引用本文： 刘磊, 姚柏宇, 田忠. 胰岛素样生长因子-Ⅰ在肥胖大鼠行Roux-en-Y胃旁路术后脂肪组织中的表达变化及其作用. 中国普外基础与临床杂志, 2016, 23(12): 1424-1431. doi: 10.7507/1007-9424.20160364 复制
肥胖是一个日益严重的全球公共卫生问题，它的发生往往伴随2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常血症、睡眠呼吸暂停、肿瘤等能严重影响人们生活质量的疾病，这些临床表现即是代谢综合征的特征性表现。因此，肥胖是一种营养代谢综合征，它是受遗传因素与环境因素共同影响的[1]。脂肪细胞的数量增加和体积增大是肥胖患者的主要病理学改变，随着体质量增加，许多炎症因子含量也从而增加，因此肥胖被认为是一种慢性炎症状态[2]。脂肪组织具有内分泌的功能，能分泌瘦素、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）、白细胞介素10（IL-10）等。IGF-Ⅰ也叫促生长因子（somatomedin C），是一种结构与胰岛素类似的多功能蛋白质，具有调节细胞生长和分化的作用。IGF-Ⅰ在细胞代谢中作用的研究[3-4]结果让我们将其与肥胖联系起来。本研究对肥胖的病理生理学过程中及胃旁路手术后IGF-Ⅰ含量的变化进行了检测，进一步探讨了胃旁路手术对肥胖SD大鼠脂肪含量的调控机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要材料及设备
实验动物：在肥胖动物模型的研究中人们发现，营养性肥胖大鼠的肥胖发生过程与人类代谢性肥胖过程最为接近[5]，因此本实验选择大鼠作为实验动物。SPF级SD雄性大鼠70只，5~6周龄，体质量180~200 g，购自北京华阜康科技股份有限公司（许可证号：SCXK京2014-0004）。
主要材料：兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（Abcam公司）；兔抗鼠GAPDH单克隆一抗和辣根过氧化物酶标记（HRP）-山羊抗兔二抗（Proteintech公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B（AKT）多克隆一抗及兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆一抗（Cell signaling公司）；人类IGF-Ⅰ基因过表达质粒及相应空pEX2载体、IGF-ⅠshRNA（沉默基因）及相应空pGPU6/GFP/Neo载体（GenePharma公司）；Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen公司）；Trizol试剂盒（Life Technologies Corporation公司）；BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime Institute of Biotechnology公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（BD Biosciences公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，C0009）；PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，Takara公司）。
设备：美国双杰电子分析天平秤（T2000，常熟市双杰测试仪器设备厂），倒置显微镜（CKX31，日本OLYMPUS公司），细胞恒温培养箱（BPH-9082，上海一恒科学仪器有限公司），Thermo scientific低温离心机（legend micro21R，赛默飞世尔科技有限公司），超声细胞粉碎机（VCX130，德国Dr. Hielscher公司），NanoDrop分光光度计（ND-100，美国Thermo公司），化学发光检测仪（A1600，美国通用电气公司）及流式细胞仪（FACScan，美国BD Biosciences公司）。
1.2 建立肥胖大鼠模型
实验大鼠的饲养过程遵照中国医科大学附属盛京医院动物管理条例。大鼠于SPF级饲养室以普通饲料饲养1周后称质量（W0），随机（随机数字表法）分为空白对照组10只（NC组）和高脂饮食组60只，采用记号笔于鼠尾部标记分组信息，按10只1组分别置于不同笼中饲养。正常对照组大鼠给予已测定能量值的特定配方维持饲料，饲料热量组成比为：脂肪10%、蛋白质22%及碳水化合物68%；高脂饮食组的60只大鼠所饲饮食为特定配方高脂饲料（D12451，购于北京华阜康公司），热量组成比为：脂肪45%（主要成分为饱和脂肪酸），蛋白质20%及碳水化合物35%。高脂饮食组大鼠给予特定饮食饲养6周后称质量（W1），再根据体质量增加情况进行排序（W1-W0），取体质量增加值在前1/3的20只大鼠入组进行实验，另再取1只大鼠取腹股沟脂肪组织，其余弃去不做深入研究。每周测定体质量，观察摄食量直至12周[6]。
1.3 动物分组
将20只大鼠随机（随机数字表法）分为胃旁路术组（GB组）10只和假手术组（SO组）10只，加上前述的NC组，本实验共设立3个组别。其中，GB组大鼠接受Roux-en-Y胃旁路术（RYGB），SO组大鼠接受假手术，NC组大鼠不接受任何手术。所有大鼠的手术均由同一术者完成。术前12 h开始禁食水。以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，备皮，将手术大鼠固定于操作台上，再以75%乙醇消毒腹部，施行手术。术中分别取RYGB组及SO组大鼠右侧腹股沟脂肪组织〔代表皮下脂肪组织（subcutaneous adipose tissue，SAT）〕和右侧附睾脂肪组织〔代表内脏脂肪组织（visceral adipose tissue，VAT）〕，各取0.5 g，分装入冻存管以液氮保存，以用于后续检测组织中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表达。RYGB组大鼠的具体手术方式：取上腹剑突下正中切口约3 cm长，逐层入腹，在保留胃底约20%处将胃底与胃体横断，以碘伏消毒断端后，两断端采用6-0无损伤线连续内翻缝合，在胃的上部建立1个胃小囊；再距Treitz韧带远端约15 cm处切断空肠，远端肠袢经结肠前上提，采用6-0无损伤线与胃小囊行端侧吻合，近端肠袢在距胃空肠吻合口远端约10 cm处和远端空肠行端侧吻合。吻合均采用全层间断缝合外加浆肌层缝合的方式。SO组大鼠的手术方式为：在胃前壁取-2 cm长的切口，再使用6-0无损伤线连续缝合；距Treitz韧带远端约15 cm处切断空肠后原位吻合，缝合方法及使用丝线同RYGB组。2组大鼠的手术尽量控制在相同时间内完成。吻合后以5×103 u/mL的庆大霉素溶液冲洗腹腔2次，再以2-0丝线逐层关腹。术后禁食48 h，禁水12 h，48 h后不限量进食高脂饲料。每天观察大鼠饮食活动直至术后12周。于术后12周末时采用股动脉放血法处死3组大鼠，处死大鼠后采用无菌方法取左侧腹股沟脂肪组织0.5 g和左侧附睾脂肪组织0.5 g，分装入冻存管以液氮保存，后续检测组织中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表达。
