、迁移等，还可能参与抑制或调节大部分中胚层组织和器官的生长[16-17]。大量研究[18-20]证实，正常肝细胞中未见GPC3表达，而肝癌细胞中出现GPC3高表达情况。我们之前的研究[11]发现，GPC3 mRNA在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达率分别为77.1% （37/48）、2.6% （1/39）和0 （0/31）；GPC3蛋白在直径≤5 cm的肝癌组织中的表达率为52.6% （10/19），而在直径＞5 cm的肝癌组织中表达率上升至86.2% （25/29）。因此，可推测GPC3与肝癌的发生、发展有关。
目前，国内外已有关于GPC3通过调控细胞信号传导通路促进肝癌发生、发展的报道。Capurro等[21]发现，GPC3可通过刺激经典的Wnt/β-Catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖，GPC3能够与Wnt结合形成复合物，通过Wnt与受体的作用来进行自身信息的表达，复合物产生的Wnt信号能够引起肝癌相关基因的表达，最后产生肿瘤。Midorikawa等[22]发现，GPC3能够与成纤维细胞生长因子-2相结合，从而达到抑制成纤维细胞生长因子-2促进肝癌的发生、发展。Cheng等[23]认为，GPC3能够通过胰岛素样生长因子2信号途径刺激肝癌组织生长。然而，有关GPC3与Hippo信号通路的作用和机制及其对肝癌细胞的影响，国内外鲜有报道。有关YAP1与肝癌之间的关系已得到证实。Huo等[24]发现，通过siRNA干扰YAP1表达可促进肝癌细胞凋亡。我们之前的研究[25]也显示，通过miR-132靶向抑制YAP表达可明显抑制肝癌细胞的生长。
因此我们提出假说，GPC3有可能通过Hippo通路YAP1对肝癌细胞的生长进行调控。为验证假说，本研究设计如下实验：首先，构建靶向GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，分别成功筛选出可有效沉默GPC3基因和YAP1基因的GPC3-1718-shRNA和YAP1-1666-shRNA质粒。然后将GPC3-1718-shRNA或YAP1-1666-shRNA转染导入Huh7细胞，发现肝癌细胞中GPC3 mRNA和蛋白表达均明显降低（P＜0.05），同时YAP1 mRNA和蛋白的表达也明显下降（P＜0.05），然而rhYAP1可明显抑制由GPC3沉默引起的YAP1 mRNA和蛋白表达的下降（P＜0.05）。最后，沉默GPC3可抑制Huh7细胞的增殖和侵袭并促进其凋亡（P＜0.05）；rhYAP1可明显抑制因沉默GPC3基因表达而引起的细胞凋亡（P＜0.05）；在GPC3正常表达，而单独沉默YAP1的情况下，也能够明显抑制Huh7细胞的增殖和侵袭（P＜0.05）。本实验结果提示，GPC3很有可能通过对Hippo信号通路YAP1的调控实现其对Huh7细胞生物学行为的影响。
由于恶性肿瘤的发生、发展通常伴随着细胞增殖和凋亡，并同时涉及多种细胞增殖、凋亡相关基因的异常表达。因此，对调控细胞增殖凋亡基因的深入研究，对揭示肿瘤发病机制及治疗方面均具有重要意义。
我国是肝细胞癌（以下简称肝癌）的发病人数约占全球肝癌总发病人数的55%以上，而死亡率高达45% [1]。因此，了解肝癌的发病机制对靶向治疗十分重要。肿瘤的形成是一个十分复杂的病理过程，通常伴随着细胞的增殖和凋亡，并同时涉及多种细胞增殖凋亡相关基因的异常表达[2-3]。磷脂酰肌醇蛋白多糖-3 （GPC3）是一种癌胚蛋白，可通过调控细胞信号传导通路促进肝癌的发生、发展[4-6]。Hippo信号通路是近年来新发现的一条细胞信号传导通路，对细胞增殖和凋亡平衡具有关键调节作用[7-8]。YAP1是Hippo信号通路的核心效应因子，在正常机体细胞内发挥信号传导和基因转录调节的作用，有关YAP1促进肝癌细胞增殖的作用已得到证实[9-10]。然而有关GPC3与Hippo信号通路的作用机制及其对肝癌细胞的影响，国内外鲜有报道。本研究通过RNA干扰技术构建GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，以脂质体转染的方式导入人肝癌细胞株Huh7，以观察GPC3和YAP1对人肝癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。
1 材料与方法
1.1 主要实验材料
人肝癌Huh7细胞株，中科院上海细胞库；DMEM高糖培养基，美国HyClone公司；胰蛋白酶，美国Invitrogen公司；胎牛血清（FBS），美国HyClone公司；T4 DNA连接酶，美国Ferments公司；Lipofecta-mine2000和Opti-MEM培养基，美国Invitrogen公司；质粒提取试剂盒，美国Qiagen公司；Trizol RNA提取试剂盒，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒，美国ABI Applied Biosystems公司；PCR试剂盒，日本TaKaRa公司；兔抗人GPC3、YAP1一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗以及ECL显色试剂盒，美国Santa Cruz公司；Cell-LightTM EdU荧光显微镜检测试剂盒，广州锐博生物科技有限公司；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒，德国Bender公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养传代