1.4 原代脂肪细胞（primary adipose cells，PAC）的提取和培养
PAC培养：实验中单独挑选1只实验组以外的肥胖大鼠取腹股沟脂肪组织，以保证在不影响实验组大鼠的前提下取到足够的SAT，将SAT以PBS（phosphate buffered saline）溶液漂洗3次，每次3~5 s，分离剔除肉眼可见的纤维及血管后，剪碎，采用酶消化法原代培养。采用含0.25%胰酶及胎牛血清白蛋白的混合物消化，每30 min摇匀1次，直至90 min。将消化混合液过滤，过滤液以1 500 r/min离心15 min（r=15 cm）后弃去上清，加入红细胞裂解液混匀后再室温放置10 min。用含5%胎牛血清的DMEM/F-12培养基于5% CO2恒温培养箱内培养，培养约1~2周，待细胞融合率达到80%、生长状态良好时收集PAC细胞进行转染实验。
1.5 质粒转染
将PAC细胞以2.5×104个/mL的密度接种于6孔板中，分为BC组、IGF-Ⅰ（+）空载体组、IGF-Ⅰ（+）组（即基因过表达组）、IGF-Ⅰ（-）空载体组及IGF-Ⅰ（-）组（即基因沉默组），每组设3个复孔。IGF-Ⅰ（+）空载体组及IGF-Ⅰ（+）组采用pEX2载体，IGF-Ⅰ（-）空载体组及IGF-Ⅰ（-）组采用pGPU6/GFP/Neo载体，BC组不加任何试剂。采用Lipofectamine 2000试剂进行质粒转染，操作根据说明书进行。转染48 h后进行细胞增殖与凋亡实验，以检测细胞增殖能力以及凋亡率，并检测AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表达水平。
此外，按前述操作将细胞分为4组：Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组、Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）、Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）及Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）组，转染载体类型、操作及复孔数量同上。Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组及Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）组于转染后24 h加入0.1 mmol/L Wortmannin（各孔加入20 μL），用于阻断细胞PI3K信号通路[7]。加入24 h后收样，检测AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表达水平。
1.6 细胞增殖与凋亡率检测
细胞增殖实验使用MTT法进行。细胞消化后用含5%胎牛血清的高糖培养基重悬，以3 000个/孔的密度接种于96孔板中。培养24 h后换液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL，pH=7.4）20 μL，随后入恒温培养箱培养0.5~4.0 h，弃上清培养液；每孔加150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），脱色摇床震荡10 min。以酶标仪检测5组细胞于490 nm处的吸光度值（optimal density，OD），每个复孔重复测量3次，取均值。细胞凋亡率检测采用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒，根据操作说明进行细胞收样及染色。收集细胞，采用流式细胞仪检测凋亡率，每个复孔重复测量3次，取均值。
1.7 RNA提取及实时荧光定量PCR
组织及细胞中RNA表达水平用实时荧光定量PCR法检测。采用Trizol法提取组织及细胞中的总RNA，RNA浓度和质量用NanoDrop分光光度计进行评价。IGF-Ⅰ及GAPDH引物序列见参考文献[8]。One Step SYBR® Primer ScriptTM RT-PCR Kit反应体系（20.0 μL体系）：2×One Step SYBR® RT-PCR Buffer Ⅲ 10.0 μL，TaKaRa EX Taq HS（5 U/μL）0.4 μL，Primer Script RT enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，总RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL。反应条件：42 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s变性；95 ℃ 3 s退火，60 ℃ 30 s延伸，共40个循环。以GAPDH为内参，IGF-ⅠmRNA的表达量用相对定量法（2-△△CT）计算。
1.8 蛋白提取及免疫印迹法
组织及细胞分别加入裂解液，以超声破碎细胞后（400 w，破5 s、停10 s），离心（17 000 r/min，r=20 cm，20 min），取上清，采用BCA蛋白检测试剂盒检测样品的蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸5 min。蛋白样经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶中电泳分离后，转印到聚偏二氟乙烯膜。将膜转移至含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tween-Tris-buffered saline）中封闭3 h。再将含有蛋白条带的聚偏二氟乙烯膜与一抗4 ℃孵育过夜。根据实验内容不同，一抗包括兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（1 : 1 000），内参蛋白兔抗鼠GAPDH单克隆一抗（1 : 5 000），PI3K（1 : 1 000）、p-PI3K（1 : 1 000）、AKT（1 : 1 000）及p-AKT（1 : 1 000）兔抗鼠多克隆一抗。再将蛋白膜与相应的HRP-共聚山羊抗兔二抗（1 : 5 000）孵育2 h，免疫复合物用ECL化学发光检测系统检测，以FluorChem 2.0软件计算得到积分灰度值（integrated density value，IDV），以目的蛋白条带和GAPDH IDV值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
1.9 统计学方法
采用SPSS 18.0软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，统计方法采用配对t检验或单因素方差分析（ANOVA）分析（两两比较采用LSD法）。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IGF-ⅠmRNA及其蛋白在脂肪组织中的表达
为了研究IGF-ⅠmRNA及其蛋白在肥胖大鼠手术前后及正常大鼠脂肪组织中的表达水平，笔者进行了实时荧光定量PCR及免疫印迹实验。由于NC组未接受任何处理，因此可认为其脂肪组织中IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达稳定、变化不大，因此也用于术前3组指标的比较。实时荧光定量PCR和免疫印迹实验结果表明，在SAT组织中，同NC组比较，GB术前组及SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较高（P < 0.01），SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平也较高（P < 0.01），但GB术后组的差异无统计学意义（mRNA：P=0.14；蛋白：P=0.89）；同GB术前组比较，GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较低（P < 0.01），而SO术前组和SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.61；蛋白：P=0.73）；GB术前组和SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77），但GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平较SO术后组均较低（P < 0.01）。在VAT组织中，5组大鼠的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.29；蛋白P=0.45）。见图 1-3。
图1
示IGF-ⅠmRNA在大鼠SAT和VAT中的表达结果。与NC组比较，*P < 0.01；与GB术后组比较，#P < 0.01 图 2 示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中表达的电泳结果 图 3 示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中的表达结果。与NC组比较，*P < 0.01；与GB术后组比较，#P < 0.01
2.2 细胞增殖与凋亡结果
MTT结果表明，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的OD值比较差异均无统计学意义（P=0.89，P=0.77）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的OD值较高、增殖能力升高（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的OD值较低、细胞增殖缓慢（P=0.04）。见图 4。
图4
示增殖实验结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 5 示凋亡实验结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 6 示流式细胞仪检查结果。6A：BC组；6B：IGF-Ⅰ（+）空载体组；6C：IGF-Ⅰ（+）组；6D：IGF-Ⅰ（-）空载体组；6E：IGF-Ⅰ（-）组
流式细胞仪检测结果示，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的细胞凋亡率比较差异均无统计学意义（P=0.48，P=62）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的细胞凋亡率较低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的细胞凋亡率较高（P=0.04）。见图 5和图 6。
2.3 IGF-Ⅰ对PI3K/AKT信号通路的影响
为了研究IGF-Ⅰ下游蛋白水平表达的变化，笔者进行了免疫印迹实验。因p-PI3K为PI3K的活化形式，而实验是要检验PI3K的活化程度，故最终以p-PI3K/PI3K的比值进行呈现，p-AKT及AKT同理。结果示：与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的p-PI3K/PI3K（P=0.65，P=0.72）和p-AKT/AKT（P=0.58，P=0.75）比值比较差异均无统计学意义；与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的p-PI3K/PI3K（P=0.03）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均升高；与IGF-Ⅰ（-）空载体组相比，IGF-Ⅰ（-）组的p-PI3K/PI3K（P=0.04）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均降低，提示IGF-Ⅰ过表达确实能激活PI3K/AKT信号通路。见图 7和图 8。
图7
示转染后5组细胞的p-AKT、AKT、p-PI3K及PI3K的电泳结果 图 8 示转染后5组细胞的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 9 示Wortmannin抑制实验中4组细胞的p-AKT和AKT的电泳结果 图 10 示Wortmannin抑制实验中4组细胞的p-AKT/AKT比值结果。与Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组相比，*P < 0.05，与Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组相比，#P < 0.05