人肝癌Huh7细胞接种于DMEM高糖培养基（10% FBS、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素），37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。 85% 融合时，0.25%胰蛋白酶消化，传代。取对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2.2 靶向GPC3和YAP1
shRNA重组质粒的构建参照文献[11]，根据GPC3基因信息（GenBank，No.NM_001164617），委托上海生物工程技术服务有限公司合成4条与其他基因编码序列无同源性的shRNA序列。shRNA形成DNA后与pGPU6/gfp/Neo载体连接，构建重组质粒。重组质粒转化感受态DH5α大肠杆菌，提取质粒，委托上海生物工程技术服务有限公司测序鉴定。参照文献[12]，根据YAP1基因信息（GenBank，No. NM_006106.2），构建干扰YAP1表达的重组质粒并进行测序鉴定。见表 1。
表1
GPC3和YAP1 shRNA序列
1.2.3 靶向GPC3和YAP1
shRNA重组质粒的转染筛选 人肝癌Huh7细胞接种于6孔板后进行转染实验。A液：1 μg GPC3-shRNA用50 μL Opti-MEM稀释，静置10 min。B液：2 μL Lipofectamine2000用50 μL Opti-MEM稀释，静置10 min。混合A、B液，静置20 min。取出培养的Huh7细胞，弃去原培养液并用无血清培养液漂洗，再加入1 mL无血清培养液和A与B的混合液，孵育6 h。6 h后，弃去转染液，更换为完全培养基。培养72 h后，观察细胞转染情况。将转染效率最高的重组质粒用于后续实验。GPC3 shRNA重组质粒转染实验分为6组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ GPC3-714-shRNA组：转染GPC3-714-shRNA重组质粒；④ GPC3-647-shRNA组：转染GPC3-647-shRNA重组质粒；⑤ GPC3-1718-shRNA组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒；⑥ GPC3-2134-shRNA组：转染GPC3-2134-shRNA重组质粒。以相同方法进行YAP1 shRNA重组质粒转染实验，分为6组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接YAP1-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ YAP1-906-shRNA组：转染YAP1-906-shRNA重组质粒；④ YAP1-1363-shRNA组：转染YAP1-1363-shRNA重组质粒；⑤ YAP1-1666-shRNA组：转染YAP1-1666-shRNA重组质粒；⑥ YAP1-2895-shRNA组：转染YAP1-2895-shRNA重组质粒。
1.2.4 GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控
人肝癌Huh7细胞接种于6孔板后进行转染实验，分为5组：① 未转染组：细胞正常培养未进行转染；② 空载体组：转染未连接GPC3-shRNA的pGPU6/gfp/Neo空载体；③ GPC3-1718-shRNA组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒；④ GPC3-1718-shRNA+rhYAP1组：转染GPC3-1718-shRNA重组质粒，同时在细胞培养时加入了rhYAP1；⑤ YAP1-1666-shRNA组：转染YAP1-1666-shRNA重组质粒。转染72 h后，检测各组细胞中YAP1 mRNA和蛋白表达。
1.2.5 荧光定量PCR法检测GPC3
mRNA和YAP1 mRNA表达 Trizol 法提取总RNA，并逆转录成cDNA。参照文献[13-14]，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成GPC3和YAP1引物。GPC3上游引物为5ʹ-CGAGATAAGCACCTTTCACAACC-3ʹ，下游引物为5ʹ-AGAAGAAGCACACCACCGAGA-3ʹ；PCR条件：95℃ 预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸45 s，共40个循环。YAP1上游引物为5ʹ-AATGACGAC-CAATAGCTCAGATCC-3ʹ，下游引物为5ʹ-CACTGT-AGCTGCTCATGCTTAGTCC-3ʹ；PCR条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性 5 s，60 ℃退火延伸31 s，共40个循环。采用2-ΔΔCT法分析GPC3和YAP1 mRNA的相对表达量。