由于Wortmannin为PI3K抑制剂，使用后内源性PI3K活化已被抑制，难以测出。为了明确本实验中IGF-Ⅰ能否激活PI3K/AKT信号通路，故笔者比较了p-AKT/AKT比值。结果示：与Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组比较，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组的p-AKT/AKT比值较高（P < 0.05）；与Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组比较，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）组的p-AKT/AKT比值较低（P < 0.05），见图 9和图 10。
3 讨论
3.1 手术对于病态性肥胖的作用
病态性肥胖是由环境、基因、内分泌等一系列因素引起的一种病理状态，指机体脂肪异常或过度沉积。21世纪后，病态性肥胖已经逐渐成为世界性健康和社会问题[9]。肥胖在人群中发病率的升高，将直接导致冠心病、高血压病、糖尿病，以及恶性肿瘤例如乳腺癌[10]、宫颈癌[11]、结直肠癌[12]等疾病的发病率增加，使人类健康水平受到严重影响[13]。
减重手术指通过外科技术改变胃肠道的解剖关系，以改变部分胃、肠激素水平，从而改善病态肥胖患者的全身症状如超重、高血压、高血糖、高血脂等症状的治疗方法[14]。目前手术治疗肥胖通常采用三种术式：RYGB、袖状胃手术以及胃束带手术，其中RYGB为目前减重及代谢外科的首选术式。该术式兼有限制性及吸收不良的作用，对病态性肥胖及2型糖尿病均有明显的治疗效果，是目前美国治疗肥胖症合并2型糖尿病的金标准[15-16]。本实验即采用该种术式，手术时首先在胃底约20%处将胃底与胃体横断，使近端形成1个胃小囊，再距Treitz韧带远端15 cm处切断空肠，再行胃肠吻合和肠肠吻合，从而改变了局部消化道的解剖结构，降低了胃排空速度，减少了小肠面积，限制其吸收能力。该种术式具有减重效果显著、稳定、持久等优点。减重手术是目前治疗病态性肥胖及其并发症的唯一有效手段。随着基础研究的深入，除了减重手术的限容和促吸收不良作用外，人们不断地发现参与调节机体代谢和能量平衡的内在因素，包括胃肠激素、胆汁酸、脂肪因子、肠道菌群和中枢神经系统[17-18]，这些都可能是减重手术改善代谢的潜在机理。寻找这些因素并探究它们的作用机理，对未来的临床工作有重大意义。
3.2 IGF-Ⅰ与肥胖及内分泌的关系
在造成病态性肥胖的诸多因素中，内分泌因素起着尤为重要的作用，逐渐成为代谢外科关注的焦点[19]。胰岛素样生长因子（IGF）是一类广泛分布于人体多种组织中的多肽，其结构和胰岛素类似[20]。肝细胞分泌了人体中的大部分IGF，其接受垂体分泌的生长激素（GH）的调控[21]。
IGF在促进机体的生长发育、组织细胞分化、组织损伤修复、营养物质代谢等方面均有着至关重要的作用[22]。IGF蛋白由两种多肽组成：IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ蛋白主要由肝脏产生。IGF-Ⅰ蛋白的结构和功能与胰岛素相似，可促进组织对葡萄糖的摄取，促进糖原异生，促进脂肪及蛋白质合成[23]。有研究[24]证实，IGF-Ⅰ蛋白可以通过作用于内源性脂肪干细胞或祖细胞来诱导脂肪细胞分化。将IGF-Ⅰ缓释微囊植入C57BL6小鼠腹股沟脂肪垫中，通过控制释放IGF-Ⅰ可以激活血管基质细胞的Axin2/PPARγ信号通路，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而影响参与脂肪细胞生成的CD31（-）/34（+）/146（-）细胞亚群，促进脂肪细胞再生[24]。除此之外，IGF-Ⅰ蛋白作为一种前脂肪细胞生长分化诱导因子，能够促进DNA复制和细胞重新进入细胞周期，进行有丝分裂及克隆扩增，进而促进转录因子级联反应和脂肪细胞基因的表达[25]。基于IGF-Ⅰ蛋白对于脂肪细胞富集的重要作用，笔者推测IGF-Ⅰ蛋白参与了肥胖的疾病进程，以及减重手术后的代谢改变。
3.3 IGF-Ⅰ参与减重手术后的代谢改变
在本实验中，笔者对肥胖SD大鼠模型施行了RYGB以提取腹股沟皮下脂肪及附睾脂肪，通过实时荧光定量PCR及免疫印迹实验检测IGF-Ⅰ mRNA及蛋白的表达水平。结果显示，在SAT组织中，同NC组比较，GB术前组、SO术前组及SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均升高（P < 0.01）；GB术前组和SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77）；GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较SO术后组降低（P < 0.01）；同GB术前组比较，GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白表达水平降低（P < 0.01），而SO术前组和SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05），提示IGF-Ⅰ参与了高脂饮食后皮下脂肪的囤积[26]，并且RYGB能够引起鼠皮下脂肪中IGF-Ⅰ的表达水平降低，这与之前文献[27]的结果基本符合。但究竟是肝脏合成IGF-Ⅰ增加并运输至皮下脂肪垫，还是皮下脂肪垫原位合成IGF-Ⅰ增加仍需进一步探究。
同时，笔者在细胞水平也进行了研究。在对过表达IGF-Ⅰ基因及IGF-Ⅰ基因沉默的细胞增殖能力的分析中发现，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的OD值比较差异均无统计学意义（P=0.89，P=0.77），排除了载体的脱靶效应；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的增殖能力升高，IGF-Ⅰ（-）组的细胞增殖缓慢。流式细胞仪检测结果表明，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的细胞凋亡率比较差异均无统计学意义（P=0.48，P=0.62）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的细胞凋亡率较低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的细胞凋亡率较高（P=0.04）。说明对于皮下脂肪来讲，IGF-Ⅰ能够促进脂肪细胞的增殖，同时抑制脂肪细胞凋亡。进一步研究发现，过表达IGF-Ⅰ能激活PI3K/AKT信号通路，触发促进细胞增殖、抑制凋亡的级联反应。减重手术通过降低皮下脂肪组织中IGF-Ⅰ的表达水平，达到抑制脂肪细胞囤积的效果，这也是减重术后皮下脂肪组织减少的原因之一。但减重手术下调IGF-Ⅰ表达的原因不尽清楚，可能是由于手术对下丘脑激素信号通路产生影响，从而影响下丘脑-垂体轴[28]，具体机制仍需进一步研究。
综上所述，IGF-Ⅰ的变化或许是减重手术后复杂广泛的代谢改变之一，但它仍为我们深入研究手术机制、以寻找更好的治疗方法提供了思路。
肥胖是一个日益严重的全球公共卫生问题，它的发生往往伴随2型糖尿病、心血管疾病、血脂异常血症、睡眠呼吸暂停、肿瘤等能严重影响人们生活质量的疾病，这些临床表现即是代谢综合征的特征性表现。因此，肥胖是一种营养代谢综合征，它是受遗传因素与环境因素共同影响的[1]。脂肪细胞的数量增加和体积增大是肥胖患者的主要病理学改变，随着体质量增加，许多炎症因子含量也从而增加，因此肥胖被认为是一种慢性炎症状态[2]。脂肪组织具有内分泌的功能，能分泌瘦素、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ）、白细胞介素10（IL-10）等。IGF-Ⅰ也叫促生长因子（somatomedin C），是一种结构与胰岛素类似的多功能蛋白质，具有调节细胞生长和分化的作用。IGF-Ⅰ在细胞代谢中作用的研究[3-4]结果让我们将其与肥胖联系起来。本研究对肥胖的病理生理学过程中及胃旁路手术后IGF-Ⅰ含量的变化进行了检测，进一步探讨了胃旁路手术对肥胖SD大鼠脂肪含量的调控机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物、主要材料及设备
实验动物：在肥胖动物模型的研究中人们发现，营养性肥胖大鼠的肥胖发生过程与人类代谢性肥胖过程最为接近[5]，因此本实验选择大鼠作为实验动物。SPF级SD雄性大鼠70只，5~6周龄，体质量180~200 g，购自北京华阜康科技股份有限公司（许可证号：SCXK京2014-0004）。
主要材料：兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（Abcam公司）；兔抗鼠GAPDH单克隆一抗和辣根过氧化物酶标记（HRP）-山羊抗兔二抗（Proteintech公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）多克隆一抗、兔抗鼠蛋白激酶B（AKT）多克隆一抗及兔抗鼠磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆一抗（Cell signaling公司）；人类IGF-Ⅰ基因过表达质粒及相应空pEX2载体、IGF-ⅠshRNA（沉默基因）及相应空pGPU6/GFP/Neo载体（GenePharma公司）；Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen公司）；Trizol试剂盒（Life Technologies Corporation公司）；BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime Institute of Biotechnology公司）；Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒（BD Biosciences公司）；四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，C0009）；PCR试剂盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ，Takara公司）。
设备：美国双杰电子分析天平秤（T2000，常熟市双杰测试仪器设备厂），倒置显微镜（CKX31，日本OLYMPUS公司），细胞恒温培养箱（BPH-9082，上海一恒科学仪器有限公司），Thermo scientific低温离心机（legend micro21R，赛默飞世尔科技有限公司），超声细胞粉碎机（VCX130，德国Dr. Hielscher公司），NanoDrop分光光度计（ND-100，美国Thermo公司），化学发光检测仪（A1600，美国通用电气公司）及流式细胞仪（FACScan，美国BD Biosciences公司）。
1.2 建立肥胖大鼠模型
实验大鼠的饲养过程遵照中国医科大学附属盛京医院动物管理条例。大鼠于SPF级饲养室以普通饲料饲养1周后称质量（W0），随机（随机数字表法）分为空白对照组10只（NC组）和高脂饮食组60只，采用记号笔于鼠尾部标记分组信息，按10只1组分别置于不同笼中饲养。正常对照组大鼠给予已测定能量值的特定配方维持饲料，饲料热量组成比为：脂肪10%、蛋白质22%及碳水化合物68%；高脂饮食组的60只大鼠所饲饮食为特定配方高脂饲料（D12451，购于北京华阜康公司），热量组成比为：脂肪45%（主要成分为饱和脂肪酸），蛋白质20%及碳水化合物35%。高脂饮食组大鼠给予特定饮食饲养6周后称质量（W1），再根据体质量增加情况进行排序（W1-W0），取体质量增加值在前1/3的20只大鼠入组进行实验，另再取1只大鼠取腹股沟脂肪组织，其余弃去不做深入研究。每周测定体质量，观察摄食量直至12周[6]。
1.3 动物分组
将20只大鼠随机（随机数字表法）分为胃旁路术组（GB组）10只和假手术组（SO组）10只，加上前述的NC组，本实验共设立3个组别。其中，GB组大鼠接受Roux-en-Y胃旁路术（RYGB），SO组大鼠接受假手术，NC组大鼠不接受任何手术。所有大鼠的手术均由同一术者完成。术前12 h开始禁食水。以10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，备皮，将手术大鼠固定于操作台上，再以75%乙醇消毒腹部，施行手术。术中分别取RYGB组及SO组大鼠右侧腹股沟脂肪组织〔代表皮下脂肪组织（subcutaneous adipose tissue，SAT）〕和右侧附睾脂肪组织〔代表内脏脂肪组织（visceral adipose tissue，VAT）〕，各取0.5 g，分装入冻存管以液氮保存，以用于后续检测组织中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表达。RYGB组大鼠的具体手术方式：取上腹剑突下正中切口约3 cm长，逐层入腹，在保留胃底约20%处将胃底与胃体横断，以碘伏消毒断端后，两断端采用6-0无损伤线连续内翻缝合，在胃的上部建立1个胃小囊；再距Treitz韧带远端约15 cm处切断空肠，远端肠袢经结肠前上提，采用6-0无损伤线与胃小囊行端侧吻合，近端肠袢在距胃空肠吻合口远端约10 cm处和远端空肠行端侧吻合。吻合均采用全层间断缝合外加浆肌层缝合的方式。SO组大鼠的手术方式为：在胃前壁取-2 cm长的切口，再使用6-0无损伤线连续缝合；距Treitz韧带远端约15 cm处切断空肠后原位吻合，缝合方法及使用丝线同RYGB组。2组大鼠的手术尽量控制在相同时间内完成。吻合后以5×103 u/mL的庆大霉素溶液冲洗腹腔2次，再以2-0丝线逐层关腹。术后禁食48 h，禁水12 h，48 h后不限量进食高脂饲料。每天观察大鼠饮食活动直至术后12周。于术后12周末时采用股动脉放血法处死3组大鼠，处死大鼠后采用无菌方法取左侧腹股沟脂肪组织0.5 g和左侧附睾脂肪组织0.5 g，分装入冻存管以液氮保存，后续检测组织中IGF-Ⅰ蛋白及其mRNA的表达。