1.2.6 蛋白印迹法检测GPC3和YAP1蛋白表达
收集各组细胞，PBS淋洗后加入RIPA裂解液裂解，转移至离心管，15 000 r/min （r=5 cm），离心30 min，取上清于-20 ℃保存备用。50 μg等量总蛋白上样，经8% SDS-PAGE电泳分离，转至PVDF膜，TBST淋洗3次，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入GPC3一抗，4 ℃孵育过夜；TBST淋洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；TBST淋洗3次，DAB显色。同理，检测各组YAP1蛋白表达。
1.2.7 Edu细胞增殖检测
Huh7细胞接种于96孔板，孵育24 h后，每孔加入100 μL的EdU溶液（50 μmol/L）。孵育2 h后弃去培养基，PBS洗涤，每孔加入100 μL 的4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入2 mg/mL甘氨酸，振摇10 min后弃去溶液，PBS洗涤。每孔加入100 μL的1×Apollo®染色液，室温避光振摇30 min，弃去染色液，PBS洗涤。每孔加入100 μL的1×Hoechst 33342反应液，室温避光振摇30 min，弃去染色液，PBS洗涤。最后在荧光显微镜下观察增殖细胞染色情况。
1.2.8 Transwell检测细胞侵袭能力
Huh7细胞接种于自带基质胶的Transwell小室上室，下室加入DMEM高糖培养基（10% FBS、105 U/L青霉素、100mg/L链霉素），37 ℃，5% CO2孵育12 h，棉签擦去靠近基底膜内室的细胞，另一面细胞经10%甲醇固定，PBS洗涤，结晶紫染色，PBS洗涤，显微镜下观察细胞并记数。
1.2.9 流式细胞仪检测细胞凋亡
将Huh7细胞接种于6孔板培养，转染24 h后弃去培养基，以PBS淋洗，再用0.25%不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集细胞以2 000 r/min （r=5 cm），离心10 min，弃上清。按Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作用流式细胞仪检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计学软件分析所有数据。所有实验数据均取5次实验结果的平均值，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用One-Way ANOVO单因素方差分析，组内两两比较采用q检验，取双侧。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 靶向GPC3和YAP1 shRNA重组质粒的构建结果
构建的重组质粒GPC3-714-shRNA、GPC3-647-shRNA、GPC3-1718-shRNA、GPC3-2134-shRNA和YAP1-906-shRNA、YAP1-1363-shRNA、YAP1-1666-shRNA、YAP1-2895-shRNA送上海生物工程技术服务有限公司测序。测试结果证实重组质粒均构建成功。
2.2 靶向GPC3和YAP1 shRNA重组质粒的转染筛选
GPC3 shRNA的转染效率未转染组为0，空载体组为39.5%，GPC3-714-shRNA组为57.3%；GPC3-647-shRNA组为66.5%，GPC3-1718-shRNA组为87.9%，GPC3-2134-shRNA组为68.9%。YAP1 shRNA的转染效率未转染组为0，空载体组为59.7%，YAP1-906-shRNA组为61.4%，YAP1-1363-shRNA组为56.7%，YAP1-1666-shRNA组为89.4%，YAP1-2895-shRNA组为73.8%。
2.3 各组细胞中GPC3 mRNA和蛋白以及YAP1 mRNA和蛋白表达结果
2.3.1 GPC3
mRNA和蛋白表达 GPC3 shRNA各转染组GPC3 mRNA和蛋白表达均明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05），而GPC3-1718-shRNA组GPC3 mRNA和蛋白表达明显低于其他转染组（P＜0.05）。说明GPC3 shRNA可沉默GPC3 mRNA和蛋白表达，尤以GPC3-1718-shRNA沉默效果最好，用于后续实验。见表 2。
表2
各组细胞中GPC3 mRNA和GPC3蛋白表达结果（x±s）
2.3.2 YAP1
mRNA和蛋白表达 YAP1 shRNA各转染组YAP1 mRNA和蛋白表达均明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05），而YAP1-1666-shRNA组YAP1 mRNA和蛋白表达明显低于其他转染组（P＜0.05）。说明YAP1 shRNA可沉默YAP1 mRNA和蛋白表达，尤以YAP1-1666-shRNA沉默效果最好，用于后续实验。见表 3。
表3
各组细胞中YAP1 mRNA和YAP1蛋白表达结果（x±s）