1.4 原代脂肪细胞（primary adipose cells，PAC）的提取和培养
PAC培养：实验中单独挑选1只实验组以外的肥胖大鼠取腹股沟脂肪组织，以保证在不影响实验组大鼠的前提下取到足够的SAT，将SAT以PBS（phosphate buffered saline）溶液漂洗3次，每次3~5 s，分离剔除肉眼可见的纤维及血管后，剪碎，采用酶消化法原代培养。采用含0.25%胰酶及胎牛血清白蛋白的混合物消化，每30 min摇匀1次，直至90 min。将消化混合液过滤，过滤液以1 500 r/min离心15 min（r=15 cm）后弃去上清，加入红细胞裂解液混匀后再室温放置10 min。用含5%胎牛血清的DMEM/F-12培养基于5% CO2恒温培养箱内培养，培养约1~2周，待细胞融合率达到80%、生长状态良好时收集PAC细胞进行转染实验。
1.5 质粒转染
将PAC细胞以2.5×104个/mL的密度接种于6孔板中，分为BC组、IGF-Ⅰ（+）空载体组、IGF-Ⅰ（+）组（即基因过表达组）、IGF-Ⅰ（-）空载体组及IGF-Ⅰ（-）组（即基因沉默组），每组设3个复孔。IGF-Ⅰ（+）空载体组及IGF-Ⅰ（+）组采用pEX2载体，IGF-Ⅰ（-）空载体组及IGF-Ⅰ（-）组采用pGPU6/GFP/Neo载体，BC组不加任何试剂。采用Lipofectamine 2000试剂进行质粒转染，操作根据说明书进行。转染48 h后进行细胞增殖与凋亡实验，以检测细胞增殖能力以及凋亡率，并检测AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表达水平。
此外，按前述操作将细胞分为4组：Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组、Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）、Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）及Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）组，转染载体类型、操作及复孔数量同上。Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组及Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（-）组于转染后24 h加入0.1 mmol/L Wortmannin（各孔加入20 μL），用于阻断细胞PI3K信号通路[7]。加入24 h后收样，检测AKT、p-AKT、p-PI3K、PI3K及GAPDH的表达水平。
1.6 细胞增殖与凋亡率检测
细胞增殖实验使用MTT法进行。细胞消化后用含5%胎牛血清的高糖培养基重悬，以3 000个/孔的密度接种于96孔板中。培养24 h后换液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL，pH=7.4）20 μL，随后入恒温培养箱培养0.5~4.0 h，弃上清培养液；每孔加150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），脱色摇床震荡10 min。以酶标仪检测5组细胞于490 nm处的吸光度值（optimal density，OD），每个复孔重复测量3次，取均值。细胞凋亡率检测采用Annexin V-PE/7-AAD凋亡检测试剂盒，根据操作说明进行细胞收样及染色。收集细胞，采用流式细胞仪检测凋亡率，每个复孔重复测量3次，取均值。
1.7 RNA提取及实时荧光定量PCR
组织及细胞中RNA表达水平用实时荧光定量PCR法检测。采用Trizol法提取组织及细胞中的总RNA，RNA浓度和质量用NanoDrop分光光度计进行评价。IGF-Ⅰ及GAPDH引物序列见参考文献[8]。One Step SYBR® Primer ScriptTM RT-PCR Kit反应体系（20.0 μL体系）：2×One Step SYBR® RT-PCR Buffer Ⅲ 10.0 μL，TaKaRa EX Taq HS（5 U/μL）0.4 μL，Primer Script RT enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，PCR Forward Primer（10 μmol/L）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μmol/L）0.4 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，总RNA 2.0 μL，RNase Free dH2O 6.0 μL。反应条件：42 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s变性；95 ℃ 3 s退火，60 ℃ 30 s延伸，共40个循环。以GAPDH为内参，IGF-ⅠmRNA的表达量用相对定量法（2-△△CT）计算。
1.8 蛋白提取及免疫印迹法
组织及细胞分别加入裂解液，以超声破碎细胞后（400 w，破5 s、停10 s），离心（17 000 r/min，r=20 cm，20 min），取上清，采用BCA蛋白检测试剂盒检测样品的蛋白浓度，加入上样缓冲液煮沸5 min。蛋白样经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）胶中电泳分离后，转印到聚偏二氟乙烯膜。将膜转移至含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tween-Tris-buffered saline）中封闭3 h。再将含有蛋白条带的聚偏二氟乙烯膜与一抗4 ℃孵育过夜。根据实验内容不同，一抗包括兔抗鼠IGF-Ⅰ多克隆一抗（1 : 1 000），内参蛋白兔抗鼠GAPDH单克隆一抗（1 : 5 000），PI3K（1 : 1 000）、p-PI3K（1 : 1 000）、AKT（1 : 1 000）及p-AKT（1 : 1 000）兔抗鼠多克隆一抗。再将蛋白膜与相应的HRP-共聚山羊抗兔二抗（1 : 5 000）孵育2 h，免疫复合物用ECL化学发光检测系统检测，以FluorChem 2.0软件计算得到积分灰度值（integrated density value，IDV），以目的蛋白条带和GAPDH IDV值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
1.9 统计学方法
采用SPSS 18.0软件分析数据。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，统计方法采用配对t检验或单因素方差分析（ANOVA）分析（两两比较采用LSD法）。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 IGF-ⅠmRNA及其蛋白在脂肪组织中的表达
为了研究IGF-ⅠmRNA及其蛋白在肥胖大鼠手术前后及正常大鼠脂肪组织中的表达水平，笔者进行了实时荧光定量PCR及免疫印迹实验。由于NC组未接受任何处理，因此可认为其脂肪组织中IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达稳定、变化不大，因此也用于术前3组指标的比较。实时荧光定量PCR和免疫印迹实验结果表明，在SAT组织中，同NC组比较，GB术前组及SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较高（P < 0.01），SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平也较高（P < 0.01），但GB术后组的差异无统计学意义（mRNA：P=0.14；蛋白：P=0.89）；同GB术前组比较，GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较低（P < 0.01），而SO术前组和SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.61；蛋白：P=0.73）；GB术前组和SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77），但GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平较SO术后组均较低（P < 0.01）。在VAT组织中，5组大鼠的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.29；蛋白P=0.45）。见图 1-3。
图1
示IGF-ⅠmRNA在大鼠SAT和VAT中的表达结果。与NC组比较，*P < 0.01；与GB术后组比较，#P < 0.01 图 2 示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中表达的电泳结果 图 3 示IGF-Ⅰ蛋白在大鼠SAT和VAT中的表达结果。与NC组比较，*P < 0.01；与GB术后组比较，#P < 0.01
2.2 细胞增殖与凋亡结果
MTT结果表明，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的OD值比较差异均无统计学意义（P=0.89，P=0.77）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的OD值较高、增殖能力升高（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的OD值较低、细胞增殖缓慢（P=0.04）。见图 4。
图4
示增殖实验结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 5 示凋亡实验结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 6 示流式细胞仪检查结果。6A：BC组；6B：IGF-Ⅰ（+）空载体组；6C：IGF-Ⅰ（+）组；6D：IGF-Ⅰ（-）空载体组；6E：IGF-Ⅰ（-）组
流式细胞仪检测结果示，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的细胞凋亡率比较差异均无统计学意义（P=0.48，P=62）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的细胞凋亡率较低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的细胞凋亡率较高（P=0.04）。见图 5和图 6。
2.3 IGF-Ⅰ对PI3K/AKT信号通路的影响
为了研究IGF-Ⅰ下游蛋白水平表达的变化，笔者进行了免疫印迹实验。因p-PI3K为PI3K的活化形式，而实验是要检验PI3K的活化程度，故最终以p-PI3K/PI3K的比值进行呈现，p-AKT及AKT同理。结果示：与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的p-PI3K/PI3K（P=0.65，P=0.72）和p-AKT/AKT（P=0.58，P=0.75）比值比较差异均无统计学意义；与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的p-PI3K/PI3K（P=0.03）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均升高；与IGF-Ⅰ（-）空载体组相比，IGF-Ⅰ（-）组的p-PI3K/PI3K（P=0.04）和p-AKT/AKT（P=0.04）比值均降低，提示IGF-Ⅰ过表达确实能激活PI3K/AKT信号通路。见图 7和图 8。
图7
示转染后5组细胞的p-AKT、AKT、p-PI3K及PI3K的电泳结果 图 8 示转染后5组细胞的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值结果。与IGF-Ⅰ（+）空载体组比较，*P < 0.05；与IGF-Ⅰ（-）空载体组比较，#P < 0.05 图 9 示Wortmannin抑制实验中4组细胞的p-AKT和AKT的电泳结果 图 10 示Wortmannin抑制实验中4组细胞的p-AKT/AKT比值结果。与Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组相比，*P < 0.05，与Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组相比，#P < 0.05