2.4 GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控下各组细胞YAP1 mRNA和蛋白表达结果
GPC3-1718-shRNA组和YAP1-1666-shRNA组细胞YAP1 mRNA和蛋白表达明显低于未转染组（P＜0.05）和空载体组（P＜0.05）。GPC3-1718-shRNA+rhYAP1组YAP1 mRNA和蛋白表达明显高于GPC3-1718-shRNA组（P＜0.05）和YAP1-1666-shRNA组（P＜0.05）。
说明rhYAP1可明显逆转由GPC3-1718-shRNA引起的YAP1表达下降（P＜0.05）。见表 4。
表4
GPC3对Hippo信号通路YAP1的调控下YAP1 mRNA和YAP1蛋白表达结果（x±s）
2.5 GPC3及Hippo信号通路YAP1对Huh7细胞
生物学行为的影响将转染效率最高的GPC3-1718-shRNA通过脂质体转染导入人肝癌Huh7细胞，结果显示，与空载体组和未转染组比较，沉默GPC3可抑制Huh7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）并促进其凋亡（P＜0.05），而rhYAP1可明显抑制因沉默GPC3基因表达而引起的细胞凋亡（P＜0.05）并促进Huh7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）。将YAP1-1666-shRNA导入Huh7细胞，结果显示，在GPC3正常表达而单独沉默YAP1的情况下，也能够抑制Huh-7细胞的增殖（P＜0.05）和侵袭（P＜0.05）并促进其凋亡（P＜0.05）。说明GPC3很有可能通过对Hippo信号通路YAP1的调控实现其对Huh7细胞生物学行为的影响。见表 5。
表5
GPC3和YAP1对Huh7 细胞增殖、侵袭及凋亡的影响（x±s）
3 讨论
由于肝癌的恶性度高、预后差、死亡率高等特点，因此，早期诊断和治疗对延长肝癌患者生存时间、提高生活质量具有十分重要的意义[15]。
GPC3是细胞表面跨膜糖蛋白受体的一种，目前认为GPC3的硫酸乙酰肝素链与大量生物效应分子（如生长因子及其受体、细胞外基质蛋白、黏附分子等）相互作用，从而调节细胞增殖、分化、黏附、迁移等，还可能参与抑制或调节大部分中胚层组织和器官的生长[16-17]。大量研究[18-20]证实，正常肝细胞中未见GPC3表达，而肝癌细胞中出现GPC3高表达情况。我们之前的研究[11]发现，GPC3 mRNA在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达率分别为77.1% （37/48）、2.6% （1/39）和0 （0/31）；GPC3蛋白在直径≤5 cm的肝癌组织中的表达率为52.6% （10/19），而在直径＞5 cm的肝癌组织中表达率上升至86.2% （25/29）。因此，可推测GPC3与肝癌的发生、发展有关。
目前，国内外已有关于GPC3通过调控细胞信号传导通路促进肝癌发生、发展的报道。Capurro等[21]发现，GPC3可通过刺激经典的Wnt/β-Catenin信号通路促进肝癌细胞的增殖，GPC3能够与Wnt结合形成复合物，通过Wnt与受体的作用来进行自身信息的表达，复合物产生的Wnt信号能够引起肝癌相关基因的表达，最后产生肿瘤。Midorikawa等[22]发现，GPC3能够与成纤维细胞生长因子-2相结合，从而达到抑制成纤维细胞生长因子-2促进肝癌的发生、发展。Cheng等[23]认为，GPC3能够通过胰岛素样生长因子2信号途径刺激肝癌组织生长。然而，有关GPC3与Hippo信号通路的作用和机制及其对肝癌细胞的影响，国内外鲜有报道。有关YAP1与肝癌之间的关系已得到证实。Huo等[24]发现，通过siRNA干扰YAP1表达可促进肝癌细胞凋亡。我们之前的研究[25]也显示，通过miR-132靶向抑制YAP表达可明显抑制肝癌细胞的生长。
因此我们提出假说，GPC3有可能通过Hippo通路YAP1对肝癌细胞的生长进行调控。为验证假说，本研究设计如下实验：首先，构建靶向GPC3 shRNA和YAP1 shRNA，分别成功筛选出可有效沉默GPC3基因和YAP1基因的GPC3-1718-shRNA和YAP1-1666-shRNA质粒。然后将GPC3-1718-shRNA或YAP1-1666-shRNA转染导入Huh7细胞，发现肝癌细胞中GPC3 mRNA和蛋白表达均明显降低（P＜0.05），同时YAP1 mRNA和蛋白的表达也明显下降（P＜0.05），然而rhYAP1可明显抑制由GPC3沉默引起的YAP1 mRNA和蛋白表达的下降（P＜0.05）。最后，沉默GPC3可抑制Huh7细胞的增殖和侵袭并促进其凋亡（P＜0.05）；rhYAP1可明显抑制因沉默GPC3基因表达而引起的细胞凋亡（P＜0.05）；在GPC3正常表达，而单独沉默YAP1的情况下，也能够明显抑制Huh7细胞的增殖和侵袭（P＜0.05）。本实验结果提示，GPC3很有可能通过对Hippo信号通路YAP1的调控实现其对Huh7细胞生物学行为的影响。
由于恶性肿瘤的发生、发展通常伴随着细胞增殖和凋亡，并同时涉及多种细胞增殖、凋亡相关基因的异常表达。因此，对调控细胞增殖凋亡基因的深入研究，对揭示肿瘤发病机制及治疗方面均具有重要意义。