由于Wortmannin为PI3K抑制剂，使用后内源性PI3K活化已被抑制，难以测出。为了明确本实验中IGF-Ⅰ能否激活PI3K/AKT信号通路，故笔者比较了p-AKT/AKT比值。结果示：与Wortmannin（+）IGF-Ⅰ（+）组比较，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组的p-AKT/AKT比值较高（P < 0.05）；与Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（+）组比较，Wortmannin（-）IGF-Ⅰ（-）组的p-AKT/AKT比值较低（P < 0.05），见图 9和图 10。
3 讨论
3.1 手术对于病态性肥胖的作用
病态性肥胖是由环境、基因、内分泌等一系列因素引起的一种病理状态，指机体脂肪异常或过度沉积。21世纪后，病态性肥胖已经逐渐成为世界性健康和社会问题[9]。肥胖在人群中发病率的升高，将直接导致冠心病、高血压病、糖尿病，以及恶性肿瘤例如乳腺癌[10]、宫颈癌[11]、结直肠癌[12]等疾病的发病率增加，使人类健康水平受到严重影响[13]。
减重手术指通过外科技术改变胃肠道的解剖关系，以改变部分胃、肠激素水平，从而改善病态肥胖患者的全身症状如超重、高血压、高血糖、高血脂等症状的治疗方法[14]。目前手术治疗肥胖通常采用三种术式：RYGB、袖状胃手术以及胃束带手术，其中RYGB为目前减重及代谢外科的首选术式。该术式兼有限制性及吸收不良的作用，对病态性肥胖及2型糖尿病均有明显的治疗效果，是目前美国治疗肥胖症合并2型糖尿病的金标准[15-16]。本实验即采用该种术式，手术时首先在胃底约20%处将胃底与胃体横断，使近端形成1个胃小囊，再距Treitz韧带远端15 cm处切断空肠，再行胃肠吻合和肠肠吻合，从而改变了局部消化道的解剖结构，降低了胃排空速度，减少了小肠面积，限制其吸收能力。该种术式具有减重效果显著、稳定、持久等优点。减重手术是目前治疗病态性肥胖及其并发症的唯一有效手段。随着基础研究的深入，除了减重手术的限容和促吸收不良作用外，人们不断地发现参与调节机体代谢和能量平衡的内在因素，包括胃肠激素、胆汁酸、脂肪因子、肠道菌群和中枢神经系统[17-18]，这些都可能是减重手术改善代谢的潜在机理。寻找这些因素并探究它们的作用机理，对未来的临床工作有重大意义。
3.2 IGF-Ⅰ与肥胖及内分泌的关系
在造成病态性肥胖的诸多因素中，内分泌因素起着尤为重要的作用，逐渐成为代谢外科关注的焦点[19]。胰岛素样生长因子（IGF）是一类广泛分布于人体多种组织中的多肽，其结构和胰岛素类似[20]。肝细胞分泌了人体中的大部分IGF，其接受垂体分泌的生长激素（GH）的调控[21]。
IGF在促进机体的生长发育、组织细胞分化、组织损伤修复、营养物质代谢等方面均有着至关重要的作用[22]。IGF蛋白由两种多肽组成：IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ蛋白主要由肝脏产生。IGF-Ⅰ蛋白的结构和功能与胰岛素相似，可促进组织对葡萄糖的摄取，促进糖原异生，促进脂肪及蛋白质合成[23]。有研究[24]证实，IGF-Ⅰ蛋白可以通过作用于内源性脂肪干细胞或祖细胞来诱导脂肪细胞分化。将IGF-Ⅰ缓释微囊植入C57BL6小鼠腹股沟脂肪垫中，通过控制释放IGF-Ⅰ可以激活血管基质细胞的Axin2/PPARγ信号通路，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，从而影响参与脂肪细胞生成的CD31（-）/34（+）/146（-）细胞亚群，促进脂肪细胞再生[24]。除此之外，IGF-Ⅰ蛋白作为一种前脂肪细胞生长分化诱导因子，能够促进DNA复制和细胞重新进入细胞周期，进行有丝分裂及克隆扩增，进而促进转录因子级联反应和脂肪细胞基因的表达[25]。基于IGF-Ⅰ蛋白对于脂肪细胞富集的重要作用，笔者推测IGF-Ⅰ蛋白参与了肥胖的疾病进程，以及减重手术后的代谢改变。
3.3 IGF-Ⅰ参与减重手术后的代谢改变
在本实验中，笔者对肥胖SD大鼠模型施行了RYGB以提取腹股沟皮下脂肪及附睾脂肪，通过实时荧光定量PCR及免疫印迹实验检测IGF-Ⅰ mRNA及蛋白的表达水平。结果显示，在SAT组织中，同NC组比较，GB术前组、SO术前组及SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均升高（P < 0.01）；GB术前组和SO术前组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（mRNA：P=0.86；蛋白：P=0.77）；GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平均较SO术后组降低（P < 0.01）；同GB术前组比较，GB术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白表达水平降低（P < 0.01），而SO术前组和SO术后组的IGF-ⅠmRNA及其蛋白的表达水平比较差异均无统计学意义（P > 0.05），提示IGF-Ⅰ参与了高脂饮食后皮下脂肪的囤积[26]，并且RYGB能够引起鼠皮下脂肪中IGF-Ⅰ的表达水平降低，这与之前文献[27]的结果基本符合。但究竟是肝脏合成IGF-Ⅰ增加并运输至皮下脂肪垫，还是皮下脂肪垫原位合成IGF-Ⅰ增加仍需进一步探究。
同时，笔者在细胞水平也进行了研究。在对过表达IGF-Ⅰ基因及IGF-Ⅰ基因沉默的细胞增殖能力的分析中发现，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的OD值比较差异均无统计学意义（P=0.89，P=0.77），排除了载体的脱靶效应；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的增殖能力升高，IGF-Ⅰ（-）组的细胞增殖缓慢。流式细胞仪检测结果表明，与BC组相比，IGF-Ⅰ（+）空载体组与IGF-Ⅰ（-）空载体组的细胞凋亡率比较差异均无统计学意义（P=0.48，P=0.62）；同对应的空载体组比较，IGF-Ⅰ（+）组的细胞凋亡率较低（P=0.04），IGF-Ⅰ（-）组的细胞凋亡率较高（P=0.04）。说明对于皮下脂肪来讲，IGF-Ⅰ能够促进脂肪细胞的增殖，同时抑制脂肪细胞凋亡。进一步研究发现，过表达IGF-Ⅰ能激活PI3K/AKT信号通路，触发促进细胞增殖、抑制凋亡的级联反应。减重手术通过降低皮下脂肪组织中IGF-Ⅰ的表达水平，达到抑制脂肪细胞囤积的效果，这也是减重术后皮下脂肪组织减少的原因之一。但减重手术下调IGF-Ⅰ表达的原因不尽清楚，可能是由于手术对下丘脑激素信号通路产生影响，从而影响下丘脑-垂体轴[28]，具体机制仍需进一步研究。
综上所述，IGF-Ⅰ的变化或许是减重手术后复杂广泛的代谢改变之一，但它仍为我们深入研究手术机制、以寻找更好的治疗方法提供了思路。
